瑞香狼毒水提物小鼠药物血清对人肝癌细胞增殖的影响
作者：樊俊杰 贾正平 谢景文 徐丽婷 孙卫胜
单位：樊俊杰(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；贾正平(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；谢景文(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；徐丽婷(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；孙卫胜(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：肝癌；瑞香狼毒；抗癌机理
西北国防医学杂志000203 摘要：目的：从整体水平探讨瑞香狼毒水提物(SCLA)的抗癌机理。方法：以不同剂量SCLA灌胃给药后，在不同时间采集小鼠血清，处理体外培养的人肝癌BEL-7402细胞，用MTT比色法和集落形成试验观察细胞增殖能力。结果：SCLA5、10、20 g.kg-1给药1、2、3 h后的药物血清处理肿瘤细胞后，其MTT转化率和克隆形成率均显著降低；给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用。结论：直接抑制癌细胞增殖是瑞香狼毒的主要抗癌机理。从整体水平探讨瑞香狼毒水提物(SCLA)的抗癌机理。方法：以不同剂量SCLA灌胃给药后，在不同时间采集小鼠血清，处理体外培养的人肝癌BEL-7402细胞，用MTT比色法和集落形成试验观察细胞增殖能力。结果：SCLA5、10、20 g.kg-1给药1、2、3 h后的药物血清处理肿瘤细胞后，其MTT转化率和克隆形成率均显著降低；给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用。结论：直接抑制癌细胞增殖是瑞香狼毒的主要抗癌机理。
, 百拇医药
中图分类号：R 730.5 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0090-02
Serum-pharmacological effects of Ruixiang Langdu (Stellera chamaejasme L.)abstract on proliferation of hepatoma cells
FAN Jun-jie,JIA Zheng-ping,XIE Jing-wen,et al.(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To explore the anticancer mechanism of Ruixiang Langdu(Stellera chamaejasme L.)abstract(SCLA).Methods:SCLA drug-serum was derived from mice which were orally preadministrated with different dose of SCLA at different time.The effects of the serum on the proliferation of human hepatoma BEL-7402 cells were observed with MTT assay and clone formation method.Results:After treatment with the drug-serum derived at 1,2,3 h from mice pretreated with SCLA(5,10, and 20 g.kg-1),the MTT conversion rate and clone formation of BEL-7402 cells were decreased significantly.The drug-serum from the mice after 2 h to treated with the SCLA was more effective than others.Conclusion:SCLA had a remarkable inhibitory effects on proliferation of human hepatoma cells,which might be the main anticancer mechanisms of SCLA.
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Key words:Liver carcinoma； Ruixiang Langdu; Anticancer mechanism
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科植物瑞香狼毒的根[1]。作者以往的研究结果表明，瑞香狼毒水提物(SCLA)对小鼠移植肿瘤S180肉瘤、HePS肝癌和Lewis肺癌生长有显著抑制作用[2]。为了从整体水平探讨其抗癌机理，本文采用血清药理方法，研究了SCLA对体外培养的肝癌BEL-7402细胞MTT转化率及集落形成的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物：Ba1b/c小鼠，体重18～22 g，SPF级，由兰州生物制品研究所实验动物中心提供。
1.2 SCLA的制备：将瑞香狼毒(兰州市药材供应站提供)200 g加水400 ml煮沸20 min2次，上清液混合后过滤、浓缩，制成口服液，每毫升含生药1.0 g。
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1.3 主要试剂：RPMI-1640培养基为Gibco产品。胰蛋白酶、MTT为Sigma产品。
1.4 细胞系：人肝癌细胞BEL-7402引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清、青霉素100 kU.L-1、链霉素100 mg.L-1，37℃、50%CO培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.5 药物血清制备：Ba1b/c小鼠56只，随机分成7组，禁食12 h后，分别灌胃给药，设SCLA5、10、20 g.kg-13个剂量组，对照组灌等量生理盐水；10 g.kg-1级设3个采血时相，即给药后1、2、3 h无菌条件下，麻醉后下腔静脉采血；其余给药组给药2 h后采血。血样1 000 g离心20 min取血清，56℃30 min灭活，用RPMI-1640 配制成10%的小鼠血清培养液。用含10%正常小鼠血清的RPMI-1640培养液为对照。
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1.6 集落形成试验[3]：将生长旺盛的EBL-7402细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成300 .ml-1的细胞悬液，接种于6孔培养板(5 ml/孔)预培养12 h后去除上清液，加入用不同剂量SCLA处理不同时间所制备的小鼠血清的RPMI-1640培养液，继续培养12 d取出，甲醇固定，Giemsa染色，解剖显微镜下计克隆数(30个细胞以上者为1克隆)，每组4皿，按均值据公式：克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100%，计算克隆形成率。
1.7 MTT比色法[4]：将生长旺盛的BEL-7402细胞用不同剂量SCLA处理不同时间所制备的小鼠血清的RPMI-1640培养液制成2×10.ml-1的细胞悬液，接种于96孔培养板(200 μl/孔)，37.0℃，饱和湿度培养48 h后，加入5 g.L-1MTT(10 μl/孔)，继续培养4 h后，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)，每孔200 μl，溶解MTT formazan,于酶标仪540 nm测定吸光度值(A)。细胞增殖抑制率(%)＝A对照-A药物/A对照×100。
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2 结果
2.1 不同剂量药物血清对人肝癌BEL-7402细胞的影响：SCLA5～20 g.kg-1处理小鼠2 h后的药物血清，对BEL-7402细胞集落形成及MTT formazan的产生均有显著抑制的作用，随着给药剂量的增加，药物血清的细胞增殖抑制作用增强(表1)
表1 不同剂量的SCLA药物血清对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响(n＝4，±s) 剂量
(g.kg-1)
集落数
A540
抑制率(%)
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MTT比色
集落形成
0
185±20
0.3310±0.0512
5
137±15*
0.2186±0.0427
25.9
40.0
10
84±11*
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0.1659±0.0304*
54.6
49.9
20
21±6*
0.0819±0.0311*
88.6
75.3
与对照组比较，P<0.01，小鼠给药2 h后取血
2.2 不同时相药物血清的作用：以10 g.kg-1处理小鼠不同时间的药物血清处理BEL-7402细胞发现，给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制效果，而1、3 h的血清抑制作用较弱(表2)。
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表2 不同处理时间的SCLA药物血清对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响(n＝4，±s) 处理时间
(h)
集落数
A540
抑制率(%)
MTT比色
集落形成
对照组
185±20
0.3310±0.0512
1
, 百拇医药
129±10*
0.1968±0.0336*
30.3
40.5
2
84±11*
0.1659±0.0304*
54.6
49.9
3
107±7*
, http://www.100md.com
0.2057±0.0412*
42.2
37.8
与对照组比较，P<0.01，小鼠给药剂量为10 g.kg-1
3 讨论
近年中草药治疗肿瘤越来越受到医药界的重视，它们不仅可改善患者生存质量，而且在延长患者生存期等方面也确有疗效[5，6]。然而中草药所含成份复杂，故其抗癌机理难以探讨清楚。由于人和动物属不同宿主，人肿瘤与动物肿瘤株也有差异，单一的小鼠体内实验难以确切阐明药物的抗癌效果与抗癌机理。有人借助中草药提取物直接实验，以探讨其抗癌作用机理，常以粗提物直接加于体外培养的人癌细胞，这就存在着两个难以解决的问题：①非生理环境的影响：中药粗制剂的杂质、电解质或鞣质引起细胞培养液渗透压、pH等的改变，影响细胞生存环境；②无效成分的作用：体内非吸收物质，或经体内代谢失活的物质，影响细胞生长。这些都会影响药物的实际效果。
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以整体动物灌胃给药，采集血清，作用于培养的人癌细胞，则可以克服以上诸多缺点，较好地反映中草药的药理作用机理。本研究结果表明，SCLA药物血清对人肝癌细胞增殖的抑制作用与药物剂量呈正相关，与我们所做的体内抑瘤实验结果一致。给药后2 h的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用，而给药后1、3 h血清抑制使用较弱，这可能与机体吸收和代谢造成血清中的药物浓度不同有关。瑞香狼毒对人肝瘤细胞增殖的抑制使用，可能是该药抗肝癌的重要机理之一。
基金项目：兰州军区医学科研计划项目(LXH94-6)
作者简介：樊俊杰(1954—)，男，硕士，主任医师
参考文献：
[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.1898-1900.
[2]樊俊杰，贾正平，谢景文，等.瑞香狼毒对小鼠移植肿瘤生长的影响[J].兰州医学院学报，1994，20(4)：228-230.
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[3]贾正平，王彦广，张培炎，等.4-[4″-(2″，2″，6″，6″-四甲基哌啶氮氧自由基)氨基]-4，-去甲表鬼臼毒素体外抗肿瘤作用[J].中国药理学报，1990，11(6)：549-553.
[4]贾正平，谢景文，谢廷泉.MTT快速比色法在肺癌化疗药物敏感性试验的研究[J].肿瘤防治研究，1993，20(4)：243-245.
[5]黎治平.原发性肝癌的中医及中西医结合治疗研究进展[J].实用癌症杂志，1995，10(4)：290-294.
[6]白 海，达万明.肿瘤细胞多药耐药及其逆转的研究[J].西北国防医学杂志，1998，19(2)：156-157.
收稿日期：1999-07-28, 百拇医药
单位：樊俊杰(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；贾正平(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；谢景文(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；徐丽婷(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；孙卫胜(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：肝癌；瑞香狼毒；抗癌机理
西北国防医学杂志000203 摘要：目的：从整体水平探讨瑞香狼毒水提物(SCLA)的抗癌机理。方法：以不同剂量SCLA灌胃给药后，在不同时间采集小鼠血清，处理体外培养的人肝癌BEL-7402细胞，用MTT比色法和集落形成试验观察细胞增殖能力。结果：SCLA5、10、20 g.kg-1给药1、2、3 h后的药物血清处理肿瘤细胞后，其MTT转化率和克隆形成率均显著降低；给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用。结论：直接抑制癌细胞增殖是瑞香狼毒的主要抗癌机理。从整体水平探讨瑞香狼毒水提物(SCLA)的抗癌机理。方法：以不同剂量SCLA灌胃给药后，在不同时间采集小鼠血清，处理体外培养的人肝癌BEL-7402细胞，用MTT比色法和集落形成试验观察细胞增殖能力。结果：SCLA5、10、20 g.kg-1给药1、2、3 h后的药物血清处理肿瘤细胞后，其MTT转化率和克隆形成率均显著降低；给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用。结论：直接抑制癌细胞增殖是瑞香狼毒的主要抗癌机理。
, 百拇医药
中图分类号：R 730.5 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0090-02
Serum-pharmacological effects of Ruixiang Langdu (Stellera chamaejasme L.)abstract on proliferation of hepatoma cells
FAN Jun-jie,JIA Zheng-ping,XIE Jing-wen,et al.(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To explore the anticancer mechanism of Ruixiang Langdu(Stellera chamaejasme L.)abstract(SCLA).Methods:SCLA drug-serum was derived from mice which were orally preadministrated with different dose of SCLA at different time.The effects of the serum on the proliferation of human hepatoma BEL-7402 cells were observed with MTT assay and clone formation method.Results:After treatment with the drug-serum derived at 1,2,3 h from mice pretreated with SCLA(5,10, and 20 g.kg-1),the MTT conversion rate and clone formation of BEL-7402 cells were decreased significantly.The drug-serum from the mice after 2 h to treated with the SCLA was more effective than others.Conclusion:SCLA had a remarkable inhibitory effects on proliferation of human hepatoma cells,which might be the main anticancer mechanisms of SCLA.
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Key words:Liver carcinoma； Ruixiang Langdu; Anticancer mechanism
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科植物瑞香狼毒的根[1]。作者以往的研究结果表明，瑞香狼毒水提物(SCLA)对小鼠移植肿瘤S180肉瘤、HePS肝癌和Lewis肺癌生长有显著抑制作用[2]。为了从整体水平探讨其抗癌机理，本文采用血清药理方法，研究了SCLA对体外培养的肝癌BEL-7402细胞MTT转化率及集落形成的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物：Ba1b/c小鼠，体重18～22 g，SPF级，由兰州生物制品研究所实验动物中心提供。
1.2 SCLA的制备：将瑞香狼毒(兰州市药材供应站提供)200 g加水400 ml煮沸20 min2次，上清液混合后过滤、浓缩，制成口服液，每毫升含生药1.0 g。
, http://www.100md.com
1.3 主要试剂：RPMI-1640培养基为Gibco产品。胰蛋白酶、MTT为Sigma产品。
1.4 细胞系：人肝癌细胞BEL-7402引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清、青霉素100 kU.L-1、链霉素100 mg.L-1，37℃、50%CO培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.5 药物血清制备：Ba1b/c小鼠56只，随机分成7组，禁食12 h后，分别灌胃给药，设SCLA5、10、20 g.kg-13个剂量组，对照组灌等量生理盐水；10 g.kg-1级设3个采血时相，即给药后1、2、3 h无菌条件下，麻醉后下腔静脉采血；其余给药组给药2 h后采血。血样1 000 g离心20 min取血清，56℃30 min灭活，用RPMI-1640 配制成10%的小鼠血清培养液。用含10%正常小鼠血清的RPMI-1640培养液为对照。
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1.6 集落形成试验[3]：将生长旺盛的EBL-7402细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成300 .ml-1的细胞悬液，接种于6孔培养板(5 ml/孔)预培养12 h后去除上清液，加入用不同剂量SCLA处理不同时间所制备的小鼠血清的RPMI-1640培养液，继续培养12 d取出，甲醇固定，Giemsa染色，解剖显微镜下计克隆数(30个细胞以上者为1克隆)，每组4皿，按均值据公式：克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100%，计算克隆形成率。
1.7 MTT比色法[4]：将生长旺盛的BEL-7402细胞用不同剂量SCLA处理不同时间所制备的小鼠血清的RPMI-1640培养液制成2×10.ml-1的细胞悬液，接种于96孔培养板(200 μl/孔)，37.0℃，饱和湿度培养48 h后，加入5 g.L-1MTT(10 μl/孔)，继续培养4 h后，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)，每孔200 μl，溶解MTT formazan,于酶标仪540 nm测定吸光度值(A)。细胞增殖抑制率(%)＝A对照-A药物/A对照×100。
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2 结果
2.1 不同剂量药物血清对人肝癌BEL-7402细胞的影响：SCLA5～20 g.kg-1处理小鼠2 h后的药物血清，对BEL-7402细胞集落形成及MTT formazan的产生均有显著抑制的作用，随着给药剂量的增加，药物血清的细胞增殖抑制作用增强(表1)
表1 不同剂量的SCLA药物血清对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响(n＝4，±s) 剂量
(g.kg-1)
集落数
A540
抑制率(%)
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MTT比色
集落形成
0
185±20
0.3310±0.0512
5
137±15*
0.2186±0.0427
25.9
40.0
10
84±11*
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0.1659±0.0304*
54.6
49.9
20
21±6*
0.0819±0.0311*
88.6
75.3
与对照组比较，P<0.01，小鼠给药2 h后取血
2.2 不同时相药物血清的作用：以10 g.kg-1处理小鼠不同时间的药物血清处理BEL-7402细胞发现，给药2 h后的药物血清表现出更强的抑制效果，而1、3 h的血清抑制作用较弱(表2)。
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表2 不同处理时间的SCLA药物血清对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响(n＝4，±s) 处理时间
(h)
集落数
A540
抑制率(%)
MTT比色
集落形成
对照组
185±20
0.3310±0.0512
1
, 百拇医药
129±10*
0.1968±0.0336*
30.3
40.5
2
84±11*
0.1659±0.0304*
54.6
49.9
3
107±7*
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0.2057±0.0412*
42.2
37.8
与对照组比较，P<0.01，小鼠给药剂量为10 g.kg-1
3 讨论
近年中草药治疗肿瘤越来越受到医药界的重视，它们不仅可改善患者生存质量，而且在延长患者生存期等方面也确有疗效[5，6]。然而中草药所含成份复杂，故其抗癌机理难以探讨清楚。由于人和动物属不同宿主，人肿瘤与动物肿瘤株也有差异，单一的小鼠体内实验难以确切阐明药物的抗癌效果与抗癌机理。有人借助中草药提取物直接实验，以探讨其抗癌作用机理，常以粗提物直接加于体外培养的人癌细胞，这就存在着两个难以解决的问题：①非生理环境的影响：中药粗制剂的杂质、电解质或鞣质引起细胞培养液渗透压、pH等的改变，影响细胞生存环境；②无效成分的作用：体内非吸收物质，或经体内代谢失活的物质，影响细胞生长。这些都会影响药物的实际效果。
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以整体动物灌胃给药，采集血清，作用于培养的人癌细胞，则可以克服以上诸多缺点，较好地反映中草药的药理作用机理。本研究结果表明，SCLA药物血清对人肝癌细胞增殖的抑制作用与药物剂量呈正相关，与我们所做的体内抑瘤实验结果一致。给药后2 h的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用，而给药后1、3 h血清抑制使用较弱，这可能与机体吸收和代谢造成血清中的药物浓度不同有关。瑞香狼毒对人肝瘤细胞增殖的抑制使用，可能是该药抗肝癌的重要机理之一。
基金项目：兰州军区医学科研计划项目(LXH94-6)
作者简介：樊俊杰(1954—)，男，硕士，主任医师
参考文献：
[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.1898-1900.
[2]樊俊杰，贾正平，谢景文，等.瑞香狼毒对小鼠移植肿瘤生长的影响[J].兰州医学院学报，1994，20(4)：228-230.
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[3]贾正平，王彦广，张培炎，等.4-[4″-(2″，2″，6″，6″-四甲基哌啶氮氧自由基)氨基]-4，-去甲表鬼臼毒素体外抗肿瘤作用[J].中国药理学报，1990，11(6)：549-553.
[4]贾正平，谢景文，谢廷泉.MTT快速比色法在肺癌化疗药物敏感性试验的研究[J].肿瘤防治研究，1993，20(4)：243-245.
[5]黎治平.原发性肝癌的中医及中西医结合治疗研究进展[J].实用癌症杂志，1995，10(4)：290-294.
[6]白 海，达万明.肿瘤细胞多药耐药及其逆转的研究[J].西北国防医学杂志，1998，19(2)：156-157.
收稿日期：1999-07-28, 百拇医药
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