日本血吸虫混合DNA疫苗的构建
作者：李柳哲 石佑恩 刘江华
单位：同济医科大学基础医学院寄生虫学教研室， 武汉 430030
关键词：混合抗原；DNA疫苗；日本血吸虫
同济医科大学学报000303 摘要 构建日本血吸虫混合DNA疫苗，为今后多抗原特 异性DNA疫苗的研究打下基础。在克隆pBluescript-Sj23、pBluescript-Sj26、pBluescri pt-32的基础上，亚克隆构建了真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32。经过酶 切鉴定，PCR扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠 ，3周后提取小鼠股四头肌DNA，特异性引物扩增获得目的基因。证实重组质粒转入了完整的 日本血吸虫抗原23、26、32 kd基因。且混合质粒能在肌肉组织中稳定存在。建立 了日本血吸虫混合抗原DNA疫苗，为以后的多特异性DNA疫苗进一步研究奠定了基础。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.11, R979.5, R383.2
The Construction of Multi-antigen Mixtu re DNA
Vaccine of Schistosoma Japonicum
Li Liuzhe Shi You′en Liu Jianghua
(Department of Parasitology, School of Basic Medical Sc iences, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The eukaryotic vectors pBK-Sj23，pBK-Sj26 and pBK-S j32 were constructed based on the cloning of vectors pBluescript-Sj23，pBlues- Sj26 and pBluescript-32. After verification, PCR amplification and squencing, the above three antigen pla smids were intramuscularly inoculated with the mixture of varied plasmid to immu nize the mice. Three weeks after immunization, the DNA was isolated from the mic e muscle, and the specific antigen gene was amplified from it by PCR. The result s showed that the target antigen genes including 23 kd, 26 kd and 32 kd were subcloned successfully and the mixture of plasmids could existe stably in m uscular tissue.
, 百拇医药
Key words muti-antigen; DNA vaccine; schistosoma japonicum
近年来已经开展了血吸虫DNA疫苗的研制，并且取得了一定的免疫效果[1] 。尽管D NA疫苗较其他分子疫苗有许多优点，如制作方便,能大量生产等，但其免疫效价没有显著差 异。免疫后减虫率通常在30%～40%。国外有学者报道将多抗原特异性DNA疫苗免疫动物，能诱 发机体产生针对各抗原分子的免疫反应[2]。基于此，本文亚克隆日本血吸虫抗原2 3、26、32 kd基因于真核表达载体中(1 d=0.992 u)，经不同组合后构成多抗原混合疫苗免 疫小鼠，并观察了各组基因疫苗在肌肉中的存在情况，为进一步研究混合多价DNA疫苗打下 了基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
, 百拇医药 TaqDNA聚合酶购自德国宝灵曼公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，BamHⅠ,XbaⅠ等 限制性内切酶购自华美公司，其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2 菌种、质粒及实验小鼠
含质粒pBluescript-Sj23(pBS-Sj23)，pBluescript-Sj26(pBS-Sj26)，pBluescr ipt-Sj32(pBS-Sj32)大肠杆菌TG1菌种由本室保存，含质粒pBK的 XL1-blue菌种，菌 种XL1-blue由本室保存，4周龄昆明种小鼠由同济医大实验动物学部提供。
1.3 真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32 的构建
引物的设计及合成：根据日本血吸虫23、26、32 kd序列及真核表达载体pBK多克隆位点， 分别设计3对引物，序列如下：
, 百拇医药
Sj23：引物1：5′-CGTCTAGACATGGCGACTTTGGGTACT-3′
引物2：5′-CGGGTACCTTAAACATTCTGATAATC-3′
Sj26：引物1：5′-TAAGGATCCCATGTCCCCCTATACTAGG-3′
引物2：5′-AGCTCTAGATCCTCCTTTTGGAGGATGGTCGCC-3′
Sj32：引物1：5′-CTCGGATCCAAGAGAAATAATGTTTTATTC-3′
引物2：5′-CGCTCTAGATCCACCGCAAACTTTCCTGATAACTCC-3′
引物均由上海生工生物公司合成
, 百拇医药
真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32的构建： 质粒的小量提取，以质粒为模板进行的目的基因Sj23、Sj26、Sj32的PCR扩增，PCR产物的 纯化，载体与目的基因的双酶切及酶切回收后的连接，感受态细菌的制备，目的基因的转化 ，筛选均参照Sambrook方法[3]。
1.4 重组质粒的鉴定
1.4.1重组质粒的PCR鉴定： 筛选的阳性转化菌落进行质粒的小量制备， 分别以质粒为模板经目的基因Sj23、Sj26、Sj32的 特异性引物进行PCR扩增。
1.4.2 重组质粒的限制性内切酶分析： 阳性转化菌落的质粒小量制备产 物经引物中设计的限制性内切酶位点及质粒的多克隆位点进行酶切分析。
1.4.3 序列测定： 挑选鉴定后亚克隆，按Sanger末端终止法进行DNA测序 。
, 百拇医药
1.5 不同抗原DNA疫苗分组免疫小鼠
重组质粒pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32大量制备后，分成以下3组免疫小鼠的股四头 肌： ① pBK-Sj23, pBK-Sj32 ② pBK-Sj26, pBK-Sj32 ③ pBK-Sj23, pBK-Sj26, pBK-Sj32 免疫前1 d同位用7.5 g/L盐酸布比卡因50 μl预处理。各组中每种质粒均为 50 μg。
1.6 混合质粒在小鼠肌肉中的存在情况
在免疫小鼠4周后，拉颈处死小鼠，取定位处股四头肌提取DNA，方法参照Sambrook法 [3]。以提取的DNA为模板，特异性引物进行PCR扩增获得各组目的基因片段。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
, 百拇医药
2.1.1重组质粒的PCR鉴定：以目的基因Sj23、Sj26、Sj32的特异性引物分别对重组质粒pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32进行PCR扩增后，在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果可以看出以3个片段的特异性引物分别扩增出分子量约为671、676、1312bp的条带，与Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小相符且与克隆载体pBluescript-Sj23、pBluescript-Sj26、pBluescript-Sj32中PCR扩增的Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小相符。结果见图1。
图1 亚克隆后重组质粒的PCR产物电泳分 析
A: pBS-Sj23 的DNA PCR产物. B: pBS-Sj26 的DNA PCR产物. C: pBS-S j32 的DNA PCR产物. D: PCR 标准分子量. E: pBK-Sj23 的DNA PCR产物. F: pBK-Sj26 的DNA PCR产物. G: pBK-Sj32 的DNA PCR产物
, 百拇医药
2.1.2 重组质粒的限制性内切酶分析：由于Sj26、Sj32引物中设计了XbaⅠ酶切位点, 它与其后的引物序列TC构成了GATC序列，此序列重组入载体，转化菌株XL1-blue后，能 被细菌的甲基化酶甲基化而不再能被XbaⅠ识别，故选择载体多克隆位点中下游酶切位点Kpn Ⅰ进行双酶切。重组质粒分别进行单、双酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。 电泳结果可以看出：pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32的单酶切分子量均大于空载体pBK， 其双酶切的大片段分子量与空载体一致，小片段分子量与从克隆载体pBluescript-Sj23、p Bl uescript-Sj26、pBluescript-Sj32中PCR调出的Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小 相符 。
图2 各抗原分子亚克隆后的酶切图谱分 析
, 百拇医药 A:λDNA/HindⅢ 标准.分子量B:BamHⅠ 酶切pBK产物. C: pBS-Sj23 的DNA PCR产物. D: pBS-Sj26 的DNA PCR产物. E: pBS-Sj32 的DNA PCR产物. F: pBK-Sj23的BamHⅠ及Kpn Ⅰ双酶切产物. G: pBK-Sj23的BamHⅠ单酶切产物. H: pBK-Sj26的BamHI及KpnⅠ双酶切 产物. Ⅰ: pBK-Sj26的BamHI单酶切产物. J: pBK-Sj32的BamHⅠ及KpnⅠ双酶切产物. K: pBK-Sj32的BamHⅠ单酶切产物.
2.1.3 目的基因序列测定：测序结果与Sj23、Sj26、Sj32基因序列一致。
2.2 小鼠肌肉中混合质粒的存在情况
各组小鼠在免疫3周后提取的DNA均能调出相关的目的基因片段，证实混合质粒能在小鼠肌肉 中稳定存在。结果见图3。
, http://www.100md.com
图3 PCR 检测肌肉组织中的混合抗原基 因
A: 标准分子量. B、C:第1组(Sj23、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因S j23、Sj32. D、E: 第2组(Sj26、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因Sj26、Sj32. F、G、 H: 第3组(Sj23、Sj26、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因Sj23、Sj26、Sj32.
3 讨论
裸露DNA技术于1990年偶然发现，由于它避免了亚单位疫苗抗原蛋白繁琐的体外表达，纯 化过程，能使机体的组织细胞自身合成抗原蛋白，引发细胞与体液免疫，而没有毒力回复的 危险性，以及其它一些优点，因此，尽管核酸疫苗的广泛应用有一定争议，各国学者还是热 衷于它的研究。在寄生虫学方面，DNA疫苗研究已经应用于疟疾、利什曼原虫、血吸虫等 [4，5]，其中疟疾DNA疫苗的研究已经试用于人。在血吸虫方面，国外学者较多 研究曼氏血吸虫,国内学者主要致力于日本血吸虫的研究。本室曾构建了单个日本血吸虫抗 原分子的DNA疫苗，在诱导动物的保护性免疫中，这些单个的DNA疫苗可使减虫率达30%～5 0%，具有一定的保护力，但保护力较其它疫苗没有大的提高。Wang[2]曾研究疟疾 多抗原特异性DNA疫苗，证实混合DNA疫苗能诱发机体产生针对各抗原的免疫反应。这在一定 程度上克服了由寄生虫的多形性及机体细胞反应的遗传限制性带来的问题，从而提高免疫效 果。故本室选定已证实具有保护性效力的血吸虫候选疫苗分子23、26、32 kd，在已 克隆的这些抗原分子基础上，将其亚克隆装入真核表达载体后，组成混合多价DNA疫苗，为 进一步观察混合DNA疫苗在血吸虫免疫中的作用奠定了基础。
, 百拇医药
总理预备金血吸虫疫苗研究项目专项资助(No.94-Y-19)
李柳哲，女，1968年生，医学博士
参 考 文 献
1，Dupre L, Poulain-Godefroy O, Ban E et al. Intradermal immunizt ion of rats with plasmid DNA encoding Schistosoma mansoni 28kd glutathione s-tr ansferase. Parasite Immunol， 1997， 19: 505
2，Wang R, Doolan D L, Charoenvit Y et al. Simultaneous induction of mu tiple antigen -specific cytotoxic T lymphocytes in nonhuman primates by immu nization with a mixture of four Plasmodium falciparum DNA plasmids. Infect Imm un，1998，66: 4193
, 百拇医药
3，Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Laboratory Press, 1989. 19～681
4，Gurunathan S, Sacks D L, Brown D R et al. Vaccination with DNA encoding the immunodominant LACK parasite antigen confers protective immunity to mice infected with Leishmania major. J Exp Med，1997，186: 1137
5，Kalinna B H, Becker M M, McManus D P. Engineering and expression of a full length cDNA encoding Schistosoma japonicum paramyosin. purification of t he recombina nt protein and its recognition by infection patient sera. Acta Trop，1997，65: 111
(1999-03-19 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院寄生虫学教研室， 武汉 430030
关键词：混合抗原；DNA疫苗；日本血吸虫
同济医科大学学报000303 摘要 构建日本血吸虫混合DNA疫苗，为今后多抗原特 异性DNA疫苗的研究打下基础。在克隆pBluescript-Sj23、pBluescript-Sj26、pBluescri pt-32的基础上，亚克隆构建了真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32。经过酶 切鉴定，PCR扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠 ，3周后提取小鼠股四头肌DNA，特异性引物扩增获得目的基因。证实重组质粒转入了完整的 日本血吸虫抗原23、26、32 kd基因。且混合质粒能在肌肉组织中稳定存在。建立 了日本血吸虫混合抗原DNA疫苗，为以后的多特异性DNA疫苗进一步研究奠定了基础。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.11, R979.5, R383.2
The Construction of Multi-antigen Mixtu re DNA
Vaccine of Schistosoma Japonicum
Li Liuzhe Shi You′en Liu Jianghua
(Department of Parasitology, School of Basic Medical Sc iences, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The eukaryotic vectors pBK-Sj23，pBK-Sj26 and pBK-S j32 were constructed based on the cloning of vectors pBluescript-Sj23，pBlues- Sj26 and pBluescript-32. After verification, PCR amplification and squencing, the above three antigen pla smids were intramuscularly inoculated with the mixture of varied plasmid to immu nize the mice. Three weeks after immunization, the DNA was isolated from the mic e muscle, and the specific antigen gene was amplified from it by PCR. The result s showed that the target antigen genes including 23 kd, 26 kd and 32 kd were subcloned successfully and the mixture of plasmids could existe stably in m uscular tissue.
, 百拇医药
Key words muti-antigen; DNA vaccine; schistosoma japonicum
近年来已经开展了血吸虫DNA疫苗的研制，并且取得了一定的免疫效果[1] 。尽管D NA疫苗较其他分子疫苗有许多优点，如制作方便,能大量生产等，但其免疫效价没有显著差 异。免疫后减虫率通常在30%～40%。国外有学者报道将多抗原特异性DNA疫苗免疫动物，能诱 发机体产生针对各抗原分子的免疫反应[2]。基于此，本文亚克隆日本血吸虫抗原2 3、26、32 kd基因于真核表达载体中(1 d=0.992 u)，经不同组合后构成多抗原混合疫苗免 疫小鼠，并观察了各组基因疫苗在肌肉中的存在情况，为进一步研究混合多价DNA疫苗打下 了基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
, 百拇医药 TaqDNA聚合酶购自德国宝灵曼公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，BamHⅠ,XbaⅠ等 限制性内切酶购自华美公司，其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2 菌种、质粒及实验小鼠
含质粒pBluescript-Sj23(pBS-Sj23)，pBluescript-Sj26(pBS-Sj26)，pBluescr ipt-Sj32(pBS-Sj32)大肠杆菌TG1菌种由本室保存，含质粒pBK的 XL1-blue菌种，菌 种XL1-blue由本室保存，4周龄昆明种小鼠由同济医大实验动物学部提供。
1.3 真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32 的构建
引物的设计及合成：根据日本血吸虫23、26、32 kd序列及真核表达载体pBK多克隆位点， 分别设计3对引物，序列如下：
, 百拇医药
Sj23：引物1：5′-CGTCTAGACATGGCGACTTTGGGTACT-3′
引物2：5′-CGGGTACCTTAAACATTCTGATAATC-3′
Sj26：引物1：5′-TAAGGATCCCATGTCCCCCTATACTAGG-3′
引物2：5′-AGCTCTAGATCCTCCTTTTGGAGGATGGTCGCC-3′
Sj32：引物1：5′-CTCGGATCCAAGAGAAATAATGTTTTATTC-3′
引物2：5′-CGCTCTAGATCCACCGCAAACTTTCCTGATAACTCC-3′
引物均由上海生工生物公司合成
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真核表达载体pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32的构建： 质粒的小量提取，以质粒为模板进行的目的基因Sj23、Sj26、Sj32的PCR扩增，PCR产物的 纯化，载体与目的基因的双酶切及酶切回收后的连接，感受态细菌的制备，目的基因的转化 ，筛选均参照Sambrook方法[3]。
1.4 重组质粒的鉴定
1.4.1重组质粒的PCR鉴定： 筛选的阳性转化菌落进行质粒的小量制备， 分别以质粒为模板经目的基因Sj23、Sj26、Sj32的 特异性引物进行PCR扩增。
1.4.2 重组质粒的限制性内切酶分析： 阳性转化菌落的质粒小量制备产 物经引物中设计的限制性内切酶位点及质粒的多克隆位点进行酶切分析。
1.4.3 序列测定： 挑选鉴定后亚克隆，按Sanger末端终止法进行DNA测序 。
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1.5 不同抗原DNA疫苗分组免疫小鼠
重组质粒pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32大量制备后，分成以下3组免疫小鼠的股四头 肌： ① pBK-Sj23, pBK-Sj32 ② pBK-Sj26, pBK-Sj32 ③ pBK-Sj23, pBK-Sj26, pBK-Sj32 免疫前1 d同位用7.5 g/L盐酸布比卡因50 μl预处理。各组中每种质粒均为 50 μg。
1.6 混合质粒在小鼠肌肉中的存在情况
在免疫小鼠4周后，拉颈处死小鼠，取定位处股四头肌提取DNA，方法参照Sambrook法 [3]。以提取的DNA为模板，特异性引物进行PCR扩增获得各组目的基因片段。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
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2.1.1重组质粒的PCR鉴定：以目的基因Sj23、Sj26、Sj32的特异性引物分别对重组质粒pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32进行PCR扩增后，在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果可以看出以3个片段的特异性引物分别扩增出分子量约为671、676、1312bp的条带，与Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小相符且与克隆载体pBluescript-Sj23、pBluescript-Sj26、pBluescript-Sj32中PCR扩增的Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小相符。结果见图1。
图1 亚克隆后重组质粒的PCR产物电泳分 析
A: pBS-Sj23 的DNA PCR产物. B: pBS-Sj26 的DNA PCR产物. C: pBS-S j32 的DNA PCR产物. D: PCR 标准分子量. E: pBK-Sj23 的DNA PCR产物. F: pBK-Sj26 的DNA PCR产物. G: pBK-Sj32 的DNA PCR产物
, 百拇医药
2.1.2 重组质粒的限制性内切酶分析：由于Sj26、Sj32引物中设计了XbaⅠ酶切位点, 它与其后的引物序列TC构成了GATC序列，此序列重组入载体，转化菌株XL1-blue后，能 被细菌的甲基化酶甲基化而不再能被XbaⅠ识别，故选择载体多克隆位点中下游酶切位点Kpn Ⅰ进行双酶切。重组质粒分别进行单、双酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。 电泳结果可以看出：pBK-Sj23、pBK-Sj26、pBK-Sj32的单酶切分子量均大于空载体pBK， 其双酶切的大片段分子量与空载体一致，小片段分子量与从克隆载体pBluescript-Sj23、p Bl uescript-Sj26、pBluescript-Sj32中PCR调出的Sj23、Sj26、Sj32基因分子量的大小 相符 。
图2 各抗原分子亚克隆后的酶切图谱分 析
, 百拇医药 A:λDNA/HindⅢ 标准.分子量B:BamHⅠ 酶切pBK产物. C: pBS-Sj23 的DNA PCR产物. D: pBS-Sj26 的DNA PCR产物. E: pBS-Sj32 的DNA PCR产物. F: pBK-Sj23的BamHⅠ及Kpn Ⅰ双酶切产物. G: pBK-Sj23的BamHⅠ单酶切产物. H: pBK-Sj26的BamHI及KpnⅠ双酶切 产物. Ⅰ: pBK-Sj26的BamHI单酶切产物. J: pBK-Sj32的BamHⅠ及KpnⅠ双酶切产物. K: pBK-Sj32的BamHⅠ单酶切产物.
2.1.3 目的基因序列测定：测序结果与Sj23、Sj26、Sj32基因序列一致。
2.2 小鼠肌肉中混合质粒的存在情况
各组小鼠在免疫3周后提取的DNA均能调出相关的目的基因片段，证实混合质粒能在小鼠肌肉 中稳定存在。结果见图3。
, http://www.100md.com
图3 PCR 检测肌肉组织中的混合抗原基 因
A: 标准分子量. B、C:第1组(Sj23、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因S j23、Sj32. D、E: 第2组(Sj26、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因Sj26、Sj32. F、G、 H: 第3组(Sj23、Sj26、Sj32)小鼠肌肉DNA中获得的相关基因Sj23、Sj26、Sj32.
3 讨论
裸露DNA技术于1990年偶然发现，由于它避免了亚单位疫苗抗原蛋白繁琐的体外表达，纯 化过程，能使机体的组织细胞自身合成抗原蛋白，引发细胞与体液免疫，而没有毒力回复的 危险性，以及其它一些优点，因此，尽管核酸疫苗的广泛应用有一定争议，各国学者还是热 衷于它的研究。在寄生虫学方面，DNA疫苗研究已经应用于疟疾、利什曼原虫、血吸虫等 [4，5]，其中疟疾DNA疫苗的研究已经试用于人。在血吸虫方面，国外学者较多 研究曼氏血吸虫,国内学者主要致力于日本血吸虫的研究。本室曾构建了单个日本血吸虫抗 原分子的DNA疫苗，在诱导动物的保护性免疫中，这些单个的DNA疫苗可使减虫率达30%～5 0%，具有一定的保护力，但保护力较其它疫苗没有大的提高。Wang[2]曾研究疟疾 多抗原特异性DNA疫苗，证实混合DNA疫苗能诱发机体产生针对各抗原的免疫反应。这在一定 程度上克服了由寄生虫的多形性及机体细胞反应的遗传限制性带来的问题，从而提高免疫效 果。故本室选定已证实具有保护性效力的血吸虫候选疫苗分子23、26、32 kd，在已 克隆的这些抗原分子基础上，将其亚克隆装入真核表达载体后，组成混合多价DNA疫苗，为 进一步观察混合DNA疫苗在血吸虫免疫中的作用奠定了基础。
, 百拇医药
总理预备金血吸虫疫苗研究项目专项资助(No.94-Y-19)
李柳哲，女，1968年生，医学博士
参 考 文 献
1，Dupre L, Poulain-Godefroy O, Ban E et al. Intradermal immunizt ion of rats with plasmid DNA encoding Schistosoma mansoni 28kd glutathione s-tr ansferase. Parasite Immunol， 1997， 19: 505
2，Wang R, Doolan D L, Charoenvit Y et al. Simultaneous induction of mu tiple antigen -specific cytotoxic T lymphocytes in nonhuman primates by immu nization with a mixture of four Plasmodium falciparum DNA plasmids. Infect Imm un，1998，66: 4193
, 百拇医药
3，Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Laboratory Press, 1989. 19～681
4，Gurunathan S, Sacks D L, Brown D R et al. Vaccination with DNA encoding the immunodominant LACK parasite antigen confers protective immunity to mice infected with Leishmania major. J Exp Med，1997，186: 1137
5，Kalinna B H, Becker M M, McManus D P. Engineering and expression of a full length cDNA encoding Schistosoma japonicum paramyosin. purification of t he recombina nt protein and its recognition by infection patient sera. Acta Trop，1997，65: 111
(1999-03-19 收稿), 百拇医药