多囊肾病囊肿衬里上皮细胞细胞系的建立与鉴定
作者：徐成钢 梅长林 张黎明
单位：徐成钢(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)；梅长林(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)；张黎明(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)
关键词：常染色体显性遗传多囊肾病；囊肿衬里上皮细胞；鉴定
肾脏病与透折肾移植杂志000210 摘 要 目的：建立人常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞系。 方法：ADPKD囊肿衬里上皮细胞经FuGENE6介导转染pSV3质粒，并以G418筛选转染成功的细胞。转染后的第48代细胞予以光镜、电镜形态学观察，细胞生长率测定，细胞染色体检查，碱性磷酸酶染色及细胞角蛋白、波形蛋白等免疫组化检查。结果：第48代细胞的碱性磷酸酶染色及抗细胞角蛋白、波形蛋白单克隆抗体反应阳性；形态学特征，细胞生长率与未经转化的第2代细胞相比也无明显差异；但大部份转化细胞染色体为异倍体。 结论：经鉴定，ADPKD囊肿衬里上皮细胞系已建立，可用于ADPKD细胞及分子生物学的研究。
, http://www.100md.com
ESTABLISHMENT AND IDENTIFICATION OF ADPKD CYST-LINING EPITHELIAL CELL LINES
XU Cenggang，MEI Changlin，ZHANG Liming
(Department of Nephrology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai，200003)
OBJECTIVE To establish a cell lines of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)cyst-lining epithelialium.METHODOLOGY FuGENE6 were used to transduce the pSV3 plasmid into cultured ADPKD cyst-lining epithelial cells.After transfection，cells were selected by addition of G418 to the culture medium in order to obtain successfully transfected cells.Passage 48 cells were utilized for the following studies：①cell morphology observation，②growth rate determination，③chromosome examination，④alkaline phosphatase staining and⑤immunocytochemical staining of cytokeratin and vimentin. RESULTS No significant difference in morphology and cell growth rate was found between passage 48 cells and passage 2 cells which were not transfected.The majority of the cells were polygonal，only a few were extremely elongate cells.Microvilli-like coating of cells and adhesion plaque at site of cell-cell contact were observed under transmission electron microscopy.Both passage 2 cells and passage 48 cells were positive for alkaline phosphatase staining、immunochemical staining of cytokeratin and vimentin，whereas the immunochemical staining of factor Ⅷ、actin、desmin and fibroblast specific protein were negative.Chromosome of most transformed cells were heteroploid. CONCLUSION An ADPKD cyst-lining epithelial cell line has been established and identified，which can be used in the research of ADPKD cellular and molecular mechanism.
, 百拇医药
Key words autosomal dominant polycystic kidney disease cyst-lining epithelial cell identification
常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞在多囊肾病的发生、发展中起着重要作用。1986年，Wilson等[1]原代培养多囊肾病囊肿衬里上皮细胞获得成功，为多囊肾病发病机制的研究提供了细胞模型。但是，原代培养囊肿衬里上皮细胞比较困难，细胞生存期短，一般只能传4～5代，限制了研究工作的开展。因此有必要建立稳定的细胞系用于细胞信号转导、基因治疗等分子生物学研究。
1 材料和方法
1.1 材料 胶原酶，D-Valine(左旋缬氨酸)改良的MEM培养基(Sigma公司)。胎牛血清，G418，RPMI-1640培养基(GibcoBRL公司).pSV3质粒(美国华盛顿大学张鲁榕博士惠赠)。兔抗人角蛋白、结蛋白、波形蛋白、Ⅷ因子、成纤维细胞特异蛋白、肌动蛋白单克隆抗体(DAKO公司)。FuGENE转染试剂(Boehringer Mannhein公司)。
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1.2 方法
1.2.1 原代细胞培养 多囊肾组织来自一例34岁女性患者。剪取浅表、透明的囊泡，剥离表层纤维膜，囊泡壁切成碎屑。经0.1%胶原酶37℃振荡水浴箱消化1h后，细胞接种于经鼠尾胶原包被的培养瓶中，置于5%CO2、37℃的孵箱内。培养液由20%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素及D-Valine改良的MEM组成。当细胞接近融合时，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA的等量混合液消化细胞进行传代。
1.2.2 细胞转染 第二代细胞用于转染。转染前一天接种细胞于6孔培养板，每孔2×105细胞、2ml培养液。转染前用无血清培养液将6 μl FuGENE6稀释到100μl，再用FuGENE6稀释液稀释1.5 μg pSV3。然后将FuGENE6、pVS3混合液滴加入一个孔中。48h后，细胞按1∶10传代，并予培养。
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1.2.3 液中加入G418(600 mg/L)，5天后G418浓度改为200 mg/L，每4～5天换液一次。待出现抗药克隆后，用RPMI1640代替培养液中的D-Valine改良的MEM扩增细胞。
1.2.4 连续细胞系的鉴定
(1)倒置相差显微镜检查 以第二代衬里上皮细胞作对照，对第48代衬里上皮细胞进行鉴定。
(2)透射电镜检查 细胞经离心沉淀后，4℃ 2.5%的戊二醛固定1h，然后用二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，1%锇酸固定1h，0.1 mol/L PBS冲洗3次，常规包埋，LKB超薄切片机切片，铅染，透射电镜下观察。
(3)免疫组化及细胞酶化学鉴定 48代衬里上皮细胞接种在置有盖玻片的6孔板中，80%融合时，取出玻片，丙酮固定10min，常规方法分别加入兔抗人细胞肌动蛋白、结蛋白、角蛋白、第Ⅷ因子、波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白单克隆抗体。再加入生物素标记的抗兔IgG第二抗体。最后加卵白素-生物素-过氧化物酶(ABC)复合物及DAB溶液显色。阳性者呈棕黄色。细胞碱性磷酸酶染色时，上述盖玻片于4℃丙酮固定4min。37℃碱性磷酸酶孵浴液孵浴2h，蒸溜水洗后，先后加2%硝酸钙2min，2%硝酸钴2min，0.1%硫酸铵1min。最后用甲基绿复染细胞核。阳性者呈灰黑色。
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(4)细胞染色体检查 50%～80%融合的细胞在终止培养前6h加入秋水仙碱(终浓度为0.4～0.8 mg/L)。继续培养4～6h，然后离心，低渗处理，预固定，固定制片，Giemsa染色。
(5)细胞生长率测定 将一定量的细胞平均接种于24孔培养板中，共15孔，于1、3、5、7天分别计数3个孔的细胞数，取其均值，以其对数标于半对数坐标纸上，画出细胞生长曲线。
(6)细胞系的冻存与复苏试验 第48代衬里上皮细胞接近融合时，传代，制备浓度为5×109/L的细胞悬液，加10%二甲基亚砜后冻存。过程为4℃冰箱2h，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜，然后直接投入液氮中。分别于1、3、6个月后复苏细胞，观察细胞复苏率。
2 结 果
2.1 细胞培养 原代培养细胞贴壁慢，一旦贴壁后生长迅速，约一周左右长满瓶底。按1∶3比例传代的细胞约3～4天即生长融合。20天后细胞生长速度明显下降，30天后细胞基本处于生长停滞状态。
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2.2 细胞转化 经pSV3转染后48h的细胞置于含600 mg/L G418的培养液中，5天后细胞大部份死亡，G418浓度改为200 mg/L后，于第15天左右出现抗药克隆。
2.3 细胞鉴定
2.3.1 倒置相差显微镜观察 第2代细胞与第48代细胞形态无明显差别，大部份细胞呈多角形，呈旋涡状生长，旋涡中心细胞呈多角形，随着细胞数量增多，中心周围的细胞逐渐拉长呈梭形。这一现象在细胞生长接近融合时易见到。
2.3.2 透射电镜检查 电镜可看到细胞核呈圆形或多角形，具1～2个核仁；细胞膜上覆盖有大量微绒毛；细胞间可见粘合斑(图1A、B)。
2.3.3 免疫组化及细胞酶化学鉴定 衬里上皮细胞株抗细胞角蛋白、波形蛋白单抗阳性，抗第Ⅷ因子、细胞结蛋白、肌动蛋白、成纤维细胞特异蛋白单抗阴性。碱性磷酸酶染色呈灰黑色阳性反应。
, 百拇医药
Fig.1. Transmission electron micrographs of cultured cyst-lining epithelial cells
(A)microvilli-like coating of cells；(B)adhesion plaque at site of cell-cell contact ×9600.
2.3.4 细胞染色体检查 染色体检查发现染色体大多呈异倍体(图2)。
Fig.2. Chromosome of transformed cyst-lining epithelial cells were heteroploid ×400
2.3.5 细胞生长率测定 第48代贴壁生长1天后，细胞倍增时间为15h，至第7天细胞生长达高峰时，不再生长。第2代衬里上皮细胞与第48代细胞相比较，细胞生长率无明显差异。
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2.3.6 细胞冻存与复苏实验 冻存细胞复苏后，贴壁时间较正常传代细胞贴壁稍慢，形态与传代细胞相同。复苏率为80%左右。
3 讨 论
肾脏细胞包括肾小球上皮细胞、内皮细胞、系膜细胞以及肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞，要培养出囊肿衬里上皮细胞必须排除上述细胞的污染。因成纤维细胞体内缺少把右旋缬氨酸转变为左旋缬氨酸的酶，而合成蛋白质时，细胞必须使用左旋氨基酸。当培养液中只有右旋缬氨酸时，成纤维细胞就不能利用右旋缬氨酸合成蛋白质而增生，但囊肿衬里上皮细胞含有转化酶，能将右旋缬氨酸转化为左旋缬氨酸进行蛋白合成。故用右旋缬氨酸改良的MEM培养基能有效地避免成纤维细胞污染[2]；取材时只取浅表部位透明的囊泡组织，也就避免了肾小管上皮细胞和小球细胞的污染。
体外培养的哺乳类动物细胞可经化学致癌剂刺激、SV40早期基因片段转染、低氧诱导及自发转化而成为持续生长的细胞系[3，4]。ADPKD衬里上皮细胞生长周期短，低氧诱导及自发转化难以实行。化学致癌剂存在着对人和环境潜在的危害作用，诱导产生的细胞系在生物学特性及细胞结构方面与原代细胞有较大差异。所以本研究采用pSV3转染细胞而使细胞获得持续生长能力。pSV3质粒含有SV40病毒DNA的早期基因片段和neo基因片段。SV40 DNA早期基因片段的对应蛋白产物SV40大T抗原可与细胞核内一个分子量300 000的磷酸化蛋白(phosphoprotein)，抗癌基因P53蛋白和抗癌基因Rb蛋白结合，结合后导致P53和Rb失活，使细胞转化。Neo基因的表达蛋白能对抗G418的毒性，转染成功的细胞在含有致死量的G418培养基中能生长，未转染成功者则死亡。迄今为止已有多篇有关SV40 DNA转染细胞建株的报道[5，6]。本实验用pSV3转染衬里上皮细胞，成功地使其获得连续生长特性。
, 百拇医药
肾脏中每种细胞均有其特异的鉴定标志。内皮细胞Ⅷ因子表达阳性，系膜细胞同时表达结蛋白和肌动蛋白，成纤维细胞波形蛋白和成纤维细胞特异蛋白表达阳性，小球及小管上皮细胞角蛋白表达阳性。原代培养的衬里上皮细胞细胞角蛋白及波形蛋白表达阳性，不表达细胞肌动蛋白、结蛋白、成纤维细胞特异蛋白和第Ⅷ因子，富含碱性磷酸酶[7]。原代衬里上皮细胞电镜检查可见细胞膜上大量微绒毛，细胞间有粘合斑等特点，本实验证实转化后的衬里上皮细胞亦有同样的特性，说明转化细胞具有原代培养细胞的基本生物学特性。
第48代细胞染色体呈异倍体符合连续细胞系细胞染色体多呈异倍体的特点。
综上所述，可以认为已建立的ADPKD囊肿衬里上皮细胞系与原代细胞相比无明显生物学特性的改变，该细胞系可作为ADPKD细胞及分子生物学研究的细胞模型。
上海市科委重点课题基金(964319025)、上海百人计划基金(97047)及95全军医药卫生杰出人才基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1，Wilson PD，Schcier RW，Breckon RD et al.A new method for studing human polycystic kidney disease epithelia in culture.Kidney Int，1986，30：371
2，Gilbert SF，Migeon BR.D-Valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture.Cell，1975，5：11
3，梅长林，张黎明，陈 蕾.大鼠系膜细胞系的建立及鉴定.肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5：90
4，Falanga V，Kirsner RS.Low oxygen stimulates proliferation of fibroblasts seeded as single cells.J Cell Physiol，1993，154：506
, 百拇医药
5，Southern PJ，Berg P.Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter.J of Molecu and Appli Gene，1982，1：327
6，Perrone RD，Grubman SA，Rogers LC et al.Continuous epithelial cell lines from ADPKD liver cysts exhibit characteristics of intrahepatic biliary epithelium.Am J Physiol，1995，264：G335
7，Klingel R，Storkel S，Dippold W et al.Autosomal dominant polycystic kidney disease-in vitro culture of cystic lining epithelial cell.Virchows Archiv B Cell Pathol，1991，61：189
(2000-02-23收稿，2000-03-20修回)
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单位：徐成钢(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)；梅长林(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)；张黎明(第二军医大学长征医院肾内科 上海，200003)
关键词：常染色体显性遗传多囊肾病；囊肿衬里上皮细胞；鉴定
肾脏病与透折肾移植杂志000210 摘 要 目的：建立人常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞系。 方法：ADPKD囊肿衬里上皮细胞经FuGENE6介导转染pSV3质粒，并以G418筛选转染成功的细胞。转染后的第48代细胞予以光镜、电镜形态学观察，细胞生长率测定，细胞染色体检查，碱性磷酸酶染色及细胞角蛋白、波形蛋白等免疫组化检查。结果：第48代细胞的碱性磷酸酶染色及抗细胞角蛋白、波形蛋白单克隆抗体反应阳性；形态学特征，细胞生长率与未经转化的第2代细胞相比也无明显差异；但大部份转化细胞染色体为异倍体。 结论：经鉴定，ADPKD囊肿衬里上皮细胞系已建立，可用于ADPKD细胞及分子生物学的研究。
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ESTABLISHMENT AND IDENTIFICATION OF ADPKD CYST-LINING EPITHELIAL CELL LINES
XU Cenggang，MEI Changlin，ZHANG Liming
(Department of Nephrology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai，200003)
OBJECTIVE To establish a cell lines of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)cyst-lining epithelialium.METHODOLOGY FuGENE6 were used to transduce the pSV3 plasmid into cultured ADPKD cyst-lining epithelial cells.After transfection，cells were selected by addition of G418 to the culture medium in order to obtain successfully transfected cells.Passage 48 cells were utilized for the following studies：①cell morphology observation，②growth rate determination，③chromosome examination，④alkaline phosphatase staining and⑤immunocytochemical staining of cytokeratin and vimentin. RESULTS No significant difference in morphology and cell growth rate was found between passage 48 cells and passage 2 cells which were not transfected.The majority of the cells were polygonal，only a few were extremely elongate cells.Microvilli-like coating of cells and adhesion plaque at site of cell-cell contact were observed under transmission electron microscopy.Both passage 2 cells and passage 48 cells were positive for alkaline phosphatase staining、immunochemical staining of cytokeratin and vimentin，whereas the immunochemical staining of factor Ⅷ、actin、desmin and fibroblast specific protein were negative.Chromosome of most transformed cells were heteroploid. CONCLUSION An ADPKD cyst-lining epithelial cell line has been established and identified，which can be used in the research of ADPKD cellular and molecular mechanism.
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常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞在多囊肾病的发生、发展中起着重要作用。1986年，Wilson等[1]原代培养多囊肾病囊肿衬里上皮细胞获得成功，为多囊肾病发病机制的研究提供了细胞模型。但是，原代培养囊肿衬里上皮细胞比较困难，细胞生存期短，一般只能传4～5代，限制了研究工作的开展。因此有必要建立稳定的细胞系用于细胞信号转导、基因治疗等分子生物学研究。
1 材料和方法
1.1 材料 胶原酶，D-Valine(左旋缬氨酸)改良的MEM培养基(Sigma公司)。胎牛血清，G418，RPMI-1640培养基(GibcoBRL公司).pSV3质粒(美国华盛顿大学张鲁榕博士惠赠)。兔抗人角蛋白、结蛋白、波形蛋白、Ⅷ因子、成纤维细胞特异蛋白、肌动蛋白单克隆抗体(DAKO公司)。FuGENE转染试剂(Boehringer Mannhein公司)。
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1.2 方法
1.2.1 原代细胞培养 多囊肾组织来自一例34岁女性患者。剪取浅表、透明的囊泡，剥离表层纤维膜，囊泡壁切成碎屑。经0.1%胶原酶37℃振荡水浴箱消化1h后，细胞接种于经鼠尾胶原包被的培养瓶中，置于5%CO2、37℃的孵箱内。培养液由20%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素及D-Valine改良的MEM组成。当细胞接近融合时，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA的等量混合液消化细胞进行传代。
1.2.2 细胞转染 第二代细胞用于转染。转染前一天接种细胞于6孔培养板，每孔2×105细胞、2ml培养液。转染前用无血清培养液将6 μl FuGENE6稀释到100μl，再用FuGENE6稀释液稀释1.5 μg pSV3。然后将FuGENE6、pVS3混合液滴加入一个孔中。48h后，细胞按1∶10传代，并予培养。
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1.2.3 液中加入G418(600 mg/L)，5天后G418浓度改为200 mg/L，每4～5天换液一次。待出现抗药克隆后，用RPMI1640代替培养液中的D-Valine改良的MEM扩增细胞。
1.2.4 连续细胞系的鉴定
(1)倒置相差显微镜检查 以第二代衬里上皮细胞作对照，对第48代衬里上皮细胞进行鉴定。
(2)透射电镜检查 细胞经离心沉淀后，4℃ 2.5%的戊二醛固定1h，然后用二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，1%锇酸固定1h，0.1 mol/L PBS冲洗3次，常规包埋，LKB超薄切片机切片，铅染，透射电镜下观察。
(3)免疫组化及细胞酶化学鉴定 48代衬里上皮细胞接种在置有盖玻片的6孔板中，80%融合时，取出玻片，丙酮固定10min，常规方法分别加入兔抗人细胞肌动蛋白、结蛋白、角蛋白、第Ⅷ因子、波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白单克隆抗体。再加入生物素标记的抗兔IgG第二抗体。最后加卵白素-生物素-过氧化物酶(ABC)复合物及DAB溶液显色。阳性者呈棕黄色。细胞碱性磷酸酶染色时，上述盖玻片于4℃丙酮固定4min。37℃碱性磷酸酶孵浴液孵浴2h，蒸溜水洗后，先后加2%硝酸钙2min，2%硝酸钴2min，0.1%硫酸铵1min。最后用甲基绿复染细胞核。阳性者呈灰黑色。
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(4)细胞染色体检查 50%～80%融合的细胞在终止培养前6h加入秋水仙碱(终浓度为0.4～0.8 mg/L)。继续培养4～6h，然后离心，低渗处理，预固定，固定制片，Giemsa染色。
(5)细胞生长率测定 将一定量的细胞平均接种于24孔培养板中，共15孔，于1、3、5、7天分别计数3个孔的细胞数，取其均值，以其对数标于半对数坐标纸上，画出细胞生长曲线。
(6)细胞系的冻存与复苏试验 第48代衬里上皮细胞接近融合时，传代，制备浓度为5×109/L的细胞悬液，加10%二甲基亚砜后冻存。过程为4℃冰箱2h，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜，然后直接投入液氮中。分别于1、3、6个月后复苏细胞，观察细胞复苏率。
2 结 果
2.1 细胞培养 原代培养细胞贴壁慢，一旦贴壁后生长迅速，约一周左右长满瓶底。按1∶3比例传代的细胞约3～4天即生长融合。20天后细胞生长速度明显下降，30天后细胞基本处于生长停滞状态。
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2.2 细胞转化 经pSV3转染后48h的细胞置于含600 mg/L G418的培养液中，5天后细胞大部份死亡，G418浓度改为200 mg/L后，于第15天左右出现抗药克隆。
2.3 细胞鉴定
2.3.1 倒置相差显微镜观察 第2代细胞与第48代细胞形态无明显差别，大部份细胞呈多角形，呈旋涡状生长，旋涡中心细胞呈多角形，随着细胞数量增多，中心周围的细胞逐渐拉长呈梭形。这一现象在细胞生长接近融合时易见到。
2.3.2 透射电镜检查 电镜可看到细胞核呈圆形或多角形，具1～2个核仁；细胞膜上覆盖有大量微绒毛；细胞间可见粘合斑(图1A、B)。
2.3.3 免疫组化及细胞酶化学鉴定 衬里上皮细胞株抗细胞角蛋白、波形蛋白单抗阳性，抗第Ⅷ因子、细胞结蛋白、肌动蛋白、成纤维细胞特异蛋白单抗阴性。碱性磷酸酶染色呈灰黑色阳性反应。
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Fig.1. Transmission electron micrographs of cultured cyst-lining epithelial cells
(A)microvilli-like coating of cells；(B)adhesion plaque at site of cell-cell contact ×9600.
2.3.4 细胞染色体检查 染色体检查发现染色体大多呈异倍体(图2)。
Fig.2. Chromosome of transformed cyst-lining epithelial cells were heteroploid ×400
2.3.5 细胞生长率测定 第48代贴壁生长1天后，细胞倍增时间为15h，至第7天细胞生长达高峰时，不再生长。第2代衬里上皮细胞与第48代细胞相比较，细胞生长率无明显差异。
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2.3.6 细胞冻存与复苏实验 冻存细胞复苏后，贴壁时间较正常传代细胞贴壁稍慢，形态与传代细胞相同。复苏率为80%左右。
3 讨 论
肾脏细胞包括肾小球上皮细胞、内皮细胞、系膜细胞以及肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞，要培养出囊肿衬里上皮细胞必须排除上述细胞的污染。因成纤维细胞体内缺少把右旋缬氨酸转变为左旋缬氨酸的酶，而合成蛋白质时，细胞必须使用左旋氨基酸。当培养液中只有右旋缬氨酸时，成纤维细胞就不能利用右旋缬氨酸合成蛋白质而增生，但囊肿衬里上皮细胞含有转化酶，能将右旋缬氨酸转化为左旋缬氨酸进行蛋白合成。故用右旋缬氨酸改良的MEM培养基能有效地避免成纤维细胞污染[2]；取材时只取浅表部位透明的囊泡组织，也就避免了肾小管上皮细胞和小球细胞的污染。
体外培养的哺乳类动物细胞可经化学致癌剂刺激、SV40早期基因片段转染、低氧诱导及自发转化而成为持续生长的细胞系[3，4]。ADPKD衬里上皮细胞生长周期短，低氧诱导及自发转化难以实行。化学致癌剂存在着对人和环境潜在的危害作用，诱导产生的细胞系在生物学特性及细胞结构方面与原代细胞有较大差异。所以本研究采用pSV3转染细胞而使细胞获得持续生长能力。pSV3质粒含有SV40病毒DNA的早期基因片段和neo基因片段。SV40 DNA早期基因片段的对应蛋白产物SV40大T抗原可与细胞核内一个分子量300 000的磷酸化蛋白(phosphoprotein)，抗癌基因P53蛋白和抗癌基因Rb蛋白结合，结合后导致P53和Rb失活，使细胞转化。Neo基因的表达蛋白能对抗G418的毒性，转染成功的细胞在含有致死量的G418培养基中能生长，未转染成功者则死亡。迄今为止已有多篇有关SV40 DNA转染细胞建株的报道[5，6]。本实验用pSV3转染衬里上皮细胞，成功地使其获得连续生长特性。
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肾脏中每种细胞均有其特异的鉴定标志。内皮细胞Ⅷ因子表达阳性，系膜细胞同时表达结蛋白和肌动蛋白，成纤维细胞波形蛋白和成纤维细胞特异蛋白表达阳性，小球及小管上皮细胞角蛋白表达阳性。原代培养的衬里上皮细胞细胞角蛋白及波形蛋白表达阳性，不表达细胞肌动蛋白、结蛋白、成纤维细胞特异蛋白和第Ⅷ因子，富含碱性磷酸酶[7]。原代衬里上皮细胞电镜检查可见细胞膜上大量微绒毛，细胞间有粘合斑等特点，本实验证实转化后的衬里上皮细胞亦有同样的特性，说明转化细胞具有原代培养细胞的基本生物学特性。
第48代细胞染色体呈异倍体符合连续细胞系细胞染色体多呈异倍体的特点。
综上所述，可以认为已建立的ADPKD囊肿衬里上皮细胞系与原代细胞相比无明显生物学特性的改变，该细胞系可作为ADPKD细胞及分子生物学研究的细胞模型。
上海市科委重点课题基金(964319025)、上海百人计划基金(97047)及95全军医药卫生杰出人才基金资助项目
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参考文献
1，Wilson PD，Schcier RW，Breckon RD et al.A new method for studing human polycystic kidney disease epithelia in culture.Kidney Int，1986，30：371
2，Gilbert SF，Migeon BR.D-Valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture.Cell，1975，5：11
3，梅长林，张黎明，陈 蕾.大鼠系膜细胞系的建立及鉴定.肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5：90
4，Falanga V，Kirsner RS.Low oxygen stimulates proliferation of fibroblasts seeded as single cells.J Cell Physiol，1993，154：506
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5，Southern PJ，Berg P.Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter.J of Molecu and Appli Gene，1982，1：327
6，Perrone RD，Grubman SA，Rogers LC et al.Continuous epithelial cell lines from ADPKD liver cysts exhibit characteristics of intrahepatic biliary epithelium.Am J Physiol，1995，264：G335
7，Klingel R，Storkel S，Dippold W et al.Autosomal dominant polycystic kidney disease-in vitro culture of cystic lining epithelial cell.Virchows Archiv B Cell Pathol，1991，61：189
(2000-02-23收稿，2000-03-20修回)
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