慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞的反应
作者：刘之荣 卞晓红 李露斯
单位：刘之荣(兰州军区兰州总医院,甘肃 兰州 730050)；卞晓红(兰州军区兰州总医院,甘肃 兰州 730050)；李露斯(第三军医大学西南医院)
关键词：慢性脑灌注不足；小胶质细胞；脑损害；环孢霉素A
西北国防医学杂志000202 摘要：目的：探讨小胶质细胞在慢性脑灌注不足脑损害中的作用。方法：70只老龄大鼠持久性双侧颈总动脉结扎(2VO)，其中12只接受环孢霉素A(CsA)胃灌治疗。免疫组化法单抗OX18、OX6标记小胶质细胞。实验研究为持久性2VO 1～4月。结果：持久性2VO 1月皮层、海马和白质处均有明显的小胶质细胞活动。1～4月，皮层和白质处小胶质细胞的活动增多，而海马处小胶质细胞的活动则减少，同时脑损害加重。CsA治疗后小胶质细胞的活动明显减少，脑损害明显减轻。结论：小胶质细胞的活动在大鼠慢性脑灌注不足脑损害，特别是大脑白质损害中起重要作用，CsA可抑制大鼠慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞的活动, 从而减轻了脑损害。
, 百拇医药
中图分类号：R 743 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0087-03
Reaction of microglia on brain after chronic cerebral hypoperfusion in aged rats
LIU Zhi-rong, BIAN Xiao-hong，LI Lu-si. (Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, PLA,730050)
Abstact:Objective：To investigate the effects of the activation of microglia on the brain damages after chronic cerebral hypoperfusion.Methods：Both common carotid arteries were ligated bilaterally in 70 Wistar rats. Twelve of them were filled cyclosporin A. Microglia were observed with immunohistochemistry for MHCⅠand MHCⅡantigens. The activation of microglia and brain damages were investigated from 1 to 4 months after the ligation.Results：There was an extensive activation of microglia in the cortex, hippocampus and white matter after chronic cerebral hypoperfusion. From 1 to 4 months, the activation of microglia increased in cortex and white matter,but reduced in hippocampus. Meanwhile, the brain damages have become heavier from 1 to 4 months. In cyclosporin Atreated rats, the activation of microglia were significantly reduced, the brain damages were muchless intense.Conclusion：The activation of microglia may play an important role in the pathogenesis of brain damages, especially in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion. Cyclosporin A can suppressed the activation of microglia and reduce brain damages after chronic cerebral hypoperfusion.
, 百拇医药
Key words：Chronic cerebral hypoperfusion； Microglia; Brain damage； CsA
小胶质细胞是脑内主要的免疫效应细胞, 脑缺血损伤后迅速被活化，发生瀑布效应，在缺血性脑损害的病理机制中发挥免疫调节、组织修复和细胞损伤的“双刃”作用[1]。在小胶质细胞活化早期适当抑制它的活化反应，能减少不必要的细胞毒作用和病理损害[2]。目前这方面的研究多集中在急性脑缺血效应上，对可导致多发性脑梗死和老年性痴呆的慢性脑灌注不足的研究鲜有报道。
本实验通过老龄大鼠持久性2VO之慢性脑灌注不足模型，研究小胶质细胞的活动和规律，组织学改变以及应用CsA抑制小胶质细胞活动的效用，探讨小胶质细胞的活动对慢性脑灌注不足脑损害的影响和可能机制。
1 材料与方法
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1.1 动物模型与分组:70只老龄(月龄≥12个月)Wistar大鼠，雌雄不分，体重300～450 g。大鼠随机分成假手术对照组，持久性2vo 1、2、3、4 月组和治疗组，每组 3～10 只大鼠。参照Wakita等[2]制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。用20%乌拉坦按800～1 000 mg.kg-1腹腔注射麻醉，保证术中有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，术中大鼠肛温保持在36.5～37.5 ℃，术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养，每天供足食、水。治疗组动物采用CsA胃灌(10mg.kg-1)[2]术前1天、术前各1次，术后1周1.d-1，术后2周1.2 d-1,术后3周1.3 d-1，至2月入组。假手术组动物仅行颈前切开,不结扎颈总动脉。
, 百拇医药
1.2 标本制作与病理检查:取持久性2vo 1、2、3、4月组, 治疗组和正常对照组大鼠各3只，20%乌拉坦腹腔深麻醉，生理盐水250 ml 经左心室灌注去除血管内血细胞，后用4℃4%多聚甲醛200 ml灌注固定后分离出大脑，切去脑干、小脑和嗅脑，正中冠状切开，置入 4%多聚甲醛(4℃)中放置10～12 h，再入10%庶糖溶液浸泡至沉底后，-20℃连续冰冻冠状切片，片厚约20 μm。切片放入0.01 mol*L-1PBS液中 4℃保存备用。组织学观察取正常对照组，缺血 2、4月组和治疗组大鼠各4只，同样步骤至4%多聚甲醛后固定48～72 h后行石蜡包埋，石蜡切片，片厚约 5 mm，经贴片、脱蜡处理、HE染色、封片存放备用。
1.3 免疫组化试验和小胶质细胞的计数:冰冻切片入 3%H2O2浸泡15 min去除内源性过氧化物酶活性, 0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×2次后，入10%正常山羊血清封闭室温孵育10 min。切片分别与单抗OX18(1:100)抗MHCⅠ抗原和单抗OX6(1:100)抗MHCⅡ抗原, 37℃孵育 1 h并4℃过夜，0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×3次，切片入生物素标记的二抗(普通型SP试剂盒，1:100)37 ℃孵育30 min，0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×3次。接着切片再与辣根过氧化物酶标记的卵白素三抗(普通型SP试剂盒，1:100)37℃孵育30 min，切片继续0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5min×3次。最后切片经DAB试剂显色，显色的切片经表片、风干、脱水及透明后封片存用。采用图象分析仪计数小胶质细胞。
, 百拇医药
1.4 统计学处理:采用SPLM软件处理。所得的数据以
±s表示， 作同部位各组之间及组内不同部位之间方差分析。
2 结果
2.1 实验动物死亡率: 70只大鼠用于实验，持久性2VO后死亡26只，死亡率为37.1%。
2.2 小胶质细胞免疫组化实验分析: 手术组未发现OX18、OX6单抗标记的小胶质细胞。缺血1月后皮层、海马、胼胝体和内囊处均可见OX18、OX6 标记的小胶质细胞活动，以皮层最显著(图1)，其次是海马，再次是胼胝体和内囊，形态多呈高分枝状，部分呈阿米巴状、圆状和杆状，经统计学处理有显著差异(见表1及图8)。在梗死区，小胶质细胞高度聚集，形态多异，以阿米巴状、 圆状为主，梗死区周边见高分枝状小胶质细胞聚集(图2)。缺血 1～4月，皮层、胼胝体和内囊处小胶质细胞的活动增多(图3)，而海马处小胶质细胞的活动则减少，经统计学处理差异显著(见表1及图1)。CsA治疗后皮层、胼胝体、内囊和海马处小胶质细胞的活动明显减少(图4)，统计学处理差异非常显著(见表1及图8)。
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表1 慢性脑灌注不足后脑内小胶质细胞的活动
CCH1
CCH2
CCH3
CCH4
治疗
C(n=12)
969±16b
984±9ab
1022±18ab
1142±29ab
, 百拇医药
171±18a
H(n=12)
690±14b
514±9b
418±11ab
404±6ab
71±6a
CC(n=12)
340±8b
371±8ab
, 百拇医药
394±5ab
427±6ab
31±3a
IC(n=12)
248±5b
294±7b
311±8ab
369±7ab
34±5a
注：a:P<0.01 与CCH1月比较 b:P<0.01 与治疗组比较
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CCH:慢性脑灌注不足 C:皮层 H:海马 CC:胼胝体 IC:内囊
图1 慢性脑灌注不足1月，皮层小胶质细胞的活动
(免疫组化染色，20×10)
图2 慢性脑灌注不足1月，皮层死区周边小胶质细胞明显集聚
(免疫组化染色，20×10)
图3 慢性脑灌注不足4月，皮层小胶质细胞的活动明显增多
, 百拇医药 (免疫组化染色，20×10)
图4 CsA治疗后,皮层小胶质细胞的活动明显减少
(免疫组化染色，20×10)
2.3 病理检查分析:假手术组未发现明显的病理改变。缺血 2 月后皮层下、内囊区及海马区白质出现较大的软化灶，伴有胶质细胞和小血管增生(图5)。灰质内见单个或多个神经元缺血性改变，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕(图6)。缺血 4 月后， 皮层和白质处梗死发生率无明显变化，但皮层和海马处神经元固缩退变更为明显。同时，出现胶质增生小结，并出现噬神经细胞现象。CsA治疗后皮层内偶见小软化灶(图7)；散在小胶质细胞结节，其它无明显病变。
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图5 慢性脑灌注不足2月，白质内见大软化灶
(HE染色，20×10)
图6 慢性脑灌注不足2月，皮层内神经元缺血性改变，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕
(HE染色，20×10)
图7 CsA治疗后，皮层内偶见的小软化灶
(HE染色，20×10)
图8 慢性脑灌注不足后脑内小胶质细胞的变化
, 百拇医药
3 讨论
正常状态下脑内小胶质细胞处于静止或休眠状态，极少有单核吞噬细胞抗原及MHC抗原表达，且胞浆内无吞噬体，无非特异酯酶活性，不具备吞噬细胞的功能, 而单核吞噬细胞又被阻隔于血脑屏障之外，这使得正常状态下脑内免疫处于低水平，脑组织免受免疫介导的损伤[3]。脑缺血损伤后小胶质细胞可快速活化，发生形态、功能和免疫显型的改变，恢复呼吸爆发功能，产生免疫应答反应[4]。在本实验里，缺血区出现不同形态的小胶质细胞，有圆状、阿米巴状、杆状和高分枝状，圆状、阿米巴状及杆状小胶质细胞主要分布在梗死区，且在梗死区半暗带集聚，而高分枝状小胶质细胞则散在分布在广大无梗死的区域，包括皮层、白质和海马，并在梗死区周围密集，提示小胶质细胞的形态可反映出慢性脑灌注不足脑损害的部位及严重性。研究显示[5]，圆状、阿米巴状及杆状小胶质细胞代表完全活化的小胶质细胞，高分枝状小胶质细胞则代表部分活化的小胶质细胞，因此本实验结果也提示小胶质细胞活化的程度与慢性脑灌注不足脑损害的严重性相平行。在本实验里，缺血 1～4 月，皮层和白质区小胶质细胞数量渐增多，尤其是在梗死区明显，而海马区小胶质细胞数量则下降，提示慢性脑灌注不足缺血性脑损害1～4 月是渐进发展的，且主要表现为皮层和白质的损害，小胶质细胞的活动贯穿于整个慢性病理过程。从超微结构上看，小胶质细胞转化为吞噬细胞可以清除坏死的神经元，同时保护坏死神经元周围可存活神经元的完整性；从功能上看，活化的小胶质细胞通过释放氧自由基、一氧化氮、蛋白酶、炎症细胞因子而行使细胞毒效应。同时它也可通过分泌神经生长因子支持组织修复[1]，尤其是它分泌的TGF-β可限制组织的损害和抑制星形细胞疤痕的形成[6]。目前尚不清楚，小胶质细胞在什么情况下发挥细胞毒效应，在什么情况下又可促进组织愈合[1、5、8]。从本实验结果看，阿米巴样小胶质细胞、杆状小胶质细胞和圆状小胶质细胞与缺血梗死高度相关，而高分支状小胶质细胞分布区未见梗死，这与Hiroyuki等[7] 报道的完全活化的小胶质细胞才可能有杀伤神经元效应，而中等度活化的小胶质细胞则没有杀伤神经元效应的结论一致。本实验的另一个发现就是慢性脑灌注不足后小胶质细胞MHC抗原表达上调， 在假手术组，无MHCⅠ、Ⅱ类抗原阳性的小胶质细胞出现。MHC抗原的表达提示脑内免疫应答水平的提高，而且小胶质细胞MHC抗原的表达是T细胞参与脑缺血脑内免疫应答的基础，小胶质细胞MHC抗原的表达不仅能向T细胞提呈抗原，可能还有利于T细胞与内皮细胞间的细胞粘附效应[8]。本实验也发现，小胶质细胞MHC抗原的表达与T细胞的入侵高度一致。从本实验研究结果可看出，慢性脑灌注不足后小胶质细胞发生不同程度的活化，形态和功能的转变，免疫分子的表达而行使“双刃”效应，在慢性脑灌注不足慢性病理机制中发挥非常重要的作用。
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CsA作为一种免疫抑制剂对脑灌注没有影响，但可减少脑缺血损伤的面积[2],它虽不影响小胶质细胞、单核细胞的吞噬功能、化学趋化作用和细胞毒活性，但通过抑制钙或钙调蛋白依赖性磷酸化过程，下调CD4分子在小胶质细胞上的表达，并抑制小胶质细胞及单核细胞细胞因子的产生，从而减轻了由小胶质细胞、单核细胞介导的缺血性脑损害[9，10]。另外，CsA还可抑制NMDA介导的神经毒性[2]。本实验发现，经CsA治疗后脑内小胶质细胞的数量及活化程度均大大降低，同时，病理损害明显减轻。提示反应性小胶质细胞在大鼠慢性脑灌注不足脑损害，尤其是白质损害的病理机制中可能起重要作用，免疫抑制剂CsA可显著抑制小胶质细胞的活化反应，减轻其细胞毒效应，从而有效地防治了由小胶质细胞的活化而产生的病理损害。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770273)
作者简介：刘之荣(1966—)，男，硕士，主治医师
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参考文献：
[1]Gehrmann J, Banati RB, Wiessner C,et al. Reactive microglia in cerebral ischemia:an early mediator of tissue damage[J].Neuropathol Appl Neurobiol，1995,21:277-289.
[2]Wakita H, Tomimoto H, Akiguchi I,et al. Protective effect of cyclosporin A on white matter change in the rat after chronic cerebral hypoperfusion[J].Stroke，1995,26:1415-1424.
[3]Gehrman J, Mostsumoto Y, George W. Microglia: intrinsic immunoeffector cell of the brain[J].Brain Res Rev，1995,20:269-287.
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[4]Hiroyuki K, Kyuya K, Liu XH，et al. Progressive expression of immunomolecules on activated microglia and leukocytes following focal cerebral ischemia in the rats[J].Brain Res，1996,734:203-212.
[5]Morioka T, Kalehua AN，Streit WJ. Progressive expression of immunomolecules on microglia cells in rat dorsal hippocampus following transient forebrain ischemia[J].Acta Neuropathol，1992,83:149-157.
[6]Lindholm D, Castreo E, Kefer R, et al. Transforming growth factor-betal in the rat brain increase after injury and inhibition of astrocyte proliferation[J].J Cell Biol，1992,117:395-400.
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[7]Hiroyuki K, Kyuya K, Tautomu A, et al. Astroglial and microglia reactions in the gerbil hippocampus with induced ischemia tolerance[J].Brain Res，1994,664:69-76.
[8]Doyle C，Strominger JL. Interation between CD4 and class MHCⅡ molecules mediates cell adhesion[J].Nature，1987,330:256-259.
[9] Hingorani M, Calder VL, Buckley RJ, et al. The immunomodulatory effect of topical cyclosporin A in atopic keratoconjunctivitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999,40:392-399.
[10]Viola JP, Rao A. Role of the cyclosporin-sensitive transcription factor NFAT1 in the allergic[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 1997,92:147-152.
收稿日期：1999-01-18, http://www.100md.com
单位：刘之荣(兰州军区兰州总医院,甘肃 兰州 730050)；卞晓红(兰州军区兰州总医院,甘肃 兰州 730050)；李露斯(第三军医大学西南医院)
关键词：慢性脑灌注不足；小胶质细胞；脑损害；环孢霉素A
西北国防医学杂志000202 摘要：目的：探讨小胶质细胞在慢性脑灌注不足脑损害中的作用。方法：70只老龄大鼠持久性双侧颈总动脉结扎(2VO)，其中12只接受环孢霉素A(CsA)胃灌治疗。免疫组化法单抗OX18、OX6标记小胶质细胞。实验研究为持久性2VO 1～4月。结果：持久性2VO 1月皮层、海马和白质处均有明显的小胶质细胞活动。1～4月，皮层和白质处小胶质细胞的活动增多，而海马处小胶质细胞的活动则减少，同时脑损害加重。CsA治疗后小胶质细胞的活动明显减少，脑损害明显减轻。结论：小胶质细胞的活动在大鼠慢性脑灌注不足脑损害，特别是大脑白质损害中起重要作用，CsA可抑制大鼠慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞的活动, 从而减轻了脑损害。
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中图分类号：R 743 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0087-03
Reaction of microglia on brain after chronic cerebral hypoperfusion in aged rats
LIU Zhi-rong, BIAN Xiao-hong，LI Lu-si. (Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, PLA,730050)
Abstact:Objective：To investigate the effects of the activation of microglia on the brain damages after chronic cerebral hypoperfusion.Methods：Both common carotid arteries were ligated bilaterally in 70 Wistar rats. Twelve of them were filled cyclosporin A. Microglia were observed with immunohistochemistry for MHCⅠand MHCⅡantigens. The activation of microglia and brain damages were investigated from 1 to 4 months after the ligation.Results：There was an extensive activation of microglia in the cortex, hippocampus and white matter after chronic cerebral hypoperfusion. From 1 to 4 months, the activation of microglia increased in cortex and white matter,but reduced in hippocampus. Meanwhile, the brain damages have become heavier from 1 to 4 months. In cyclosporin Atreated rats, the activation of microglia were significantly reduced, the brain damages were muchless intense.Conclusion：The activation of microglia may play an important role in the pathogenesis of brain damages, especially in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion. Cyclosporin A can suppressed the activation of microglia and reduce brain damages after chronic cerebral hypoperfusion.
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Key words：Chronic cerebral hypoperfusion； Microglia; Brain damage； CsA
小胶质细胞是脑内主要的免疫效应细胞, 脑缺血损伤后迅速被活化，发生瀑布效应，在缺血性脑损害的病理机制中发挥免疫调节、组织修复和细胞损伤的“双刃”作用[1]。在小胶质细胞活化早期适当抑制它的活化反应，能减少不必要的细胞毒作用和病理损害[2]。目前这方面的研究多集中在急性脑缺血效应上，对可导致多发性脑梗死和老年性痴呆的慢性脑灌注不足的研究鲜有报道。
本实验通过老龄大鼠持久性2VO之慢性脑灌注不足模型，研究小胶质细胞的活动和规律，组织学改变以及应用CsA抑制小胶质细胞活动的效用，探讨小胶质细胞的活动对慢性脑灌注不足脑损害的影响和可能机制。
1 材料与方法
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1.1 动物模型与分组:70只老龄(月龄≥12个月)Wistar大鼠，雌雄不分，体重300～450 g。大鼠随机分成假手术对照组，持久性2vo 1、2、3、4 月组和治疗组，每组 3～10 只大鼠。参照Wakita等[2]制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。用20%乌拉坦按800～1 000 mg.kg-1腹腔注射麻醉，保证术中有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，术中大鼠肛温保持在36.5～37.5 ℃，术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养，每天供足食、水。治疗组动物采用CsA胃灌(10mg.kg-1)[2]术前1天、术前各1次，术后1周1.d-1，术后2周1.2 d-1,术后3周1.3 d-1，至2月入组。假手术组动物仅行颈前切开,不结扎颈总动脉。
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1.2 标本制作与病理检查:取持久性2vo 1、2、3、4月组, 治疗组和正常对照组大鼠各3只，20%乌拉坦腹腔深麻醉，生理盐水250 ml 经左心室灌注去除血管内血细胞，后用4℃4%多聚甲醛200 ml灌注固定后分离出大脑，切去脑干、小脑和嗅脑，正中冠状切开，置入 4%多聚甲醛(4℃)中放置10～12 h，再入10%庶糖溶液浸泡至沉底后，-20℃连续冰冻冠状切片，片厚约20 μm。切片放入0.01 mol*L-1PBS液中 4℃保存备用。组织学观察取正常对照组，缺血 2、4月组和治疗组大鼠各4只，同样步骤至4%多聚甲醛后固定48～72 h后行石蜡包埋，石蜡切片，片厚约 5 mm，经贴片、脱蜡处理、HE染色、封片存放备用。
1.3 免疫组化试验和小胶质细胞的计数:冰冻切片入 3%H2O2浸泡15 min去除内源性过氧化物酶活性, 0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×2次后，入10%正常山羊血清封闭室温孵育10 min。切片分别与单抗OX18(1:100)抗MHCⅠ抗原和单抗OX6(1:100)抗MHCⅡ抗原, 37℃孵育 1 h并4℃过夜，0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×3次，切片入生物素标记的二抗(普通型SP试剂盒，1:100)37 ℃孵育30 min，0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5 min×3次。接着切片再与辣根过氧化物酶标记的卵白素三抗(普通型SP试剂盒，1:100)37℃孵育30 min，切片继续0.01 mol.L-1PBS液漂洗 5min×3次。最后切片经DAB试剂显色，显色的切片经表片、风干、脱水及透明后封片存用。采用图象分析仪计数小胶质细胞。
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1.4 统计学处理:采用SPLM软件处理。所得的数据以
±s表示， 作同部位各组之间及组内不同部位之间方差分析。2 结果
2.1 实验动物死亡率: 70只大鼠用于实验，持久性2VO后死亡26只，死亡率为37.1%。
2.2 小胶质细胞免疫组化实验分析: 手术组未发现OX18、OX6单抗标记的小胶质细胞。缺血1月后皮层、海马、胼胝体和内囊处均可见OX18、OX6 标记的小胶质细胞活动，以皮层最显著(图1)，其次是海马，再次是胼胝体和内囊，形态多呈高分枝状，部分呈阿米巴状、圆状和杆状，经统计学处理有显著差异(见表1及图8)。在梗死区，小胶质细胞高度聚集，形态多异，以阿米巴状、 圆状为主，梗死区周边见高分枝状小胶质细胞聚集(图2)。缺血 1～4月，皮层、胼胝体和内囊处小胶质细胞的活动增多(图3)，而海马处小胶质细胞的活动则减少，经统计学处理差异显著(见表1及图1)。CsA治疗后皮层、胼胝体、内囊和海马处小胶质细胞的活动明显减少(图4)，统计学处理差异非常显著(见表1及图8)。
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表1 慢性脑灌注不足后脑内小胶质细胞的活动
CCH1
CCH2
CCH3
CCH4
治疗
C(n=12)
969±16b
984±9ab
1022±18ab
1142±29ab
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171±18a
H(n=12)
690±14b
514±9b
418±11ab
404±6ab
71±6a
CC(n=12)
340±8b
371±8ab
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394±5ab
427±6ab
31±3a
IC(n=12)
248±5b
294±7b
311±8ab
369±7ab
34±5a
注：a:P<0.01 与CCH1月比较 b:P<0.01 与治疗组比较
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CCH:慢性脑灌注不足 C:皮层 H:海马 CC:胼胝体 IC:内囊
图1 慢性脑灌注不足1月，皮层小胶质细胞的活动
(免疫组化染色，20×10)
图2 慢性脑灌注不足1月，皮层死区周边小胶质细胞明显集聚
(免疫组化染色，20×10)
图3 慢性脑灌注不足4月，皮层小胶质细胞的活动明显增多
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图4 CsA治疗后,皮层小胶质细胞的活动明显减少
(免疫组化染色，20×10)
2.3 病理检查分析:假手术组未发现明显的病理改变。缺血 2 月后皮层下、内囊区及海马区白质出现较大的软化灶，伴有胶质细胞和小血管增生(图5)。灰质内见单个或多个神经元缺血性改变，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕(图6)。缺血 4 月后， 皮层和白质处梗死发生率无明显变化，但皮层和海马处神经元固缩退变更为明显。同时，出现胶质增生小结，并出现噬神经细胞现象。CsA治疗后皮层内偶见小软化灶(图7)；散在小胶质细胞结节，其它无明显病变。
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图5 慢性脑灌注不足2月，白质内见大软化灶
(HE染色，20×10)
图6 慢性脑灌注不足2月，皮层内神经元缺血性改变，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕
(HE染色，20×10)
图7 CsA治疗后，皮层内偶见的小软化灶
(HE染色，20×10)
图8 慢性脑灌注不足后脑内小胶质细胞的变化
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3 讨论
正常状态下脑内小胶质细胞处于静止或休眠状态，极少有单核吞噬细胞抗原及MHC抗原表达，且胞浆内无吞噬体，无非特异酯酶活性，不具备吞噬细胞的功能, 而单核吞噬细胞又被阻隔于血脑屏障之外，这使得正常状态下脑内免疫处于低水平，脑组织免受免疫介导的损伤[3]。脑缺血损伤后小胶质细胞可快速活化，发生形态、功能和免疫显型的改变，恢复呼吸爆发功能，产生免疫应答反应[4]。在本实验里，缺血区出现不同形态的小胶质细胞，有圆状、阿米巴状、杆状和高分枝状，圆状、阿米巴状及杆状小胶质细胞主要分布在梗死区，且在梗死区半暗带集聚，而高分枝状小胶质细胞则散在分布在广大无梗死的区域，包括皮层、白质和海马，并在梗死区周围密集，提示小胶质细胞的形态可反映出慢性脑灌注不足脑损害的部位及严重性。研究显示[5]，圆状、阿米巴状及杆状小胶质细胞代表完全活化的小胶质细胞，高分枝状小胶质细胞则代表部分活化的小胶质细胞，因此本实验结果也提示小胶质细胞活化的程度与慢性脑灌注不足脑损害的严重性相平行。在本实验里，缺血 1～4 月，皮层和白质区小胶质细胞数量渐增多，尤其是在梗死区明显，而海马区小胶质细胞数量则下降，提示慢性脑灌注不足缺血性脑损害1～4 月是渐进发展的，且主要表现为皮层和白质的损害，小胶质细胞的活动贯穿于整个慢性病理过程。从超微结构上看，小胶质细胞转化为吞噬细胞可以清除坏死的神经元，同时保护坏死神经元周围可存活神经元的完整性；从功能上看，活化的小胶质细胞通过释放氧自由基、一氧化氮、蛋白酶、炎症细胞因子而行使细胞毒效应。同时它也可通过分泌神经生长因子支持组织修复[1]，尤其是它分泌的TGF-β可限制组织的损害和抑制星形细胞疤痕的形成[6]。目前尚不清楚，小胶质细胞在什么情况下发挥细胞毒效应，在什么情况下又可促进组织愈合[1、5、8]。从本实验结果看，阿米巴样小胶质细胞、杆状小胶质细胞和圆状小胶质细胞与缺血梗死高度相关，而高分支状小胶质细胞分布区未见梗死，这与Hiroyuki等[7] 报道的完全活化的小胶质细胞才可能有杀伤神经元效应，而中等度活化的小胶质细胞则没有杀伤神经元效应的结论一致。本实验的另一个发现就是慢性脑灌注不足后小胶质细胞MHC抗原表达上调， 在假手术组，无MHCⅠ、Ⅱ类抗原阳性的小胶质细胞出现。MHC抗原的表达提示脑内免疫应答水平的提高，而且小胶质细胞MHC抗原的表达是T细胞参与脑缺血脑内免疫应答的基础，小胶质细胞MHC抗原的表达不仅能向T细胞提呈抗原，可能还有利于T细胞与内皮细胞间的细胞粘附效应[8]。本实验也发现，小胶质细胞MHC抗原的表达与T细胞的入侵高度一致。从本实验研究结果可看出，慢性脑灌注不足后小胶质细胞发生不同程度的活化，形态和功能的转变，免疫分子的表达而行使“双刃”效应，在慢性脑灌注不足慢性病理机制中发挥非常重要的作用。
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CsA作为一种免疫抑制剂对脑灌注没有影响，但可减少脑缺血损伤的面积[2],它虽不影响小胶质细胞、单核细胞的吞噬功能、化学趋化作用和细胞毒活性，但通过抑制钙或钙调蛋白依赖性磷酸化过程，下调CD4分子在小胶质细胞上的表达，并抑制小胶质细胞及单核细胞细胞因子的产生，从而减轻了由小胶质细胞、单核细胞介导的缺血性脑损害[9，10]。另外，CsA还可抑制NMDA介导的神经毒性[2]。本实验发现，经CsA治疗后脑内小胶质细胞的数量及活化程度均大大降低，同时，病理损害明显减轻。提示反应性小胶质细胞在大鼠慢性脑灌注不足脑损害，尤其是白质损害的病理机制中可能起重要作用，免疫抑制剂CsA可显著抑制小胶质细胞的活化反应，减轻其细胞毒效应，从而有效地防治了由小胶质细胞的活化而产生的病理损害。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770273)
作者简介：刘之荣(1966—)，男，硕士，主治医师
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收稿日期：1999-01-18, http://www.100md.com