人工蛇胆汁中牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺去氧胆酸的 反相高效液相色谱法测定
作者：向一 石朝周 梅和珊 彭红
单位：同济医科大学药学院药物分析教研室，武汉 430030
关键词：人工蛇胆汁；牛磺胆酸；牛磺鹅去氧胆酸；牛磺去氧胆酸；反相高效液相色谱法
同济医科大学学报000311 摘要 采用反相高效液相色谱法测定人工蛇胆 汁中牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸及牛磺去氧胆酸3种主成分的含量。其色谱条件为：Nova Pa k C18(4 μm)柱，流动相：乙腈-水(1∶2),流速：0.9 ml/min, 检测波长：21 0 nm。平均加样回收率分别为：牛磺胆酸100.5%、牛磺鹅去氧胆酸102.2%及牛磺去氧胆酸1 00 .9%，RSD分别为1.48%、1.60%及1.97%。该法快速、灵敏、准确，适用于人工蛇胆汁中3 种主要有效成分的同时测定。
中图法分类号 R282.74， R975
, 百拇医药
Determination of Taurocholic Acid, Tauro chenodeoxycholic Acid and
Taurodeoxycholic Acid in Artificial Snake Bile by RP -HPLC
Xiang Yi
(Department of Pharmaceutical Analysis)
Shi Chaozhou
( Depar tment of Physicochemistry College of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuha n 430030)
Mei Heshan
, 百拇医药
( Depar tment of Physicochemistry College of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuha n 430030)
Abstract A RP-HPLC method was used to determine the contents of the three main constituents in artificial snake bile: taurocholic acid, taurochenodeoxycholic a cid and taurodeoxycholic acid. The chromatographic conditions were as follows: c olumn, Nova Pak C18 (4 μm); mobile phase, acetonitrile-aqueous (1∶2); f low rate, 0.9 ml/min; the detection wave length, 210 nm. The average recoveries of taurocholic acid, taurochenodeoxy cholic acid and taurodeoxycholic acid were 100.5 % with RSD 1.48 %, 102.2 % with RSD 1.60 % and 100.4 % with RSD 1.9 7 %, respectively. This method was rapid, sensitive and specific. It is suitable for the determination of the three main constituents in artificial snake bile.
, http://www.100md.com
Key words artificial snake bile; taurocholic acid; taurocheno deoxycholic acid; taurodeoxycholic acid; RP-HPLC
蛇胆汁药用历史悠久，因其具有镇咳、祛痰、平喘和抗炎的功效[1]，临床上多用 于治疗呼吸系统疾病。根据目前的文献报道[2～4]，蛇胆汁中主要含有胆色素、胆 汁酸、 胆固醇 、粘蛋白、无机盐等成分，其中结合型胆汁酸类物质牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧 胆酸为其主要有效成分。近年来，随着其临床应用逐渐发展，需求量逐年增多而来源不足。 人工蛇胆汁是新研制的蛇胆汁代用品，关于其主要有效成分的含量测定方法尚未见报道。经 过实验研究，我们建立了反相高效液相色谱法，可同时测定人工蛇胆汁中的3种主要有效成 分，该法测定迅速、灵敏、准确，分离度好，专属性强，适用于人工蛇胆汁中3种主要有效 成分的同时测定，可用于人工蛇胆汁的质量控制。
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1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪(美国Waters公司产品)，包括616型恒流泵，486型可变波长紫 外检测器；SIL-6B自动进样器；NEC计算机(内装Baseline810型色谱工作站)；80-2型离 心沉淀机，上海手术器械厂。
试剂：牛磺胆酸钠(TCA-Na)、牛磺去氧胆酸钠(TDCA-Na)、牛磺鹅去氧胆酸钠(T CDCA-Na)对照品均购自美国Sigma公司；人工蛇胆汁为自制品[5]，由同济医科大 学药学院物化教研室提供；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯级试剂。
1.2 色谱条件
Nova Pak C18色谱柱：4 mm×150 mm，粒径4 μm；ODS预柱，粒径10 μm；流动相： 乙腈-水(1∶2)，用10 g/L磷酸调pH=3.1; 流速0.9 ml/min; 柱温：35 ℃；检测波长 ：210 nm；试验方法：外标法。
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1.3 对照品贮备液的制备
分别精密称取经P2O5干燥至恒重的牛磺胆酸钠、牛磺去氧胆酸钠及牛磺鹅去 氧胆酸钠对照品48.4 mg、48.2 mg及50.0 mg，用95%乙醇溶解定容成25 ml，冰箱内贮存 ，备用。
1.4 可行性试验
分别量取上述3种贮备液适量，用95%乙醇稀释成0.5 mg/ml的混合对照品溶液，进样； 取人工蛇胆汁适量，按样品测定方法制备，进样。结果表明，牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去 氧胆酸(TCDCA)及牛磺去氧胆酸(TDCA)的保留时间分别为2.2 min、3.8 min、4.4 mi n， 牛磺鹅去氧胆酸峰与牛磺胆酸峰的分离度是5.37，牛磺去氧胆酸峰与牛磺鹅去氧胆酸峰的 分 离度是1.83，理论板数按牛磺胆酸峰计算为2027，且人工蛇胆汁中含有的其它成分对这3种 主成分的测定没有影响。
, 百拇医药
1.5 线性关系
分别量取上述3种贮备液0.6、1.0、1.4、1.8、2.6、3.0 ml于6个10 ml容量瓶中，用 95 %乙醇定容，得系列混合对照品溶液。各溶液分别置自动进样器中自动进样，按上述色谱 条件测定峰面积。以峰面积均值Y为纵坐标，进样浓度X(mg/ml)为横坐标进行线性回归， 结果见表1。
1.6 方法考察
1.6.1 回收率试验: 采取加样回收试验法。精密量取已测定含量的人工蛇胆汁5份，分别 精密加入TCA、TCDCA和TDCA对照品的标准贮备液适量，各份均依样品测定项下方法操作，用 选定的色谱条件测定，计算回收率。5次测定结果，TCA、TCDCA及TDCA三种成分的平均加样 回收率分别为 100.5%、102.2%及100.9%，相对标准差(RSD%)分别为1.48%、1.60%及 1.97%。
, 百拇医药 1.6.2 精密度试验: 同一供试品溶液置自动进样器中，4 h内重复进样(n=6)，结 果RSD分别为0.86%、0.94%及1.03%。
2 结果
取人工蛇胆汁5 ml，加入等体积的50 %乙醇液，混匀，离心30 min后，取上清液1 ml和3 ml ，95 %乙醇稀释定容成50 ml和10 ml。放置后0.45 μm微孔滤膜滤过，进样10 μl，记录T CA、TCDCA及TDCA的峰面积。根据外标法计算样品中3种结合胆汁酸含量(均是以钠盐计算的 含量)。测定了3批样品，结果见表2。
表2 样品测定结果(mg/ml) 样品编号
TCA
TCDCA
TDCA
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1
39.61
1.24
0.74
2
40.15
1.27
0.77
3
39.98
1.23
0.78
3 讨论
, 百拇医药
结合胆汁酸类物质牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸在其侧链上是个磺酸基， 根据文献报道[6]，这3种物质在190～215 nm有吸收峰。我们将3种成分分别在109 ～400 nm范围内紫外扫描，结果与文献报道完全一致，因此选择210 nm为检测波长。
经过对多种流动相系统进行筛选，最终选定了乙腈-水-10%磷酸系统[7]，同 时考察了 流动相pH值对样品色谱行为的影响。试验表明：3种成分的保留时间随着流动相pH值的增大 而延长，但TDCA峰拖尾；降低流动相pH值(pH<3.3)，保留时间提前，分离度和峰形越好 。 但考虑到色谱柱对pH值的耐受性，选择了流动相pH值为3.1的流动相系统，得到了分离完全 且不拖尾的色谱峰。
人工蛇胆汁虽是多组分混合物，但在该选定的实验条件下，经过适当的预处理，样品中 存在的其它成分对主成分的测定无干扰，且可同时测定人工蛇胆汁中牛磺胆酸、牛磺去氧胆 酸和牛磺鹅去氧胆酸3种主要有效成分，减少了操作过程中造成的误差。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No. 39270884)
向一，女，1962年生，医学硕士，讲师
参 考 文 献
1，林绍平, 赖明坚，王 勤. 药化药理和临床研究概况. 中国生化药物杂志, 1994，15(1)：4
2，胡梅素. 蛇胆及其制剂中牛磺胆酸含量比较. 中草药, 1994，25(12)：659
3，曾长青，梁本恒. 十四种蛇胆胆汁酸成分的高效薄层色谱分析. 中药材, 1996 , 19(3)：139
4，张德桐，张能容. 鸡胆汁与蛇胆汁组分的对比研究. 中国生化药物杂志, 1994 ，15(1)：4
, 百拇医药 5，石朝周. 人工蛇胆及其制造方法和应用技术. 中国发明专利公报，1997, 13 (11)：CN114657A
6，Pamela S T, Johnson L T, Laurence J M et al. Development and va lidation of a method for measuring the glycine and taurine conjugates of bile acids in bile by HPLC. J Chromatogr, 1984,336:249
7，刘卓妍，董元伟，梁意红等. 高效液相法测定蛇胆及蛇胆川贝液中牛磺胆酸含 量. 中成药, 1994,16(2)：13
(1999-12-07 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学药学院药物分析教研室，武汉 430030
关键词：人工蛇胆汁；牛磺胆酸；牛磺鹅去氧胆酸；牛磺去氧胆酸；反相高效液相色谱法
同济医科大学学报000311 摘要 采用反相高效液相色谱法测定人工蛇胆 汁中牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸及牛磺去氧胆酸3种主成分的含量。其色谱条件为：Nova Pa k C18(4 μm)柱，流动相：乙腈-水(1∶2),流速：0.9 ml/min, 检测波长：21 0 nm。平均加样回收率分别为：牛磺胆酸100.5%、牛磺鹅去氧胆酸102.2%及牛磺去氧胆酸1 00 .9%，RSD分别为1.48%、1.60%及1.97%。该法快速、灵敏、准确，适用于人工蛇胆汁中3 种主要有效成分的同时测定。
中图法分类号 R282.74， R975
, 百拇医药
Determination of Taurocholic Acid, Tauro chenodeoxycholic Acid and
Taurodeoxycholic Acid in Artificial Snake Bile by RP -HPLC
Xiang Yi
(Department of Pharmaceutical Analysis)
Shi Chaozhou
( Depar tment of Physicochemistry College of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuha n 430030)
Mei Heshan
, 百拇医药
( Depar tment of Physicochemistry College of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuha n 430030)
Abstract A RP-HPLC method was used to determine the contents of the three main constituents in artificial snake bile: taurocholic acid, taurochenodeoxycholic a cid and taurodeoxycholic acid. The chromatographic conditions were as follows: c olumn, Nova Pak C18 (4 μm); mobile phase, acetonitrile-aqueous (1∶2); f low rate, 0.9 ml/min; the detection wave length, 210 nm. The average recoveries of taurocholic acid, taurochenodeoxy cholic acid and taurodeoxycholic acid were 100.5 % with RSD 1.48 %, 102.2 % with RSD 1.60 % and 100.4 % with RSD 1.9 7 %, respectively. This method was rapid, sensitive and specific. It is suitable for the determination of the three main constituents in artificial snake bile.
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Key words artificial snake bile; taurocholic acid; taurocheno deoxycholic acid; taurodeoxycholic acid; RP-HPLC
蛇胆汁药用历史悠久，因其具有镇咳、祛痰、平喘和抗炎的功效[1]，临床上多用 于治疗呼吸系统疾病。根据目前的文献报道[2～4]，蛇胆汁中主要含有胆色素、胆 汁酸、 胆固醇 、粘蛋白、无机盐等成分，其中结合型胆汁酸类物质牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧 胆酸为其主要有效成分。近年来，随着其临床应用逐渐发展，需求量逐年增多而来源不足。 人工蛇胆汁是新研制的蛇胆汁代用品，关于其主要有效成分的含量测定方法尚未见报道。经 过实验研究，我们建立了反相高效液相色谱法，可同时测定人工蛇胆汁中的3种主要有效成 分，该法测定迅速、灵敏、准确，分离度好，专属性强，适用于人工蛇胆汁中3种主要有效 成分的同时测定，可用于人工蛇胆汁的质量控制。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪(美国Waters公司产品)，包括616型恒流泵，486型可变波长紫 外检测器；SIL-6B自动进样器；NEC计算机(内装Baseline810型色谱工作站)；80-2型离 心沉淀机，上海手术器械厂。
试剂：牛磺胆酸钠(TCA-Na)、牛磺去氧胆酸钠(TDCA-Na)、牛磺鹅去氧胆酸钠(T CDCA-Na)对照品均购自美国Sigma公司；人工蛇胆汁为自制品[5]，由同济医科大 学药学院物化教研室提供；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯级试剂。
1.2 色谱条件
Nova Pak C18色谱柱：4 mm×150 mm，粒径4 μm；ODS预柱，粒径10 μm；流动相： 乙腈-水(1∶2)，用10 g/L磷酸调pH=3.1; 流速0.9 ml/min; 柱温：35 ℃；检测波长 ：210 nm；试验方法：外标法。
, http://www.100md.com
1.3 对照品贮备液的制备
分别精密称取经P2O5干燥至恒重的牛磺胆酸钠、牛磺去氧胆酸钠及牛磺鹅去 氧胆酸钠对照品48.4 mg、48.2 mg及50.0 mg，用95%乙醇溶解定容成25 ml，冰箱内贮存 ，备用。
1.4 可行性试验
分别量取上述3种贮备液适量，用95%乙醇稀释成0.5 mg/ml的混合对照品溶液，进样； 取人工蛇胆汁适量，按样品测定方法制备，进样。结果表明，牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去 氧胆酸(TCDCA)及牛磺去氧胆酸(TDCA)的保留时间分别为2.2 min、3.8 min、4.4 mi n， 牛磺鹅去氧胆酸峰与牛磺胆酸峰的分离度是5.37，牛磺去氧胆酸峰与牛磺鹅去氧胆酸峰的 分 离度是1.83，理论板数按牛磺胆酸峰计算为2027，且人工蛇胆汁中含有的其它成分对这3种 主成分的测定没有影响。
, 百拇医药
1.5 线性关系
分别量取上述3种贮备液0.6、1.0、1.4、1.8、2.6、3.0 ml于6个10 ml容量瓶中，用 95 %乙醇定容，得系列混合对照品溶液。各溶液分别置自动进样器中自动进样，按上述色谱 条件测定峰面积。以峰面积均值Y为纵坐标，进样浓度X(mg/ml)为横坐标进行线性回归， 结果见表1。
1.6 方法考察
1.6.1 回收率试验: 采取加样回收试验法。精密量取已测定含量的人工蛇胆汁5份，分别 精密加入TCA、TCDCA和TDCA对照品的标准贮备液适量，各份均依样品测定项下方法操作，用 选定的色谱条件测定，计算回收率。5次测定结果，TCA、TCDCA及TDCA三种成分的平均加样 回收率分别为 100.5%、102.2%及100.9%，相对标准差(RSD%)分别为1.48%、1.60%及 1.97%。
, 百拇医药 1.6.2 精密度试验: 同一供试品溶液置自动进样器中，4 h内重复进样(n=6)，结 果RSD分别为0.86%、0.94%及1.03%。
2 结果
取人工蛇胆汁5 ml，加入等体积的50 %乙醇液，混匀，离心30 min后，取上清液1 ml和3 ml ，95 %乙醇稀释定容成50 ml和10 ml。放置后0.45 μm微孔滤膜滤过，进样10 μl，记录T CA、TCDCA及TDCA的峰面积。根据外标法计算样品中3种结合胆汁酸含量(均是以钠盐计算的 含量)。测定了3批样品，结果见表2。
表2 样品测定结果(mg/ml) 样品编号
TCA
TCDCA
TDCA
, http://www.100md.com
1
39.61
1.24
0.74
2
40.15
1.27
0.77
3
39.98
1.23
0.78
3 讨论
, 百拇医药
结合胆汁酸类物质牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸在其侧链上是个磺酸基， 根据文献报道[6]，这3种物质在190～215 nm有吸收峰。我们将3种成分分别在109 ～400 nm范围内紫外扫描，结果与文献报道完全一致，因此选择210 nm为检测波长。
经过对多种流动相系统进行筛选，最终选定了乙腈-水-10%磷酸系统[7]，同 时考察了 流动相pH值对样品色谱行为的影响。试验表明：3种成分的保留时间随着流动相pH值的增大 而延长，但TDCA峰拖尾；降低流动相pH值(pH<3.3)，保留时间提前，分离度和峰形越好 。 但考虑到色谱柱对pH值的耐受性，选择了流动相pH值为3.1的流动相系统，得到了分离完全 且不拖尾的色谱峰。
人工蛇胆汁虽是多组分混合物，但在该选定的实验条件下，经过适当的预处理，样品中 存在的其它成分对主成分的测定无干扰，且可同时测定人工蛇胆汁中牛磺胆酸、牛磺去氧胆 酸和牛磺鹅去氧胆酸3种主要有效成分，减少了操作过程中造成的误差。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No. 39270884)
向一，女，1962年生，医学硕士，讲师
参 考 文 献
1，林绍平, 赖明坚，王 勤. 药化药理和临床研究概况. 中国生化药物杂志, 1994，15(1)：4
2，胡梅素. 蛇胆及其制剂中牛磺胆酸含量比较. 中草药, 1994，25(12)：659
3，曾长青，梁本恒. 十四种蛇胆胆汁酸成分的高效薄层色谱分析. 中药材, 1996 , 19(3)：139
4，张德桐，张能容. 鸡胆汁与蛇胆汁组分的对比研究. 中国生化药物杂志, 1994 ，15(1)：4
, 百拇医药 5，石朝周. 人工蛇胆及其制造方法和应用技术. 中国发明专利公报，1997, 13 (11)：CN114657A
6，Pamela S T, Johnson L T, Laurence J M et al. Development and va lidation of a method for measuring the glycine and taurine conjugates of bile acids in bile by HPLC. J Chromatogr, 1984,336:249
7，刘卓妍，董元伟，梁意红等. 高效液相法测定蛇胆及蛇胆川贝液中牛磺胆酸含 量. 中成药, 1994,16(2)：13
(1999-12-07 收稿), http://www.100md.com