脊髓腹角神经元共存NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF
作者：李维平 王廷华 徐蔚
单位：李维平(深圳红十字会医院神经外科，深圳 518035)；王廷华 徐蔚(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：腹角神经元；NGF，BDNF，NT3,NT4与GDNF；共存
昆明医学院学报000303 摘要：用NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF抗血清，以免疫组织化学方法观察NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF在成年猫L5脊髓腹角神经元是否共存.结果：L5脊髓腹角神经元均含有上述被检测的5种神经营养因子的免疫反应物，表明腹角神经元共存NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF，提示这5种神经营养因子可能与脊髓腹角神经元的生理过程有关.
, 百拇医药
中图分类号：Q 426 文献标识码：A 文章编号：1003-4076(2000) 03-0011-03
The Co-expression of NGF, BDNF, NT3, NT4 and
GDNF in Neurons of Ventral Horn of Spinal Cord
LI Wei-ping，(Department of Neurological Surgery, Shenzhen Red-cross Hospital, Shenzhen 518035)
WANG Ting-hua，XU Wei
(Institute for Research on Neuroscience, Kunming Medical College, Kunming 650031)
, 百拇医药
Abstract：The co-expression of nerve growth factor (NGF), brain derived neurotrophic factor(BDNF), Neurotrophin3(NT3), Neurotrophin4(NT4), and glia derived neurotrophic factor (GDNF) in ventral neuron of spinal cord was studied by ABC immunohistochemical method using antibody of NGF, BDNF, NT3, NT4 and GDNF. The distribution on the positive products of NGF, BDNF, NT3, NT4 and GDNF in segment L5 was observed in ventral neurons of spinal cord. The results demonstrated that ventral neurons in spinal cord contain all above investigated factors. It indicated that these factors are involved in the physiological process of ventral neuron in spinal cord.
, http://www.100md.com
Key words：Ventral neuron of spinal cord； NGF； BDNF； NT3； NT4 and GDNF； Co-expression
神经生长因子〔1〕(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子〔2〕(brain derived neurotropic factor,BDNF)，神经营养因子3，4〔3，4〕(nerotrophin-3,NT3;neurotrophin-4,NT4)和胶质源性神经营养因子〔5〕(glia derived neurotrophic factor,GDNF)是神经营养因子家族(neurotrophic factors,NTFs)的5个主要成员.虽然其生理作用各有异同，但在维持发育中神经元存活和促进神经突起生长方面，各因子均有不同程度的作用.此外，近年还发现一些生长因子可能参与成体神经元的生理过程，进而拓宽了人们对NTFs功能的认识.但是，由于生物体高度复杂，因此，即使神经元要执行某一专一功能也可能尚需多种因子参与作用.本文用免疫组织化学方法观察腹角神经元是否同时含有NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF，以了解这些生长因子与脊髓腹角神经元功能的关系.
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1 材料和方法
1.1 样本获取
成年雄猫(体重3～3.5 kg)5只，3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L5脊髓入20%蔗糖PBS下沉过夜.恒冷箱连续切片(纵切)，厚20 μm.每例每节间断取片分为2组，每组5张切片.
1.2 免疫组化双标染色
取各组切片分别用NGF(1：2 500，Sigma),BDNF(1:500,Santa Cruz),NT3(1:1 500,Santa Cruz),NT4(1:1 000,Sigma),GDNF(1:1 000,Santa Cruz)的抗血清行免疫组化双标染色.程序如下：
0.05MPBS漂洗10 min×2，3%羊血清PBS 37°C 30 min；一抗(含3%羊血清，0.3%TritonX-100，0.01mol PBS配制)37℃ 2 h，4°C过夜：PBS洗10 min×2；羊抗兔IgG(1:200,0.01 mol PBS配制)37℃ 90 min；PBS洗10 min×2；AB复合物(1：100，0.01 mol PBS配制)；37℃ 1 h；PBS洗10 min×2；DAB显色5 min.PBS终止反应；分别加入另一生长因子一抗37°C孵育2 h，4℃过夜后，同上程序重复一次，至显色之前改用TMB兰色反应显色，PBS终止反应.裱片，脱水，树胶封片，观察各生长因子在腹角神经元的分布情况.
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2 结果
双标染色切片上，脊髓腹角神经元均含有NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF的免疫阳性反应物.表明脊髓腹角神经元同时含有上述被检测的5种生长因子，只是各因子的细胞内定位有差异.NGF者主要是细胞核染色，胞浆浅染.NT3，NT4者有的有核染色现象，但有的仅为胞浆染色，GDNF，BDNF者则主要是胞浆染色.神经元的神经突起内均见各因子的阳性反应物，见附图.
附图 a：NGF,BDNF在腹角神经元共存(↓)100×
b：NT-3，GDNF在腹角神经元共存(↓)200×
3 讨论
, 百拇医药
本文在腹角神经元观察到NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF的免疫阳性反应物.表明腹角神经元含有这些生长因子，提示这些因子均可能在脊髓腹角神经元的生理过程中发挥作用.之前，已有报道表明，NGF对培养的成体初级感觉神经元存活有维持作用[6],提示某些生长因子可能与成体神经元存活有关.本文现察到5种生长因子在成体腹角神经元共存，说明这些因子的存在可能对腹角神经元有一定的作用，该结果为进一步加深理解多种NTFs可能在成体神经元的生理过程中同时发挥作用提供了一些有用的形态学证据.但是，这些因子在腹角神经元的具体作用并不清楚，据文献报道，NGF，BDNF，NT3均对脊髓运动神经元的存活有促进作用[7]，近年，NT4和GDNF对运动神经有作用的报道也相继被提供.本文推测，这些因子在腹角神经元共存，一种可能是参与成体脊髓运动神经元存活的维持作用，另一可能是作为一种必要贮备以利运动神经元适应损伤后反应，即一旦运动神经元受损，这些因子便可通过调整其水平参与营救损伤运动神经元.至今，已有文献报道当脊髓运动神经受损后给BDNF可营救受损的运动细胞.因此，成年猫脊髓腹角神经元5种生长因子共存可能不仅与神经元的生理过程有关，而且可能对神经元损伤后的自救反应有作用.本文的结果为了解腹角神经元与多种生长因子的关系提供了一些线索，但要具体阐明这些生长因子在腹角神经元的作用还有待做进一步深入细致的工作.
, 百拇医药
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：李维平(1960～)，男，浙江人，学士，副主任医师，研究方向：颅脑损伤.
参考文献
[1] ANGELETTI R H, BRAD SHAW P A.Nerve growth factor from the mouse submaxllary glands:amino acid sequence[J].Proc Natl Aacd Sci USA,1971,68:2417
[2] LEIBROCK J,LOTTSPEICH F,HOHN A.Moleculr cloning and expression of BDNF[J].Nature,1989,341:149
[3] MAISOPNPIERRE P C.Human and rat brain derived neurotrophic factor and neurotrophin-3:gene structure, distribution and chromosomallocalizaton[J].Geromics,19991,10:558
, http://www.100md.com
[4] HALLBOOK F,IBANEZ C F,PERSSON H.Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel memder adundantly expressed in xenopue ovary[J].Neuron,1991,6:845
[5] QIAO Y,MATHESON C.In vivo neurotphic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons[J].Nature,1995,373:341
[6] LEVI-MONTALCINI R, ANGELETTI P U.Nerve growth factor[J].Physiol Rev,1968,48:534
[7] OPPENHEIM R W ,YIN Q W, PREVTTE D.Brain derived neurotrphic factor rescues devloping avian motoneurons from cell death[J].Nature,1992,360:755
(2000-05-10收稿), 百拇医药
单位：李维平(深圳红十字会医院神经外科，深圳 518035)；王廷华 徐蔚(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：腹角神经元；NGF，BDNF，NT3,NT4与GDNF；共存
昆明医学院学报000303 摘要：用NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF抗血清，以免疫组织化学方法观察NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF在成年猫L5脊髓腹角神经元是否共存.结果：L5脊髓腹角神经元均含有上述被检测的5种神经营养因子的免疫反应物，表明腹角神经元共存NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF，提示这5种神经营养因子可能与脊髓腹角神经元的生理过程有关.
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中图分类号：Q 426 文献标识码：A 文章编号：1003-4076(2000) 03-0011-03
The Co-expression of NGF, BDNF, NT3, NT4 and
GDNF in Neurons of Ventral Horn of Spinal Cord
LI Wei-ping，(Department of Neurological Surgery, Shenzhen Red-cross Hospital, Shenzhen 518035)
WANG Ting-hua，XU Wei
(Institute for Research on Neuroscience, Kunming Medical College, Kunming 650031)
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Abstract：The co-expression of nerve growth factor (NGF), brain derived neurotrophic factor(BDNF), Neurotrophin3(NT3), Neurotrophin4(NT4), and glia derived neurotrophic factor (GDNF) in ventral neuron of spinal cord was studied by ABC immunohistochemical method using antibody of NGF, BDNF, NT3, NT4 and GDNF. The distribution on the positive products of NGF, BDNF, NT3, NT4 and GDNF in segment L5 was observed in ventral neurons of spinal cord. The results demonstrated that ventral neurons in spinal cord contain all above investigated factors. It indicated that these factors are involved in the physiological process of ventral neuron in spinal cord.
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Key words：Ventral neuron of spinal cord； NGF； BDNF； NT3； NT4 and GDNF； Co-expression
神经生长因子〔1〕(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子〔2〕(brain derived neurotropic factor,BDNF)，神经营养因子3，4〔3，4〕(nerotrophin-3,NT3;neurotrophin-4,NT4)和胶质源性神经营养因子〔5〕(glia derived neurotrophic factor,GDNF)是神经营养因子家族(neurotrophic factors,NTFs)的5个主要成员.虽然其生理作用各有异同，但在维持发育中神经元存活和促进神经突起生长方面，各因子均有不同程度的作用.此外，近年还发现一些生长因子可能参与成体神经元的生理过程，进而拓宽了人们对NTFs功能的认识.但是，由于生物体高度复杂，因此，即使神经元要执行某一专一功能也可能尚需多种因子参与作用.本文用免疫组织化学方法观察腹角神经元是否同时含有NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF，以了解这些生长因子与脊髓腹角神经元功能的关系.
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1 材料和方法
1.1 样本获取
成年雄猫(体重3～3.5 kg)5只，3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L5脊髓入20%蔗糖PBS下沉过夜.恒冷箱连续切片(纵切)，厚20 μm.每例每节间断取片分为2组，每组5张切片.
1.2 免疫组化双标染色
取各组切片分别用NGF(1：2 500，Sigma),BDNF(1:500,Santa Cruz),NT3(1:1 500,Santa Cruz),NT4(1:1 000,Sigma),GDNF(1:1 000,Santa Cruz)的抗血清行免疫组化双标染色.程序如下：
0.05MPBS漂洗10 min×2，3%羊血清PBS 37°C 30 min；一抗(含3%羊血清，0.3%TritonX-100，0.01mol PBS配制)37℃ 2 h，4°C过夜：PBS洗10 min×2；羊抗兔IgG(1:200,0.01 mol PBS配制)37℃ 90 min；PBS洗10 min×2；AB复合物(1：100，0.01 mol PBS配制)；37℃ 1 h；PBS洗10 min×2；DAB显色5 min.PBS终止反应；分别加入另一生长因子一抗37°C孵育2 h，4℃过夜后，同上程序重复一次，至显色之前改用TMB兰色反应显色，PBS终止反应.裱片，脱水，树胶封片，观察各生长因子在腹角神经元的分布情况.
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2 结果
双标染色切片上，脊髓腹角神经元均含有NGF，BDNF，NT3,NT4及GDNF的免疫阳性反应物.表明脊髓腹角神经元同时含有上述被检测的5种生长因子，只是各因子的细胞内定位有差异.NGF者主要是细胞核染色，胞浆浅染.NT3，NT4者有的有核染色现象，但有的仅为胞浆染色，GDNF，BDNF者则主要是胞浆染色.神经元的神经突起内均见各因子的阳性反应物，见附图.
附图 a：NGF,BDNF在腹角神经元共存(↓)100×
b：NT-3，GDNF在腹角神经元共存(↓)200×
3 讨论
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本文在腹角神经元观察到NGF，BDNF，NT3,NT4和GDNF的免疫阳性反应物.表明腹角神经元含有这些生长因子，提示这些因子均可能在脊髓腹角神经元的生理过程中发挥作用.之前，已有报道表明，NGF对培养的成体初级感觉神经元存活有维持作用[6],提示某些生长因子可能与成体神经元存活有关.本文现察到5种生长因子在成体腹角神经元共存，说明这些因子的存在可能对腹角神经元有一定的作用，该结果为进一步加深理解多种NTFs可能在成体神经元的生理过程中同时发挥作用提供了一些有用的形态学证据.但是，这些因子在腹角神经元的具体作用并不清楚，据文献报道，NGF，BDNF，NT3均对脊髓运动神经元的存活有促进作用[7]，近年，NT4和GDNF对运动神经有作用的报道也相继被提供.本文推测，这些因子在腹角神经元共存，一种可能是参与成体脊髓运动神经元存活的维持作用，另一可能是作为一种必要贮备以利运动神经元适应损伤后反应，即一旦运动神经元受损，这些因子便可通过调整其水平参与营救损伤运动神经元.至今，已有文献报道当脊髓运动神经受损后给BDNF可营救受损的运动细胞.因此，成年猫脊髓腹角神经元5种生长因子共存可能不仅与神经元的生理过程有关，而且可能对神经元损伤后的自救反应有作用.本文的结果为了解腹角神经元与多种生长因子的关系提供了一些线索，但要具体阐明这些生长因子在腹角神经元的作用还有待做进一步深入细致的工作.
, 百拇医药
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：李维平(1960～)，男，浙江人，学士，副主任医师，研究方向：颅脑损伤.
参考文献
[1] ANGELETTI R H, BRAD SHAW P A.Nerve growth factor from the mouse submaxllary glands:amino acid sequence[J].Proc Natl Aacd Sci USA,1971,68:2417
[2] LEIBROCK J,LOTTSPEICH F,HOHN A.Moleculr cloning and expression of BDNF[J].Nature,1989,341:149
[3] MAISOPNPIERRE P C.Human and rat brain derived neurotrophic factor and neurotrophin-3:gene structure, distribution and chromosomallocalizaton[J].Geromics,19991,10:558
, http://www.100md.com
[4] HALLBOOK F,IBANEZ C F,PERSSON H.Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel memder adundantly expressed in xenopue ovary[J].Neuron,1991,6:845
[5] QIAO Y,MATHESON C.In vivo neurotphic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons[J].Nature,1995,373:341
[6] LEVI-MONTALCINI R, ANGELETTI P U.Nerve growth factor[J].Physiol Rev,1968,48:534
[7] OPPENHEIM R W ,YIN Q W, PREVTTE D.Brain derived neurotrphic factor rescues devloping avian motoneurons from cell death[J].Nature,1992,360:755
(2000-05-10收稿), 百拇医药