海燕组织中海星皂甙的分布及溶血指数的测定
作者：郭承华 张恒云 刘丽娟
单位：郭承华 张恒云(烟台大学生化系 烟台 264005)；刘丽娟(黑龙江省生化药品技术开发中心)
关键词：海燕，海星总皂甙，组织，分布，活性
中国海洋药物000304 摘 要 采用甲醇法从黄海产海燕各组织中提取了海星总皂甙，产品经理化实验，溶血实验，紫外光谱，红外光谱的分析鉴定，证明提取物为海星总皂甙。海燕的供试组织内均含有海星总皂甙，各组织的溶血性能按以下顺序依次递减：胃、幽门盲囊、体壁和生殖腺，这些组织的海星总皂甙产率分别为0.061%、0.045%、0.029%、和0.000%。且由溶血实验得出不同组织中海星总皂甙的分布及溶血活性大小不同。海燕海星总皂甙的熔点为242℃～255℃。
DISTRIBUTION AND HEMOLYTIC INDEX OF ASTEROSAPONIN IN THE DIFFERENT TISSUES OF ASTERINA PECTINIFEAR
, http://www.100md.com
Guo Chenghua
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
Zhang Hengyun
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
Liu Lijuan
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
ABSTRACT Asterosaponin of Asterina pectinifera collected at the coast of Yangma island in Huanghai was prepared by extration of four tissues with methanol, respectively. Data of the physical and chemical test,hemolytic test,as well as UV and IR analysis showed that the extracts were asterosaponin and the hemolytic test showed the different distribution and hemolytic activity of asterosaponin from different tissues.Asterosaponin's melting point ranged from 242℃ to 255℃.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Asterina pectinifera,asterosaponin,tissues,distribution,activity
海燕Asterina pectinifera Muller Troschel)为海星纲棘皮动物之一，是我国北方沿海很普遍的一种海星，尤其在黄海有大量分布。它生活时反口面隆起为深蓝色和丹红色交错排列，但变异很大，从完全深蓝到完全丹红色，口面为桔红色。生活在沿岸浅海的沙底，贝壳底和岩礁底。有时栖息密度相当大，1平方米可达7个，繁殖季节在6～7月间。海星纲动物资源非常丰富，数量很大，种类繁多，世界上已报道过的种类约1,200种，在我国也有100多种，有药用开发价值的海星很多[1]。迄今为止，各国研究人员已相继从海燕及各种海星体内获得了十几类具有生理活性的化学物质[2]，其中海星皂甙为高度表面活性剂，大都具有极强的溶血性，它不但具有抗癌、抗菌及抗炎活性，而且还具有持续降压等多种作用[3]。动物界所含皂甙目前仅存在于海洋的棘皮动物门中，特别是海参纲和海星纲，对黄海产海燕各组织海星皂甙的分布及活性研究未见报道。为了在开发利用海星资源方面提供理论依据，我们对分布在黄海海域的海燕的各组织进行了海星皂甙的分布及活性研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
黄海产海燕，1999年5月16日采自烟台牟平区养马岛潮上带(岩石及岩石缝中)。新鲜时洗净泥沙，解剖出95个海燕体内的生殖腺、胃、幽门盲囊及体壁，连并27个整体一起烘干，备用。
1.1 海星皂甙的提取方法
将烘干后的整体和各组织粉碎。生殖腺总重为17.1g，胃16.5g，幽门盲囊49g，体壁及整体量较多，以体壁为例，海星皂甙的提取方法如下(甲醇法)[4]：
(1)称取100g海燕体壁粉末，分别用300mL,200mL,100mL甲醇提取，每次搅拌提取30min。
(2)合并3次提取液，用滤纸过滤到三口瓶中，真空浓缩到50ml。
(3)加50mL蒸馏水(等体积)稀释，用2倍体积的50%甲醇饱和的苯脱脂(200mL苯加入20mL50%甲醇)18h。
, 百拇医药
(4)脱脂后的水层(下层)用0.1mol.L-1盐酸调pH3.0(用0.1mol.L-1的氢氧化钠中和)，用流动的自来水透析6h。
(5)透析液用1/2体积的正丁醇(150mL正丁醇加10mL水)提取3次。
(6)合并上层液，真空浓缩至一定体积，加10倍体积的丙酮，待沉淀出现。
(7)离心沉淀，干燥，至恒重后称重。
其他组织中海星皂甙的提取方法与此法相同，根据材料质量确定各有机溶剂的用量。
1.2 海星皂甙的分析鉴定
1.2.1主要分析及测定仪器 IR-810红外分光度计(日本分光公司)，U-3400紫外可见近红外分光光度计(日本日立公司)，XTR-1型显微熔点测定仪(北京电光科学仪器厂)。
, 百拇医药
1.2.2 溶血实验 参照Fujita和Nishimoto方法[5]进行，同时以标准皂甙(Serva进口分装，北京化工厂)的溶血指数(hemolytic index,HI)作参考，海星皂甙的含量及纯度以每克试样溶血指数(HI.g-1)表示。溶血实验方法如下：
(1)配制等渗力磷酸盐缓冲液 称取Na2HPO4 16g,NaH2PO4 4.4g,用蒸馏水溶解并稀释定容至1000ml (pH7.4)。
(2)血液悬浮液的制备 从家兔耳缘静脉抽取1份体积的血液，加0.1份体积的血液，加0.1份体积的柠檬酸钠溶液和1分体积的磷酸盐缓冲液，用玻璃搅拌以防凝固，然后追加缓冲液至总体积(50份)，即得2%血液悬浮液。
(3)检液 精确称取0.1～0.15g干燥后待检样品，逐渐加入缓冲并定容至100ml(即为所检生药的百分数%，P值)。上述缓冲液配制成0.01%～0.015%的溶液。
, 百拇医药
(4)测定方法 取洁净的小试管10支，按照0.05mL递增量依次加入0.3～0.7mL检深，然后每管分别补加相应量的缓冲液，使各试管内的体积均为1mL。边振荡边加入1mL血液悬浮液，使各管体积达到2mL。加完后轻摇15min以使其完全混合(摇动过程中避免产生泡沫)，置室温下(15℃～20℃)静置。按照同样的方法，向对照试验溶液中加入血液悬浮液进行测定。
结果的读数以完全溶血(管底无血球存在，显微镜下检测)到部分溶血表示，用最后一支完全溶血的试管内检品的稀释浓度计算溶血指数(HI)，计算公式如下：
V——试管内的总量(mL)
P——检液中的生药百分数(%)
S——所用检液量(mL)
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2 结果与讨论
2.1 甲醇法提取海燕供试组织中海星总皂甙的产量及产率表中结果为两次实验的平均值(The data reported in Table 1 were the average value of two tests)。
表1 海燕供试组织中海星皂甙的产量及产率
Table 1.Yield and recovery of total asterosaponin in the different organs of Asterina pectinifera
组织
Tissues
材料总重(g)
Weight of
, 百拇医药
materials(g)
总皂甙产量(g)
Total solids(g)
产率(%)
Recovery of total
asterosaponin(%)
胃(Stomach)
8
0.049
0.061
生殖腺(Gonad)
, http://www.100md.com 8
0.000
0.000
幽门盲囊(Pyloric sac)
20
0.091
0.045
体壁(Body wall)
100
0.029
0.029
由表1可看出海燕供试组织中海星皂甙的分布不同，其中胃中海星皂甙分布较多，幽门盲囊、体壁及生殖腺中依次递减。因此就提取海星皂甙而言，海燕供试组织中胃有较大的利用价值，可作为生理活动物质海星皂甙的主要来源。生殖腺中海星皂甙未见分布可能与所用材料的季节有关。
, http://www.100md.com
2.2 海燕供试组织中海星皂甙的溶血指数比较表2 海燕供试组织中海星皂甙的溶血指数(HI)
Table 2.The H.I.and H.I.per gram of asterosaponin in the different organs of Asterina pectinifera
组织
Tissues
溶解试样(g)
Dissolved
sample(g)
每克皂甙
溶血指数
, 百拇医药
HI.g-1
总溶血指数
Total HI
胃(Stomach)
0.049
4,535
222
生殖腺(Gonad)
0.000
0
0
幽门盲囊(Pyloric sac)
, http://www.100md.com
0.091
3,390
309
体壁(Body wall)
0.029
2,296
67
表中结果为两次实验的平均值，标准皂甙的HI.g-1为34722(The data reporoed in Table 2 were average value of two tests.The HI.g-1 of standard saponin were 34722)。
, http://www.100md.com
由表2可以看出，海燕各不同组织中所含海星皂甙溶血指数不同，其溶血指数大小依次为胃、幽门盲囊、体壁和生殖腺，从而总HI来看，各组织中海星皂甙的溶血活性大小依次为幽门盲囊、胃、体壁和生殖腺。各不同组织中所含海星皂甙HI不同亦是在实践中利用具体组织时所要考虑的重要因素之一。
2.2 海星皂甙的理化性质
从黄海产海燕供试组织中提取的海星皂甙为淡黄色至黄绿色，其水溶液振荡时可产生持久的泡沫反应，微量的皂甙即能使家兔血液产生溶血作用；海星皂甙可溶于水，甲醇(含水乙醇)，正丁醇，其溶解度依次增大；该产品不溶于苯，醚，丙酮等有机溶剂。其熔点为242℃～255℃，熔距相差较大的原因可能与组织中所制备的海星总皂甙的纯度及其组分有关。样品溶于缓冲液，该溶液在244nm处有弱的紫外特征吸收峰(图1)，通过红外光谱测定观察(图2)，样品与标准皂甙在2450、2950、1650，1060cm-1处有相似峰形的吸收峰。与郭承华、Hashimoto Y[4，6]的结果吻合。
, 百拇医药
从海星皂甙的测定结果可以看出，通过比较黄海产海燕中海星皂甙与标准皂甙的紫外及红外吸收图谱，可初步确定二者有相似的化学结构。
图1 海星皂甙的紫外吸收曲线
a 标准皂甙 b 海燕组织中皂甙
图2 海星皂甙的红外吸收曲线
a 标准皂甙 b 海燕组织中皂甙
致谢 烟台大学分析中心荆济荣老师协助紫外及红外光谱测定，应用化学系赵岩老师协助显微点测定，生物化学系鞠宝老师帮助文稿整理，特此一并致谢。
, 百拇医药 山东省教委课题号：J00H07
参考文献
1，廖玉林，孙松.我国药用棘皮动物——海星纲.海洋药物杂志，1988，1～2：61
2，王唯玮.海星的生理药理活性物质.海洋药物杂志，1986，4：46
3，郭承华，康桂敏.海星纲动物天然活性物质研究概况.中国动物科学研究，北京：中国林业出版社，1999，1046
4，郭承华，刘传琳，张传钦，砂海星海星皂甙的制备.中国海洋药物，1997，1：36
5，Fujita M,Nishimoto K,1952，On the biological of Japanese senega.J Pharm Soc Japan， 72:1645
6，Hashimoto Y,Yasumoto T,Confirmation of saponin as a toxic principle of starfish.Bull Jap Soc Fish，.1960,26(11):1132, http://www.100md.com
单位：郭承华 张恒云(烟台大学生化系 烟台 264005)；刘丽娟(黑龙江省生化药品技术开发中心)
关键词：海燕，海星总皂甙，组织，分布，活性
中国海洋药物000304 摘 要 采用甲醇法从黄海产海燕各组织中提取了海星总皂甙，产品经理化实验，溶血实验，紫外光谱，红外光谱的分析鉴定，证明提取物为海星总皂甙。海燕的供试组织内均含有海星总皂甙，各组织的溶血性能按以下顺序依次递减：胃、幽门盲囊、体壁和生殖腺，这些组织的海星总皂甙产率分别为0.061%、0.045%、0.029%、和0.000%。且由溶血实验得出不同组织中海星总皂甙的分布及溶血活性大小不同。海燕海星总皂甙的熔点为242℃～255℃。
DISTRIBUTION AND HEMOLYTIC INDEX OF ASTEROSAPONIN IN THE DIFFERENT TISSUES OF ASTERINA PECTINIFEAR
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Guo Chenghua
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
Zhang Hengyun
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
Liu Lijuan
(Biochemistry Depertment of Yantai University,Yantai 264005)
ABSTRACT Asterosaponin of Asterina pectinifera collected at the coast of Yangma island in Huanghai was prepared by extration of four tissues with methanol, respectively. Data of the physical and chemical test,hemolytic test,as well as UV and IR analysis showed that the extracts were asterosaponin and the hemolytic test showed the different distribution and hemolytic activity of asterosaponin from different tissues.Asterosaponin's melting point ranged from 242℃ to 255℃.
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KEY WORDS Asterina pectinifera,asterosaponin,tissues,distribution,activity
海燕Asterina pectinifera Muller Troschel)为海星纲棘皮动物之一，是我国北方沿海很普遍的一种海星，尤其在黄海有大量分布。它生活时反口面隆起为深蓝色和丹红色交错排列，但变异很大，从完全深蓝到完全丹红色，口面为桔红色。生活在沿岸浅海的沙底，贝壳底和岩礁底。有时栖息密度相当大，1平方米可达7个，繁殖季节在6～7月间。海星纲动物资源非常丰富，数量很大，种类繁多，世界上已报道过的种类约1,200种，在我国也有100多种，有药用开发价值的海星很多[1]。迄今为止，各国研究人员已相继从海燕及各种海星体内获得了十几类具有生理活性的化学物质[2]，其中海星皂甙为高度表面活性剂，大都具有极强的溶血性，它不但具有抗癌、抗菌及抗炎活性，而且还具有持续降压等多种作用[3]。动物界所含皂甙目前仅存在于海洋的棘皮动物门中，特别是海参纲和海星纲，对黄海产海燕各组织海星皂甙的分布及活性研究未见报道。为了在开发利用海星资源方面提供理论依据，我们对分布在黄海海域的海燕的各组织进行了海星皂甙的分布及活性研究。
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1 材料与方法
黄海产海燕，1999年5月16日采自烟台牟平区养马岛潮上带(岩石及岩石缝中)。新鲜时洗净泥沙，解剖出95个海燕体内的生殖腺、胃、幽门盲囊及体壁，连并27个整体一起烘干，备用。
1.1 海星皂甙的提取方法
将烘干后的整体和各组织粉碎。生殖腺总重为17.1g，胃16.5g，幽门盲囊49g，体壁及整体量较多，以体壁为例，海星皂甙的提取方法如下(甲醇法)[4]：
(1)称取100g海燕体壁粉末，分别用300mL,200mL,100mL甲醇提取，每次搅拌提取30min。
(2)合并3次提取液，用滤纸过滤到三口瓶中，真空浓缩到50ml。
(3)加50mL蒸馏水(等体积)稀释，用2倍体积的50%甲醇饱和的苯脱脂(200mL苯加入20mL50%甲醇)18h。
, 百拇医药
(4)脱脂后的水层(下层)用0.1mol.L-1盐酸调pH3.0(用0.1mol.L-1的氢氧化钠中和)，用流动的自来水透析6h。
(5)透析液用1/2体积的正丁醇(150mL正丁醇加10mL水)提取3次。
(6)合并上层液，真空浓缩至一定体积，加10倍体积的丙酮，待沉淀出现。
(7)离心沉淀，干燥，至恒重后称重。
其他组织中海星皂甙的提取方法与此法相同，根据材料质量确定各有机溶剂的用量。
1.2 海星皂甙的分析鉴定
1.2.1主要分析及测定仪器 IR-810红外分光度计(日本分光公司)，U-3400紫外可见近红外分光光度计(日本日立公司)，XTR-1型显微熔点测定仪(北京电光科学仪器厂)。
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1.2.2 溶血实验 参照Fujita和Nishimoto方法[5]进行，同时以标准皂甙(Serva进口分装，北京化工厂)的溶血指数(hemolytic index,HI)作参考，海星皂甙的含量及纯度以每克试样溶血指数(HI.g-1)表示。溶血实验方法如下：
(1)配制等渗力磷酸盐缓冲液 称取Na2HPO4 16g,NaH2PO4 4.4g,用蒸馏水溶解并稀释定容至1000ml (pH7.4)。
(2)血液悬浮液的制备 从家兔耳缘静脉抽取1份体积的血液，加0.1份体积的血液，加0.1份体积的柠檬酸钠溶液和1分体积的磷酸盐缓冲液，用玻璃搅拌以防凝固，然后追加缓冲液至总体积(50份)，即得2%血液悬浮液。
(3)检液 精确称取0.1～0.15g干燥后待检样品，逐渐加入缓冲并定容至100ml(即为所检生药的百分数%，P值)。上述缓冲液配制成0.01%～0.015%的溶液。
, 百拇医药
(4)测定方法 取洁净的小试管10支，按照0.05mL递增量依次加入0.3～0.7mL检深，然后每管分别补加相应量的缓冲液，使各试管内的体积均为1mL。边振荡边加入1mL血液悬浮液，使各管体积达到2mL。加完后轻摇15min以使其完全混合(摇动过程中避免产生泡沫)，置室温下(15℃～20℃)静置。按照同样的方法，向对照试验溶液中加入血液悬浮液进行测定。
结果的读数以完全溶血(管底无血球存在，显微镜下检测)到部分溶血表示，用最后一支完全溶血的试管内检品的稀释浓度计算溶血指数(HI)，计算公式如下：
V——试管内的总量(mL)
P——检液中的生药百分数(%)
S——所用检液量(mL)
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2 结果与讨论
2.1 甲醇法提取海燕供试组织中海星总皂甙的产量及产率表中结果为两次实验的平均值(The data reported in Table 1 were the average value of two tests)。
表1 海燕供试组织中海星皂甙的产量及产率
Table 1.Yield and recovery of total asterosaponin in the different organs of Asterina pectinifera
组织
Tissues
材料总重(g)
Weight of
, 百拇医药
materials(g)
总皂甙产量(g)
Total solids(g)
产率(%)
Recovery of total
asterosaponin(%)
胃(Stomach)
8
0.049
0.061
生殖腺(Gonad)
, http://www.100md.com 8
0.000
0.000
幽门盲囊(Pyloric sac)
20
0.091
0.045
体壁(Body wall)
100
0.029
0.029
由表1可看出海燕供试组织中海星皂甙的分布不同，其中胃中海星皂甙分布较多，幽门盲囊、体壁及生殖腺中依次递减。因此就提取海星皂甙而言，海燕供试组织中胃有较大的利用价值，可作为生理活动物质海星皂甙的主要来源。生殖腺中海星皂甙未见分布可能与所用材料的季节有关。
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2.2 海燕供试组织中海星皂甙的溶血指数比较表2 海燕供试组织中海星皂甙的溶血指数(HI)
Table 2.The H.I.and H.I.per gram of asterosaponin in the different organs of Asterina pectinifera
组织
Tissues
溶解试样(g)
Dissolved
sample(g)
每克皂甙
溶血指数
, 百拇医药
HI.g-1
总溶血指数
Total HI
胃(Stomach)
0.049
4,535
222
生殖腺(Gonad)
0.000
0
0
幽门盲囊(Pyloric sac)
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0.091
3,390
309
体壁(Body wall)
0.029
2,296
67
表中结果为两次实验的平均值，标准皂甙的HI.g-1为34722(The data reporoed in Table 2 were average value of two tests.The HI.g-1 of standard saponin were 34722)。
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由表2可以看出，海燕各不同组织中所含海星皂甙溶血指数不同，其溶血指数大小依次为胃、幽门盲囊、体壁和生殖腺，从而总HI来看，各组织中海星皂甙的溶血活性大小依次为幽门盲囊、胃、体壁和生殖腺。各不同组织中所含海星皂甙HI不同亦是在实践中利用具体组织时所要考虑的重要因素之一。
2.2 海星皂甙的理化性质
从黄海产海燕供试组织中提取的海星皂甙为淡黄色至黄绿色，其水溶液振荡时可产生持久的泡沫反应，微量的皂甙即能使家兔血液产生溶血作用；海星皂甙可溶于水，甲醇(含水乙醇)，正丁醇，其溶解度依次增大；该产品不溶于苯，醚，丙酮等有机溶剂。其熔点为242℃～255℃，熔距相差较大的原因可能与组织中所制备的海星总皂甙的纯度及其组分有关。样品溶于缓冲液，该溶液在244nm处有弱的紫外特征吸收峰(图1)，通过红外光谱测定观察(图2)，样品与标准皂甙在2450、2950、1650，1060cm-1处有相似峰形的吸收峰。与郭承华、Hashimoto Y[4，6]的结果吻合。
, 百拇医药
从海星皂甙的测定结果可以看出，通过比较黄海产海燕中海星皂甙与标准皂甙的紫外及红外吸收图谱，可初步确定二者有相似的化学结构。
图1 海星皂甙的紫外吸收曲线
a 标准皂甙 b 海燕组织中皂甙
图2 海星皂甙的红外吸收曲线
a 标准皂甙 b 海燕组织中皂甙
致谢 烟台大学分析中心荆济荣老师协助紫外及红外光谱测定，应用化学系赵岩老师协助显微点测定，生物化学系鞠宝老师帮助文稿整理，特此一并致谢。
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参考文献
1，廖玉林，孙松.我国药用棘皮动物——海星纲.海洋药物杂志，1988，1～2：61
2，王唯玮.海星的生理药理活性物质.海洋药物杂志，1986，4：46
3，郭承华，康桂敏.海星纲动物天然活性物质研究概况.中国动物科学研究，北京：中国林业出版社，1999，1046
4，郭承华，刘传琳，张传钦，砂海星海星皂甙的制备.中国海洋药物，1997，1：36
5，Fujita M,Nishimoto K,1952，On the biological of Japanese senega.J Pharm Soc Japan， 72:1645
6，Hashimoto Y,Yasumoto T,Confirmation of saponin as a toxic principle of starfish.Bull Jap Soc Fish，.1960,26(11):1132, http://www.100md.com