密度梯度离心法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗
作者：鲁宏 窦志勇
单位：鲁宏(110005 沈阳市 辽宁省卫生防疫站)；窦志勇(110005 沈阳市 辽宁省卫生防疫站)
关键词：
中华预防医学杂志000218 我国因动物咬伤年需注射狂犬病疫苗500万人次以上，但我国现行的浓缩原代地鼠肾细胞狂
犬病疫苗，虽然免疫效果尚可，但接种者的局部及全身副反应率较高，甚至偶有死亡病例。为
此，我们对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行密度梯度离心法纯化研究。
一、 材料与方法
1.材料：用11～13 g健康金黄地鼠，无菌取肾，按常规方法用10 L 转瓶培养单层细胞，33℃、37℃培养，接种后4 d、7 d两次收获病毒液，即为粗制疫苗。使用北京aG株狂犬病毒株为
生产用毒株(中国药品生物制品检定所提供)。病毒毒力滴定、蛋白含量及效力试验测定均参照
文献[1]，小牛血清残留量的试剂盒购于中国药品生物制品检定所，方法按说明进行。
2.方法：0.45 μm微孔滤膜澄清过滤粗制疫苗，用超滤膜进行超滤浓缩，再用1/3 000～1/5 000的β-丙内酯灭活并待纯化。浓缩并灭活的的疫苗经8 000 r/min离心30 min，吸取上清。用
日本日立HITACHI SCP55H型超速离心机，RPZ35T区带离心转头进行蔗糖密度梯度离心，其梯度分
别为10%、20%、30%、40%、50%、60%，30 000 r/min离心6 h，用流动紫外检测仪280 nm波长检
测蛋白吸收峰。收集不同组分的分离液，并测定效力、蛋白含量及小牛血清残留量。
二、 结果与讨论
1.密度梯度区离心结果：取浓缩后样品180 ml，经40%蔗糖界面区带离心后，收取200 ml分
离液，检测蛋白峰。B峰分布在40～70组分中，A峰分布在1～39组分中。效力试验确定B峰为病毒
峰，A峰为杂蛋白峰。
2.分离液检测结果：由表1可见，提纯后样品病毒集中在B峰的44～62组分中，全部效力均大
于2.5 IU/ml，且小牛血清残留量<50 ng/ml，杂蛋白含量明显降低。说明使用本方法去除粗制疫
苗中杂蛋白物质可行，可以说蔗糖密度梯度离心法是纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗的方法之一。但
是由于密度梯度离心法设备投资巨大，操作步骤繁琐，工作时间较长，病毒收获率较低，并不是
最佳的纯化方法，有待研究其他方法。
表1 密度梯度离心结果 样品号
效力(IU/ml)
牛血清残留量(ng/ml)
蛋白含量(mg/ml)
浓缩前
3.40
<50
5.0
浓缩后
38.20
4 000
260.0
1～39
1.08
>50
130.0
40～43
1.45
<50
5.1
44～55
5.62
<50
4.6
56～58
10.85
<50
4.0
59～62
4.52
<50
3.1
63～70
0.00
<50
3.0
参考文献
1 李桂萱，陈起林，庄淑琴，等. 中国生物制品规程. 北京：中国人口出版社，1996. 121-125.
收稿日期：1999-10-21
, http://www.100md.com
单位：鲁宏(110005 沈阳市 辽宁省卫生防疫站)；窦志勇(110005 沈阳市 辽宁省卫生防疫站)
关键词：
中华预防医学杂志000218 我国因动物咬伤年需注射狂犬病疫苗500万人次以上，但我国现行的浓缩原代地鼠肾细胞狂
犬病疫苗，虽然免疫效果尚可，但接种者的局部及全身副反应率较高，甚至偶有死亡病例。为
此，我们对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行密度梯度离心法纯化研究。
一、 材料与方法
1.材料：用11～13 g健康金黄地鼠，无菌取肾，按常规方法用10 L 转瓶培养单层细胞，33℃、37℃培养，接种后4 d、7 d两次收获病毒液，即为粗制疫苗。使用北京aG株狂犬病毒株为
生产用毒株(中国药品生物制品检定所提供)。病毒毒力滴定、蛋白含量及效力试验测定均参照
文献[1]，小牛血清残留量的试剂盒购于中国药品生物制品检定所，方法按说明进行。
2.方法：0.45 μm微孔滤膜澄清过滤粗制疫苗，用超滤膜进行超滤浓缩，再用1/3 000～1/5 000的β-丙内酯灭活并待纯化。浓缩并灭活的的疫苗经8 000 r/min离心30 min，吸取上清。用
日本日立HITACHI SCP55H型超速离心机，RPZ35T区带离心转头进行蔗糖密度梯度离心，其梯度分
别为10%、20%、30%、40%、50%、60%，30 000 r/min离心6 h，用流动紫外检测仪280 nm波长检
测蛋白吸收峰。收集不同组分的分离液，并测定效力、蛋白含量及小牛血清残留量。
二、 结果与讨论
1.密度梯度区离心结果：取浓缩后样品180 ml，经40%蔗糖界面区带离心后，收取200 ml分
离液，检测蛋白峰。B峰分布在40～70组分中，A峰分布在1～39组分中。效力试验确定B峰为病毒
峰，A峰为杂蛋白峰。
2.分离液检测结果：由表1可见，提纯后样品病毒集中在B峰的44～62组分中，全部效力均大
于2.5 IU/ml，且小牛血清残留量<50 ng/ml，杂蛋白含量明显降低。说明使用本方法去除粗制疫
苗中杂蛋白物质可行，可以说蔗糖密度梯度离心法是纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗的方法之一。但
是由于密度梯度离心法设备投资巨大，操作步骤繁琐，工作时间较长，病毒收获率较低，并不是
最佳的纯化方法，有待研究其他方法。
表1 密度梯度离心结果 样品号
效力(IU/ml)
牛血清残留量(ng/ml)
蛋白含量(mg/ml)
浓缩前
3.40
<50
5.0
浓缩后
38.20
4 000
260.0
1～39
1.08
>50
130.0
40～43
1.45
<50
5.1
44～55
5.62
<50
4.6
56～58
10.85
<50
4.0
59～62
4.52
<50
3.1
63～70
0.00
<50
3.0
参考文献
1 李桂萱，陈起林，庄淑琴，等. 中国生物制品规程. 北京：中国人口出版社，1996. 121-125.
收稿日期：1999-10-21
, http://www.100md.com