加味四逆散对D-氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠体内脂质过 氧化的影响及病理改变同步观察
作者：魏屏 彭汉光 黄坤堂 孙江桥
单位：魏屏 彭汉光(同济医科大学附属协和医院中医科，武汉 430022)；黄坤堂 孙江桥(湖北中医学院国家一级实验中心，武汉 430061)
关键词：加味四逆散；肝损伤；脂质过氧化；病理改变
同济医科大学学报000328 摘要 为研讨加味四逆散防治肝损伤的作用机理，通过动物试验，先用加味四逆散预防给药，再采 用D-氨基半乳糖(D-GalN)造成大鼠急性肝损伤模型，然后检测大鼠血清超氧化物岐化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平，同步观察该方对急性肝损伤大鼠 体内脂质过氧化反应及肝脏病理改变的影响，结果表明该方可明显升高大鼠血清SOD、GSH水 平，降低MDA水平，肝脏病理学检查亦表明该方使肝细胞变性坏死程度减轻。提示加味四逆 散有抗脂质过氧化的作用，这正是该方防治肝损伤的主要机制之一。
, 百拇医药
中图法分类号 R657.3， R361
Effects of Jiaweisinisan on Lipid Pe roxidation of Rat Acute Liver
Injury Induced by D-Galac-tosamise and Patholo gical Changes
Wei Ping
(Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Tongji Medical Universit y, Wuhan 430022)
Peng Hanguang
(Department of Traditional Chinese Medicine, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022)
, http://www.100md.com
Huang Kuntang
(Experimental Center of National Level One, Hubei Traditional Chinese Medica l College, Wuhan 430061)
Abstract To investigate the protective effects of Jiaweisinisa n (JWSNS) on acute liver injury induced by intraperitoneal injection of D-ga lac-tosamise (D-GalN), serum superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) , glutathioe (GSH) contents were measured. The pathological changes of liver wer e observed simultaneously. The results showed that JWSNS could decrease serum MD A content, but increase serum SOD and GSH activities in acute liver injury induc ed by D-GalN. It was also found that JWSNS could alleviate the degeneration and necrosis of the hypatocytes. It was suggested that JWSNS had an effect of anti -lipid peroxidation in liver injury, which was one of the mechanisms of JWSNS p reventing liver injury.
, http://www.100md.com
Key words Jiaweisinisan; liver injury; lipid peroxidation ; pathology
自1993～1998年运用中药加味四逆散(自制加味三草汤合四逆散组成)治疗肝功能损伤患者 ，均获良好疗效 [1]。此种防治肝损伤的药物组方，目前国内外均未见相同的文献 报道。 为研讨该方防治肝损伤的作用机理，通过动物试验，观察该方对急性肝损伤大鼠体内 脂质过氧化反应的影响，并同步观察肝脏病理改变。
1 材料与方法
1.1 药物制备
加味四逆散合剂(由柴胡、积壳、白芍、连翘、白花蛇舌草、虎杖、丹参等13味药组成)， 由同济医科大学附属协和医院制剂室制备，每ml含生药2 g。
1.2 实验动物
, http://www.100md.com
Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重为180～220 g，购自同济医科大学实验动物学部。随机分 成6组：加味四逆散合剂大、中、小剂量组(分别为72 g/kg、36 g/kg、18 g/kg) 、模型组、正常对照组及联苯双脂滴丸组(20.25 mg/kg)，每组有实验动物10只。加 味四逆散合剂大、中、小剂量组及联苯双脂滴丸组预防给药5 d，每d 1次灌胃给药，模型组 和正常对照组分别给同体积蒸馏水。于末次给药后2 h，一次性皮下注射D-氨基半乳糖(D -GalN)600 mg/kg体重，造成大鼠急性肝损伤模型，造模后24 h眼球取血，并断头处死， 取肝组织，制备相应的标本待检。
1.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还 原型谷胱甘肽(GSH)含量测定
采用南京生物工程研究所提供的试剂盒检测。
1.4 肝组织病理学观察
, http://www.100md.com
取新鲜肝组织右叶、10%福尔马林固定作光镜HE染色及病理学观察。
1.5 加味四逆散对小鼠的急性毒性试验
取昆明种小鼠50只，体重(20±2) g，同济医科大学实验动物学部提供，雌雄各半，随机分 成5组，每组10只，通过预试验找出最大致死量为480 g/kg(生药)，最小致死量为196.6 g/kg(生药)，由480 g/kg(生药)开始，按1∶0.80比例用蒸馏水等比稀释，灌胃给药 ，给药体积为0.4 ml/kg，2次/d(间隔3 h)，后连续观察7 d，记录小鼠反应，用Bl iss法计算小鼠的半数致死量。
2 结果
加味四逆散对D-GalN所致肝损伤大鼠血清SOD，MDA及GSH的影响结果，见表1。
表1提示SOD水平：模型组低于正常组(P<0.01)、四逆散大、中、小剂量组均高 于模型组(P<0.01、P<0.05)，MDA水平：模型组高于正常对照组(P<0.05 ) ；加味四逆散大剂量组低于模型组(P<0.05)；中小剂量组亦有不同程度降低，但无显 著性差异；GSH水平：模型组较正常组低(P<0.01)，四逆散大、中、小剂量组均较模 型组高(均为P<0.01)。
, http://www.100md.com
正常组大鼠肝组织无病理改变；模型组肝细胞发生广泛的水样变性，胞浆疏松及混浊肿胀， 肝细胞可见点状和灶状坏死，可见核碎裂，嗜酸小体及脂肪变，汇管区炎性细胞浸润。加味 四逆散大剂量组及联苯双脂组仅个别肝细胞出现浊肿，基本接近正常组，中、小剂量组肝细 胞变性坏死程度较造模组轻，汇管区可见少量炎性细胞浸润。用Bliss 法计算小鼠的半数致 死量LD50为(305.80±32.55) g/kg，相当于成人(70 kg)每d口服生药剂量的19 2～214倍，表明该剂口服安全性较大。
表1 加味四逆散对D-Ga1N所致急性肝损伤大鼠血清中SOD，MDA及GSH的影响(
±s，n=10) 组 别
剂量(g/kg)
SOD (NU/ml)
, 百拇医药
MDA (nmol/ml)
GSH (mg/L)
正常组
-
450.61±24.04
9.04±2.87
20.03±5.83
模型组
-
264.98±85.79
14.56±4.38
, 百拇医药
6.78±5.30**
大剂量组
72
437.89±40.81△△
9.38±2.93△
16.66±4.01△△
中剂量组
36
416.45±36.66△△
11.07±4.21
15.95±2.76△△
, 百拇医药
小剂量组
18
324.59±64.69△
12.27±2.88
12.23±4.54△△
联苯双脂组
0.02
377.66±52.62△△
9.88±2.58△
17.25±3.15△△
, 百拇医药 与正常组比较 * P<0.05 ** P<0.01；与模型组比较 △ P<0.05 △△ P<0.013 讨论
四逆散出自张仲景《伤寒论》经方，章虚谷云：“……故以柴胡升少阳之清，枳实降阳明之 浊，芍药，甘草调和肝脾，升降既顺，阳气既伸，即亦透发，自当再清其邪……。”我省已故名老中医张梦侬就常用四逆散加味化裁治疗急性肝损伤疾病，本文将加味三草汤( 白花蛇舌草、夏枯草、甘草、连翘、丹参等)合四逆散组合成加味四逆散。现代研究表明， 肝损伤中医病因机制，主要是由于邪毒内侵，肝失疏泄，致气血运行不畅所致，因此，肝损 伤的中医治则以“疏肝解郁，活血解毒”为治疗大纲，加味四逆散正是基于以上认识而确立 。研究表明[2]由柴胡、枳壳、白芍、甘草组成的四逆散具有显著的保肝利胆作用 。甘草 可使CCl4所致大鼠肝脏的变性坏死显著减轻，肝细胞内糖元RNA恢复，血清ALT降低。白芍 提 取药对大鼠黄曲霉素B1(AFB1)急性中毒具有保护作用，能明显阻止AFB1引起的大白鼠血清 ALT、AST升高。 丹参具有明显降低急慢性肝损伤动物血清ALT活力，减少急性肝损伤的肝组 织甘油三酯的含量，降低γ-球蛋白的作用。连翘清热，其果皮含有齐墩果酸，具有较好的 抗肝损伤作用，可明显降低CCl4所致的肝脏变性和坏死。白花蛇舌草清热解毒，对HBsAg 具有抑制作用，可减轻肝细胞的浊肿及变性程度。
, 百拇医药
大量研究表明，自由基参与许多基本生命过程，如生物氧化、细胞增殖、机体衰老等，自由 基反应是引起许多疾病和机体损伤的分子病理基础，其致损伤机制主要是自由基引起的生物 膜脂质过氧化。D-GalN致肝细胞损伤的主要机制是由于自由基及其启动的脂质过氧化连锁 反应。SOD是超氧阳离子自由基的清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，肝细胞受 到自由基攻击时，SOD可因其耗竭而减少。在脂质过氧化反应过程中，不饱和脂肪酸氧化分 解释放反应性醛如MDA、4-羟壬烯(4-HNE)，测定MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的 程度，间接反映出机体组织、细胞损伤的程度。脂质过氧化反应使GSH含量降低，使机体解 毒能力降低，增加了肝细胞对损伤因子的敏感性，使细胞膜结构易受损伤[2～6]。 本实验研究提示加味四逆散可明显升高D-GalN所致急性肝损伤大鼠血清SOD、GSH水平，降 低MDA水平，即该方有抗脂质过氧化的作用，抗脂质过氧化正是本方防治肝损伤的主要机制 之一。同步观察肝组织病理变化，加味四逆散使肝细胞变性坏死程度减轻，特别是大剂量组 仅个别肝细胞出现浊肿，基本接近正常。病理学亦提示该方可改善肝组织损伤。
, 百拇医药
目前国内外肝损伤的发病率较高，临床上真正有确切疗效的护肝药并不多，因而迫切需要寻 求无毒，护肝疗效可靠且无反跳的中药制剂，加味四逆散在防治肝损伤的动物实验和临床应 用中都取得了满意效果，且低毒安全，故其应用和推广的前景广泛。本实验主要从抗脂质过 氧化，改善肝组织病变等方面探讨了加味四逆散抗肝损伤的作用机理，但本方抗肝损伤的作 用机制也许是多方面的综合作用。
魏屏，女，1958年生，副主任医师
参 考 文 献
1，彭汉光，魏 屏，蔡淑清等. 加味四逆散治疗肝损伤63例临床研究，湖北 中医杂志，1999，21(10)：448
2，王伯祥主编. 中医肝胆病学. 北京：中国医学科技出版社， 1993.77,93,9 6,123,140
3，顾长海，王宇明主编. 急性肝衰竭.成都：四川科学技术出版社，1997.88～95
, http://www.100md.com
4，Feher J, Pollak B, Sreter L et al. Biochemical markers in carbon -te trachloride and galactosamine-induced acute liver injuries: the effects of dihy dro-quinoline-type antioxidants. Br J Exp Path, 1982, 63:394
5，赵志泉，徐顺福，陈国兴等. 休克/再灌注肝损伤中氧自由基的作用. 中华消 化杂志，1994，14(2):82
6，王 红，陈在忠.脂质过氧化与肝纤维化. 国外医学临床生物化学与检验学分 册，1998，19(3):138
(2000-01-27 收稿), http://www.100md.com
单位：魏屏 彭汉光(同济医科大学附属协和医院中医科，武汉 430022)；黄坤堂 孙江桥(湖北中医学院国家一级实验中心，武汉 430061)
关键词：加味四逆散；肝损伤；脂质过氧化；病理改变
同济医科大学学报000328 摘要 为研讨加味四逆散防治肝损伤的作用机理，通过动物试验，先用加味四逆散预防给药，再采 用D-氨基半乳糖(D-GalN)造成大鼠急性肝损伤模型，然后检测大鼠血清超氧化物岐化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平，同步观察该方对急性肝损伤大鼠 体内脂质过氧化反应及肝脏病理改变的影响，结果表明该方可明显升高大鼠血清SOD、GSH水 平，降低MDA水平，肝脏病理学检查亦表明该方使肝细胞变性坏死程度减轻。提示加味四逆 散有抗脂质过氧化的作用，这正是该方防治肝损伤的主要机制之一。
, 百拇医药
中图法分类号 R657.3， R361
Effects of Jiaweisinisan on Lipid Pe roxidation of Rat Acute Liver
Injury Induced by D-Galac-tosamise and Patholo gical Changes
Wei Ping
(Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Tongji Medical Universit y, Wuhan 430022)
Peng Hanguang
(Department of Traditional Chinese Medicine, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022)
, http://www.100md.com
Huang Kuntang
(Experimental Center of National Level One, Hubei Traditional Chinese Medica l College, Wuhan 430061)
Abstract To investigate the protective effects of Jiaweisinisa n (JWSNS) on acute liver injury induced by intraperitoneal injection of D-ga lac-tosamise (D-GalN), serum superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) , glutathioe (GSH) contents were measured. The pathological changes of liver wer e observed simultaneously. The results showed that JWSNS could decrease serum MD A content, but increase serum SOD and GSH activities in acute liver injury induc ed by D-GalN. It was also found that JWSNS could alleviate the degeneration and necrosis of the hypatocytes. It was suggested that JWSNS had an effect of anti -lipid peroxidation in liver injury, which was one of the mechanisms of JWSNS p reventing liver injury.
, http://www.100md.com
Key words Jiaweisinisan; liver injury; lipid peroxidation ; pathology
自1993～1998年运用中药加味四逆散(自制加味三草汤合四逆散组成)治疗肝功能损伤患者 ，均获良好疗效 [1]。此种防治肝损伤的药物组方，目前国内外均未见相同的文献 报道。 为研讨该方防治肝损伤的作用机理，通过动物试验，观察该方对急性肝损伤大鼠体内 脂质过氧化反应的影响，并同步观察肝脏病理改变。
1 材料与方法
1.1 药物制备
加味四逆散合剂(由柴胡、积壳、白芍、连翘、白花蛇舌草、虎杖、丹参等13味药组成)， 由同济医科大学附属协和医院制剂室制备，每ml含生药2 g。
1.2 实验动物
, http://www.100md.com
Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重为180～220 g，购自同济医科大学实验动物学部。随机分 成6组：加味四逆散合剂大、中、小剂量组(分别为72 g/kg、36 g/kg、18 g/kg) 、模型组、正常对照组及联苯双脂滴丸组(20.25 mg/kg)，每组有实验动物10只。加 味四逆散合剂大、中、小剂量组及联苯双脂滴丸组预防给药5 d，每d 1次灌胃给药，模型组 和正常对照组分别给同体积蒸馏水。于末次给药后2 h，一次性皮下注射D-氨基半乳糖(D -GalN)600 mg/kg体重，造成大鼠急性肝损伤模型，造模后24 h眼球取血，并断头处死， 取肝组织，制备相应的标本待检。
1.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还 原型谷胱甘肽(GSH)含量测定
采用南京生物工程研究所提供的试剂盒检测。
1.4 肝组织病理学观察
, http://www.100md.com
取新鲜肝组织右叶、10%福尔马林固定作光镜HE染色及病理学观察。
1.5 加味四逆散对小鼠的急性毒性试验
取昆明种小鼠50只，体重(20±2) g，同济医科大学实验动物学部提供，雌雄各半，随机分 成5组，每组10只，通过预试验找出最大致死量为480 g/kg(生药)，最小致死量为196.6 g/kg(生药)，由480 g/kg(生药)开始，按1∶0.80比例用蒸馏水等比稀释，灌胃给药 ，给药体积为0.4 ml/kg，2次/d(间隔3 h)，后连续观察7 d，记录小鼠反应，用Bl iss法计算小鼠的半数致死量。
2 结果
加味四逆散对D-GalN所致肝损伤大鼠血清SOD，MDA及GSH的影响结果，见表1。
表1提示SOD水平：模型组低于正常组(P<0.01)、四逆散大、中、小剂量组均高 于模型组(P<0.01、P<0.05)，MDA水平：模型组高于正常对照组(P<0.05 ) ；加味四逆散大剂量组低于模型组(P<0.05)；中小剂量组亦有不同程度降低，但无显 著性差异；GSH水平：模型组较正常组低(P<0.01)，四逆散大、中、小剂量组均较模 型组高(均为P<0.01)。
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正常组大鼠肝组织无病理改变；模型组肝细胞发生广泛的水样变性，胞浆疏松及混浊肿胀， 肝细胞可见点状和灶状坏死，可见核碎裂，嗜酸小体及脂肪变，汇管区炎性细胞浸润。加味 四逆散大剂量组及联苯双脂组仅个别肝细胞出现浊肿，基本接近正常组，中、小剂量组肝细 胞变性坏死程度较造模组轻，汇管区可见少量炎性细胞浸润。用Bliss 法计算小鼠的半数致 死量LD50为(305.80±32.55) g/kg，相当于成人(70 kg)每d口服生药剂量的19 2～214倍，表明该剂口服安全性较大。
表1 加味四逆散对D-Ga1N所致急性肝损伤大鼠血清中SOD，MDA及GSH的影响(
±s，n=10) 组 别剂量(g/kg)
SOD (NU/ml)
, 百拇医药
MDA (nmol/ml)
GSH (mg/L)
正常组
-
450.61±24.04
9.04±2.87
20.03±5.83
模型组
-
264.98±85.79
14.56±4.38
, 百拇医药
6.78±5.30**
大剂量组
72
437.89±40.81△△
9.38±2.93△
16.66±4.01△△
中剂量组
36
416.45±36.66△△
11.07±4.21
15.95±2.76△△
, 百拇医药
小剂量组
18
324.59±64.69△
12.27±2.88
12.23±4.54△△
联苯双脂组
0.02
377.66±52.62△△
9.88±2.58△
17.25±3.15△△
, 百拇医药 与正常组比较 * P<0.05 ** P<0.01；与模型组比较 △ P<0.05 △△ P<0.013 讨论
四逆散出自张仲景《伤寒论》经方，章虚谷云：“……故以柴胡升少阳之清，枳实降阳明之 浊，芍药，甘草调和肝脾，升降既顺，阳气既伸，即亦透发，自当再清其邪……。”我省已故名老中医张梦侬就常用四逆散加味化裁治疗急性肝损伤疾病，本文将加味三草汤( 白花蛇舌草、夏枯草、甘草、连翘、丹参等)合四逆散组合成加味四逆散。现代研究表明， 肝损伤中医病因机制，主要是由于邪毒内侵，肝失疏泄，致气血运行不畅所致，因此，肝损 伤的中医治则以“疏肝解郁，活血解毒”为治疗大纲，加味四逆散正是基于以上认识而确立 。研究表明[2]由柴胡、枳壳、白芍、甘草组成的四逆散具有显著的保肝利胆作用 。甘草 可使CCl4所致大鼠肝脏的变性坏死显著减轻，肝细胞内糖元RNA恢复，血清ALT降低。白芍 提 取药对大鼠黄曲霉素B1(AFB1)急性中毒具有保护作用，能明显阻止AFB1引起的大白鼠血清 ALT、AST升高。 丹参具有明显降低急慢性肝损伤动物血清ALT活力，减少急性肝损伤的肝组 织甘油三酯的含量，降低γ-球蛋白的作用。连翘清热，其果皮含有齐墩果酸，具有较好的 抗肝损伤作用，可明显降低CCl4所致的肝脏变性和坏死。白花蛇舌草清热解毒，对HBsAg 具有抑制作用，可减轻肝细胞的浊肿及变性程度。
, 百拇医药
大量研究表明，自由基参与许多基本生命过程，如生物氧化、细胞增殖、机体衰老等，自由 基反应是引起许多疾病和机体损伤的分子病理基础，其致损伤机制主要是自由基引起的生物 膜脂质过氧化。D-GalN致肝细胞损伤的主要机制是由于自由基及其启动的脂质过氧化连锁 反应。SOD是超氧阳离子自由基的清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，肝细胞受 到自由基攻击时，SOD可因其耗竭而减少。在脂质过氧化反应过程中，不饱和脂肪酸氧化分 解释放反应性醛如MDA、4-羟壬烯(4-HNE)，测定MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的 程度，间接反映出机体组织、细胞损伤的程度。脂质过氧化反应使GSH含量降低，使机体解 毒能力降低，增加了肝细胞对损伤因子的敏感性，使细胞膜结构易受损伤[2～6]。 本实验研究提示加味四逆散可明显升高D-GalN所致急性肝损伤大鼠血清SOD、GSH水平，降 低MDA水平，即该方有抗脂质过氧化的作用，抗脂质过氧化正是本方防治肝损伤的主要机制 之一。同步观察肝组织病理变化，加味四逆散使肝细胞变性坏死程度减轻，特别是大剂量组 仅个别肝细胞出现浊肿，基本接近正常。病理学亦提示该方可改善肝组织损伤。
, 百拇医药
目前国内外肝损伤的发病率较高，临床上真正有确切疗效的护肝药并不多，因而迫切需要寻 求无毒，护肝疗效可靠且无反跳的中药制剂，加味四逆散在防治肝损伤的动物实验和临床应 用中都取得了满意效果，且低毒安全，故其应用和推广的前景广泛。本实验主要从抗脂质过 氧化，改善肝组织病变等方面探讨了加味四逆散抗肝损伤的作用机理，但本方抗肝损伤的作 用机制也许是多方面的综合作用。
魏屏，女，1958年生，副主任医师
参 考 文 献
1，彭汉光，魏 屏，蔡淑清等. 加味四逆散治疗肝损伤63例临床研究，湖北 中医杂志，1999，21(10)：448
2，王伯祥主编. 中医肝胆病学. 北京：中国医学科技出版社， 1993.77,93,9 6,123,140
3，顾长海，王宇明主编. 急性肝衰竭.成都：四川科学技术出版社，1997.88～95
, http://www.100md.com
4，Feher J, Pollak B, Sreter L et al. Biochemical markers in carbon -te trachloride and galactosamine-induced acute liver injuries: the effects of dihy dro-quinoline-type antioxidants. Br J Exp Path, 1982, 63:394
5，赵志泉，徐顺福，陈国兴等. 休克/再灌注肝损伤中氧自由基的作用. 中华消 化杂志，1994，14(2):82
6，王 红，陈在忠.脂质过氧化与肝纤维化. 国外医学临床生物化学与检验学分 册，1998，19(3):138
(2000-01-27 收稿), http://www.100md.com