鼻咽癌患者前列环素及血栓素与外周血细胞免疫状况
作者：褚汉启
单位：同济医科大学附属同济医院耳鼻咽喉科，武汉 430030
关键词：鼻咽癌；前列环素；血栓素；免疫细胞
同济医科大学学报000326 摘要 应用间接免疫荧光法和放射免疫法分别检测了3 4例鼻咽癌患者外周血中淋巴细胞的数量和血浆前列环素(PGI2)及血栓素(TXA2)的含量 ，并与正常对照组对比研究。结果显示：鼻咽癌患者外周血中CD4细胞减少(P<0.01) ,而CD8细胞则明显升高(P<0.05)。同时鼻咽癌患者血浆中PGI2和TXA2的稳定代 谢产物6-keto-PGF1α及TXB2分别比对照组升高，以TXB2升高更明显(P<0 .05)。提示鼻咽癌患者体内前列腺素类物质PGI2和TXA2与鼻咽癌患者机体细胞免疫功 能有关，并对其作为一种可能性抑制因素在鼻咽癌细胞免疫中的作用进行了讨论。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R739.63, R977.6, Q592.1, R392.12
Study on the Relationship between Thromb oxane/Prostacyclin and Cellular
Immunity in Nasopharyngeal Carcinoma
Chu Hanqi
(Department of Otolaryngology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Immunohistochemistry technique and radioimmunoassay w ere used to measure peripheral blood lymphocytes and determine plasma concentrat ions of 6-keto-PGF1 alpha,thromboxane B2(TXB2) respectively in 34 patients with nasopharyngeal carcinoma. The results showed that CD4 cells were decreas ed (P<0.01) and CD8 cells increased (P<0.05) in peripheral blood in the patients with nasopharyngeal carcinoma as compared with those in the control group respectively. Simultaneously, the plasma concentrations of 6-keto-PGF1 alpha and TXB2 were higher in the patients with nasopharyngeal carcinoma than in the controls (P<0.05). It was suggested that thromboxane A2(TXA2)/pr ostacyclin (PGI2) might be related with the cellular immunity of nasopharyngea l carcinoma. TXA2/PGI2 as a possible suppressive agents in cellular immunity of nasopharyngeal carcinoma was discussed.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasms； cellular immunity； pros tagcyclin； thromboxane
近年研究发现前列腺素类物质前列腺环素(Prostacycline,PGI2)和血栓素(Thromboxane A 2,TXA2)与恶性肿瘤的生长和发展有密切关系，可以作为一种肿瘤细胞生长和增殖的调 节因子在肿瘤生长发展过程中起重要作用[1，2]；并发现前列腺素与带瘤宿主的免 疫功能也有密切关系。为了解PGI2和TXA2与鼻咽癌外周血细胞免疫状态，采用间接免疫 荧光法和放射免疫法分别检测鼻咽癌患者血浆PGI2/TXA2和外周血淋巴细胞数量分布， 以探讨其间的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 鼻咽癌外周血淋巴细胞亚群的检测
34例鼻咽癌患者，取材前未作任何治疗，按TNM分期为Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例，Ⅳ 期3例。男23例，女11例，年龄27～67岁。正常健康人16名，男10名，女6名，年龄18～55岁， 作对照组。
抗人单克隆抗体WuT3(CD3,识别全部人T细胞)，WuT4(CD4,识别辅助/诱导T细胞)，W uT8(CD8，识别杀伤/抑制T细胞)，WuTac(CD25,识别人IL-2受体)，WuB(识别人 全部B细胞) ，荧光标记(FITC)兔抗鼠IgG，均为卫生部武汉生物制品研究所产品。
外周血均于上午6～8时取自于肘静脉。2 ml淋巴细胞分层液中加入肝素抗凝的静脉血，经200 0 r/min,20 min离心，吸取分层界面云雾状单个核细胞层于试管中，加10%小牛血清后离心 并PBS清洗，弃上清。调整细胞浓度大约为1×106/ml。各吸取50 μl于20孔免疫反应板中 ，共4孔(包括CD3，CD4，CD8，阴性对照)。分别加入1∶10稀释的淋巴细胞单抗于各 个孔内。4 ℃孵育45 min，1000 r/min,离心1 min。弃上清后滴玻片，加盖玻片后在荧光 显微镜的油镜下观察计数200个细胞，按下式计算各类淋巴细胞阳性率：
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结果用平均数±标准误(
±S)表示。
用t和t′检验作统计学分析。
1.2 鼻咽癌患者血浆前列环素和血栓素的检测
用放射免疫分析法检测血浆中PGI2和TXA2的稳定代谢产物6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量。所有血样均在上午6～7时用含消炎 痛-肝素0.2 ml的已硅化注射器快速抽取肘静脉血约4 ml，置硅化试管充分混匀，4℃下30 00 r/min离心10 min分离血浆，吸取血浆1 ml，以石油醚和乙酸乙酯提取有机相，共两次。 有机相用氮气吹干后置-40℃下保存待检。
, 百拇医药
血浆样品6-keto-FGF1α和TXB2放免检测药盒为中国医科院基础医学研究所提供 ，按该所药理室建立的方法检测。检测仪为芬兰LKB公司的1215 Rackbeta Ⅱ液体闪烁计数仪。采用t或t′检验作统计学处理。
2 结果
鼻咽癌外周血中CD3淋巴细胞低于正常对照组；CD4淋巴细胞明显少于正常对照组(P <0.01)，CD8淋巴细胞明显高于正常对照组(P<0.05)；CD4/CD8比值低于正常对 照组(P<0.01)。鼻咽癌血浆中TXB2含量显著高于正常对照组(P<0.05)；6-ket o-PGF1α含量高于正常对照组；TXB2/6-keto-PGF1α的比值高于正常对 照组 (P<0.05)。
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3 讨论
近年研究表明，前列腺素与恶性肿瘤的生长和带瘤宿主的免疫功能有密切关系，其中研究较多的E族前列腺素具有多种免疫抑制活力，PGE2已证实是与荷瘤机体免疫抑制相关的一种前列腺素，它不仅可抑制淋巴细胞产生淋巴因子及其对丝裂原的增殖反应，降低NK细胞和巨噬细胞的活性，还可抑制T细胞和LAK细胞的诱导成熟，其程度与免疫抑制呈正相关[3,4]。
在此观察到鼻咽癌外周血中CD8细胞多于正常对照组，而CD4细胞少于正常组；CD4/CD8细胞比值下降，显示鼻咽癌患者细胞免疫反应能力处于相对抑制状态。而相应血中PGI2和TXA2均有升高，并以TXA2升高更明显，可能在鼻咽癌机体细胞免疫中起一定调节作用。而其对血小板聚集，瘤细胞血小板栓形成和肿瘤细胞与血管壁吸附的作用，可 促进肿瘤的发展和转移,已得到多数研究证实[5,6]，但其与鼻咽癌机体免疫状况的 研究还未见文献报道。
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June等[6]在7例头颈部鳞癌患者组织中发现PGE2、PGD2、6-keto-PGF1 α和TXB2含量均有升高，而其中PGE2比对照组升高4倍；并观察到PGE2或TXB2升 高的患者，其预后比PGI2或TXB2升高者差。认为包括TXA2及PGI2在内的前列腺素类 物质抑制了宿主的抗肿瘤免疫反应，包括抑制T淋巴细胞的分裂增殖和CD8细胞及NK细胞的 活性。Cross等[4]的研究中，用前列腺素抑制剂消炎痛(indomethacin)治疗前,头 颈部鳞癌组织内浸润的CD2、CD4、CD8细胞均有升高，但未发现B细胞的浸润。而治疗 后，CD2、CD4、CD8细胞全部升高，其组织中CD2的浸润升高8倍。实验提示前列腺 素抑制了包括T淋巴细胞增殖在内的T淋巴细胞的功能。对照组中则没有观察到免疫T淋巴细 胞的数目升高。治疗后外周血中淋巴细胞IL-2的应答反应性增强，4周后NK细胞功能升高， 提示前列腺素在头颈鳞癌细胞免疫中起抑制作用，抑制属主T淋巴细胞的浸润程度及功能。 并提出应用消炎痛刺激淋巴细胞浸润到肿瘤内的程度，以提高和增强肿瘤组织中T淋巴细胞 的抗肿瘤免疫功能。
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Darrow等[7]观察到肿瘤局部浸润的99%是CD3、CD4、CD8淋巴细胞，其数量 增长依赖于IL-2，加入过量的IL-2后不能逆转其免疫抑制效应；但加入消炎痛后，可以部 分逆转其免疫抑制效应。并认为前列腺素类可影响TIL细胞CD4，CD8表型的分裂与增殖 。Young等[3]在219例头颈部肿瘤及64例肿瘤转移的淋巴结内检测出TGF-β、PGE 2及IL-10三种抑制性免疫调节因子，并观察到它们与肿瘤组织中CD8淋巴细胞的减少有 明确关系，但与CD4细胞数量关系不大。认为头颈部肿瘤共有的特有免疫抑制效应与肿瘤 组织内CD4、CD8细胞浸润减少及功能低下有关。也有作者在观察到前列腺腺癌中，CD 4辅助淋巴细胞随肿瘤发展而逐步减少而外周血单个核细胞分泌IL-2也同样逐步减少，但CD 8抑制毒性淋巴细胞数量却无改变。而前列腺素类抑制剂消炎痛则可以明显增强此类患者 的NK细胞活性，证实前列腺腺癌早期即有免疫功能失常，并随肿瘤的发展而加重[8]。
, 百拇医药
本研究观察到的鼻咽癌外周血中CD8淋巴细胞升高，CD4细胞降低，CD4/ CD8细胞比值下降，其PGI2和TXA2均不同程度升高，TXA2/PGI2比值增高，提示了鼻咽癌机 体内参与 以CD4/CD8淋巴细胞为主的细胞免疫调节功能可能部分受TXA2及PGI2的影响，而鼻 咽癌患者 的机体细胞免疫抑制状态与TXA2/PGI2有一定联系。进一步研究其内在机制及细胞功能 状态 ，有利于阐明前列腺素类物质与鼻咽癌患者机体细胞免疫的关系，为鼻咽癌诊治开辟更多的 途径。
褚汉启， 男， 1961年生， 副 教授，副主任医师
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1，Slotman G J. Plasma thromboxane A2 and prostacycline concentrat i ons in squamous cell 1. Carcinoma of the head and neck. J Surg Oncol, 1988,38:33
2，褚汉启，谭慎微，刘永强. 鼻咽癌与前列环素及血栓素关系初探. 临床耳鼻 咽喉科杂志, 1994,8(2):67
3，Young M R, Wright M A, Lozano Y et al. Mechanisms of immune su ppre ssion in patients with head and neck cancer: influence on the immune infiltrate of the cancer. Int J Cancer, 1996,69:333
, 百拇医药
4，Cross D S, Platt J L, Juhn S K et al. Administration of a pro staglandin synthetase inhibitor associated with an increased immune cell infi ltrate in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryn gol Head Neck Surg, 1992,118:526
5，Goodwin J S. Patial reversal of the cellular immune defect in comm on variable hypogammaglobulinemia with indomethacin. J Clin Lab Immunol, 1978,1:197
6，Jun T T, Berlinger N T, Juhn S K et al. Prostaglandins in sq uam ous cell carcinoma of the head and neck: a preliminary study. Laryngo scope , 1985,95:307
, 百拇医药
7，Darrow T L, Wahab Z, Quinn-Allen M A et al. Human melanoma-m edi ated inhibition of autologous CD4+ helper tumor-infiltrating lymphocyte gr owth in vitro. Cancer, 1992,69:1843
8，Lahat N, Alexander B, Levin D R et al. The relationship betwee n cl inicl stage, natural killer activity and related immunological parameters in ade nocarcinoma of the prostate. Cancer Immunol Immunother, 1989,28:208
(1999-06-11 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院耳鼻咽喉科，武汉 430030
关键词：鼻咽癌；前列环素；血栓素；免疫细胞
同济医科大学学报000326 摘要 应用间接免疫荧光法和放射免疫法分别检测了3 4例鼻咽癌患者外周血中淋巴细胞的数量和血浆前列环素(PGI2)及血栓素(TXA2)的含量 ，并与正常对照组对比研究。结果显示：鼻咽癌患者外周血中CD4细胞减少(P<0.01) ,而CD8细胞则明显升高(P<0.05)。同时鼻咽癌患者血浆中PGI2和TXA2的稳定代 谢产物6-keto-PGF1α及TXB2分别比对照组升高，以TXB2升高更明显(P<0 .05)。提示鼻咽癌患者体内前列腺素类物质PGI2和TXA2与鼻咽癌患者机体细胞免疫功 能有关，并对其作为一种可能性抑制因素在鼻咽癌细胞免疫中的作用进行了讨论。
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中图法分类号 R739.63, R977.6, Q592.1, R392.12
Study on the Relationship between Thromb oxane/Prostacyclin and Cellular
Immunity in Nasopharyngeal Carcinoma
Chu Hanqi
(Department of Otolaryngology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Immunohistochemistry technique and radioimmunoassay w ere used to measure peripheral blood lymphocytes and determine plasma concentrat ions of 6-keto-PGF1 alpha,thromboxane B2(TXB2) respectively in 34 patients with nasopharyngeal carcinoma. The results showed that CD4 cells were decreas ed (P<0.01) and CD8 cells increased (P<0.05) in peripheral blood in the patients with nasopharyngeal carcinoma as compared with those in the control group respectively. Simultaneously, the plasma concentrations of 6-keto-PGF1 alpha and TXB2 were higher in the patients with nasopharyngeal carcinoma than in the controls (P<0.05). It was suggested that thromboxane A2(TXA2)/pr ostacyclin (PGI2) might be related with the cellular immunity of nasopharyngea l carcinoma. TXA2/PGI2 as a possible suppressive agents in cellular immunity of nasopharyngeal carcinoma was discussed.
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Key words nasopharyngeal neoplasms； cellular immunity； pros tagcyclin； thromboxane
近年研究发现前列腺素类物质前列腺环素(Prostacycline,PGI2)和血栓素(Thromboxane A 2,TXA2)与恶性肿瘤的生长和发展有密切关系，可以作为一种肿瘤细胞生长和增殖的调 节因子在肿瘤生长发展过程中起重要作用[1，2]；并发现前列腺素与带瘤宿主的免 疫功能也有密切关系。为了解PGI2和TXA2与鼻咽癌外周血细胞免疫状态，采用间接免疫 荧光法和放射免疫法分别检测鼻咽癌患者血浆PGI2/TXA2和外周血淋巴细胞数量分布， 以探讨其间的关系。
1 材料与方法
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1.1 鼻咽癌外周血淋巴细胞亚群的检测
34例鼻咽癌患者，取材前未作任何治疗，按TNM分期为Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例，Ⅳ 期3例。男23例，女11例，年龄27～67岁。正常健康人16名，男10名，女6名，年龄18～55岁， 作对照组。
抗人单克隆抗体WuT3(CD3,识别全部人T细胞)，WuT4(CD4,识别辅助/诱导T细胞)，W uT8(CD8，识别杀伤/抑制T细胞)，WuTac(CD25,识别人IL-2受体)，WuB(识别人 全部B细胞) ，荧光标记(FITC)兔抗鼠IgG，均为卫生部武汉生物制品研究所产品。
外周血均于上午6～8时取自于肘静脉。2 ml淋巴细胞分层液中加入肝素抗凝的静脉血，经200 0 r/min,20 min离心，吸取分层界面云雾状单个核细胞层于试管中，加10%小牛血清后离心 并PBS清洗，弃上清。调整细胞浓度大约为1×106/ml。各吸取50 μl于20孔免疫反应板中 ，共4孔(包括CD3，CD4，CD8，阴性对照)。分别加入1∶10稀释的淋巴细胞单抗于各 个孔内。4 ℃孵育45 min，1000 r/min,离心1 min。弃上清后滴玻片，加盖玻片后在荧光 显微镜的油镜下观察计数200个细胞，按下式计算各类淋巴细胞阳性率：
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结果用平均数±标准误(
±S)表示。用t和t′检验作统计学分析。
1.2 鼻咽癌患者血浆前列环素和血栓素的检测
用放射免疫分析法检测血浆中PGI2和TXA2的稳定代谢产物6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量。所有血样均在上午6～7时用含消炎 痛-肝素0.2 ml的已硅化注射器快速抽取肘静脉血约4 ml，置硅化试管充分混匀，4℃下30 00 r/min离心10 min分离血浆，吸取血浆1 ml，以石油醚和乙酸乙酯提取有机相，共两次。 有机相用氮气吹干后置-40℃下保存待检。
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血浆样品6-keto-FGF1α和TXB2放免检测药盒为中国医科院基础医学研究所提供 ，按该所药理室建立的方法检测。检测仪为芬兰LKB公司的1215 Rackbeta Ⅱ液体闪烁计数仪。采用t或t′检验作统计学处理。
2 结果
鼻咽癌外周血中CD3淋巴细胞低于正常对照组；CD4淋巴细胞明显少于正常对照组(P <0.01)，CD8淋巴细胞明显高于正常对照组(P<0.05)；CD4/CD8比值低于正常对 照组(P<0.01)。鼻咽癌血浆中TXB2含量显著高于正常对照组(P<0.05)；6-ket o-PGF1α含量高于正常对照组；TXB2/6-keto-PGF1α的比值高于正常对 照组 (P<0.05)。
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3 讨论
近年研究表明，前列腺素与恶性肿瘤的生长和带瘤宿主的免疫功能有密切关系，其中研究较多的E族前列腺素具有多种免疫抑制活力，PGE2已证实是与荷瘤机体免疫抑制相关的一种前列腺素，它不仅可抑制淋巴细胞产生淋巴因子及其对丝裂原的增殖反应，降低NK细胞和巨噬细胞的活性，还可抑制T细胞和LAK细胞的诱导成熟，其程度与免疫抑制呈正相关[3,4]。
在此观察到鼻咽癌外周血中CD8细胞多于正常对照组，而CD4细胞少于正常组；CD4/CD8细胞比值下降，显示鼻咽癌患者细胞免疫反应能力处于相对抑制状态。而相应血中PGI2和TXA2均有升高，并以TXA2升高更明显，可能在鼻咽癌机体细胞免疫中起一定调节作用。而其对血小板聚集，瘤细胞血小板栓形成和肿瘤细胞与血管壁吸附的作用，可 促进肿瘤的发展和转移,已得到多数研究证实[5,6]，但其与鼻咽癌机体免疫状况的 研究还未见文献报道。
, http://www.100md.com
June等[6]在7例头颈部鳞癌患者组织中发现PGE2、PGD2、6-keto-PGF1 α和TXB2含量均有升高，而其中PGE2比对照组升高4倍；并观察到PGE2或TXB2升 高的患者，其预后比PGI2或TXB2升高者差。认为包括TXA2及PGI2在内的前列腺素类 物质抑制了宿主的抗肿瘤免疫反应，包括抑制T淋巴细胞的分裂增殖和CD8细胞及NK细胞的 活性。Cross等[4]的研究中，用前列腺素抑制剂消炎痛(indomethacin)治疗前,头 颈部鳞癌组织内浸润的CD2、CD4、CD8细胞均有升高，但未发现B细胞的浸润。而治疗 后，CD2、CD4、CD8细胞全部升高，其组织中CD2的浸润升高8倍。实验提示前列腺 素抑制了包括T淋巴细胞增殖在内的T淋巴细胞的功能。对照组中则没有观察到免疫T淋巴细 胞的数目升高。治疗后外周血中淋巴细胞IL-2的应答反应性增强，4周后NK细胞功能升高， 提示前列腺素在头颈鳞癌细胞免疫中起抑制作用，抑制属主T淋巴细胞的浸润程度及功能。 并提出应用消炎痛刺激淋巴细胞浸润到肿瘤内的程度，以提高和增强肿瘤组织中T淋巴细胞 的抗肿瘤免疫功能。
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Darrow等[7]观察到肿瘤局部浸润的99%是CD3、CD4、CD8淋巴细胞，其数量 增长依赖于IL-2，加入过量的IL-2后不能逆转其免疫抑制效应；但加入消炎痛后，可以部 分逆转其免疫抑制效应。并认为前列腺素类可影响TIL细胞CD4，CD8表型的分裂与增殖 。Young等[3]在219例头颈部肿瘤及64例肿瘤转移的淋巴结内检测出TGF-β、PGE 2及IL-10三种抑制性免疫调节因子，并观察到它们与肿瘤组织中CD8淋巴细胞的减少有 明确关系，但与CD4细胞数量关系不大。认为头颈部肿瘤共有的特有免疫抑制效应与肿瘤 组织内CD4、CD8细胞浸润减少及功能低下有关。也有作者在观察到前列腺腺癌中，CD 4辅助淋巴细胞随肿瘤发展而逐步减少而外周血单个核细胞分泌IL-2也同样逐步减少，但CD 8抑制毒性淋巴细胞数量却无改变。而前列腺素类抑制剂消炎痛则可以明显增强此类患者 的NK细胞活性，证实前列腺腺癌早期即有免疫功能失常，并随肿瘤的发展而加重[8]。
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本研究观察到的鼻咽癌外周血中CD8淋巴细胞升高，CD4细胞降低，CD4/ CD8细胞比值下降，其PGI2和TXA2均不同程度升高，TXA2/PGI2比值增高，提示了鼻咽癌机 体内参与 以CD4/CD8淋巴细胞为主的细胞免疫调节功能可能部分受TXA2及PGI2的影响，而鼻 咽癌患者 的机体细胞免疫抑制状态与TXA2/PGI2有一定联系。进一步研究其内在机制及细胞功能 状态 ，有利于阐明前列腺素类物质与鼻咽癌患者机体细胞免疫的关系，为鼻咽癌诊治开辟更多的 途径。
褚汉启， 男， 1961年生， 副 教授，副主任医师
参 考 文 献
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1，Slotman G J. Plasma thromboxane A2 and prostacycline concentrat i ons in squamous cell 1. Carcinoma of the head and neck. J Surg Oncol, 1988,38:33
2，褚汉启，谭慎微，刘永强. 鼻咽癌与前列环素及血栓素关系初探. 临床耳鼻 咽喉科杂志, 1994,8(2):67
3，Young M R, Wright M A, Lozano Y et al. Mechanisms of immune su ppre ssion in patients with head and neck cancer: influence on the immune infiltrate of the cancer. Int J Cancer, 1996,69:333
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4，Cross D S, Platt J L, Juhn S K et al. Administration of a pro staglandin synthetase inhibitor associated with an increased immune cell infi ltrate in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryn gol Head Neck Surg, 1992,118:526
5，Goodwin J S. Patial reversal of the cellular immune defect in comm on variable hypogammaglobulinemia with indomethacin. J Clin Lab Immunol, 1978,1:197
6，Jun T T, Berlinger N T, Juhn S K et al. Prostaglandins in sq uam ous cell carcinoma of the head and neck: a preliminary study. Laryngo scope , 1985,95:307
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7，Darrow T L, Wahab Z, Quinn-Allen M A et al. Human melanoma-m edi ated inhibition of autologous CD4+ helper tumor-infiltrating lymphocyte gr owth in vitro. Cancer, 1992,69:1843
8，Lahat N, Alexander B, Levin D R et al. The relationship betwee n cl inicl stage, natural killer activity and related immunological parameters in ade nocarcinoma of the prostate. Cancer Immunol Immunother, 1989,28:208
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