作者：曹学兵 孙圣刚 黄怀钧 童萼塘 杨明山
单位：同济医科大学附属协和医院神经科，武汉 430022
关键词：细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂；髓质过氧化物酶；局灶性短暂性脑缺血；脑损伤；大鼠
同济医科大学学报000325 摘要 为探讨局灶性短暂性鼠脑缺血及再灌注时细胞 因子介导的中性粒细胞化学吸附剂(CINC)的动态变化和作用，用线栓法制备缺血1 h再灌不 同时间的鼠局灶性脑缺血/再灌注模型，采用ELISA法测定缺血侧大脑中动脉供血区(MCA区 )和大脑前动脉供血区(ACA区)脑组织内CINC浓度，并同步检测髓质过氧化物酶(MPO)活 性。结果发现，在再灌注1 h以上各组缺血脑组织内CINC浓度与缺血1 h未再灌注时比较都有 明显升高，差异均有极显著性意义(P<0.01)。CINC浓度达顶峰出现在再灌注12 h。 在 再灌注12 h以上各组MCA区MPO活性与再灌注3 h比较，差异均有极显著性意义(P<0.01 )。MPO活性达顶峰出现在再灌注24 h。结果表明：短暂缺血再灌注时，缺血脑组织产生的C INC有促进脑损伤的作用。
中图法分类号 Q55, R651.1, R743.31
Dynamic Change of Cytokin-induced Neutr ophil Chemoattractant in Focal
Transient Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rat s
Cao Xuebing
(Department of Neurology, Xiehe Hospital, Tongji M edical University, Wuhan 430022)
Sun Shenggang
(epartment of Neurology, The Second Hospital of Hubei Medical University, W uhan 430070)
Huang Huaijun
(epartment of Neurology, The Second Hospital of Hubei Medical University, W uhan 430070)
Abstract In order to investigate the dynamic change and functio n of cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC) in focal transient cereb ral ischemia/reperfusion in rats, the rat model of middle cerebral artery occlu sion (MCAO) for 1 h and reperfusion for various durations was made by using th read embolism. The concentrations of CINC and the myeloperioxidase (MPO) activit ies in the brain tissues of middle cerebral artery (MCA) area and anterior cereb ral artery (ACA) area were observed respectively and simultaneously. In the repe rfusion group CINC concentrations were increased significantly as compared with those in the group without reperfusion (P<0.01). CINC concentration reached its peak at 12 h after reprefusion. MPO activities in the groups of reperfusion for more than 12 h were significantly increased as compared with that in the gr oup of reperfusion for 3 h (P<0.01). MPO activity peaked at the 24th h afte r reperfusion. The results indicated that in focal transient cerebral ischemia/r eperfusion, the CINC produced by cerebral tissue might play a role in promoting the injury of the brain.
Key words cytokin-induced neutrophil chemoattractant; myelope rioxidase; focal transient cerebral ischemia; brain injuy; rat
近年来，随着超早期溶栓技术的开展，脑缺血再灌注脑损伤的问题更加引起广泛关注。以前 的研究发现，脑缺血可导致白细胞向缺血脑组织内浸润，而以再灌注早期最明显。最近的研 究进一步证实，CINC/IL-8可能参与了这一过程
[1，2]。本研究通过观察缺血再灌 注侧大脑中动脉供血区(MCA区)和大脑前动脉供血区(ACA区，即同侧未缺血区)脑组织内CI NC含量和MPO活性的动态变化，旨在探讨CINC在短暂脑缺血再灌注脑损伤中的作用。
1 材料与方法
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大白鼠，体重225～250 g，由湖北医科大学实验动物 饲养中心提供。CINC测定试剂由日本国岗山大学免疫系李君武博士赠送。
1.1 动物模型
采用Yuji(1995)
[3]报道的大白鼠局灶性脑缺血再灌注线栓模型稍加改进。麻醉前1 0 min大鼠腹腔注射阿托品(5 mg/100 g)，麻醉用10%水合氯醛腹腔注射(30～40 mg/100 g) ，麻醉后仰卧固定于手术台上，颈部正中切开，逐层分离组织，暴露左侧颈总动脉(CCA)、 颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎CCA近端、ECA根部。在CCA结扎处远端剪一斜口，经 此斜口插入尼龙丝，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA)以阻断MCA的血流。尼龙丝 平均插入深度为(18.5±0.5) mm，结扎ICA以固定尼龙丝和防止出血，缝合皮肤，尼龙丝 末端暴露在外。脑缺血未灌注组不拔出尼龙丝使脑组织缺血；再灌注组缺血1 h后，拔出尼 龙丝再灌注不同时程。假手术组除不插入尼龙丝外，其余步骤同脑缺血未灌注组；正常对照 组不 作任何处理。
1.2 动物分组
将64只雄性SD大白鼠，随机分为缺血1 h未灌注组、再灌注1、3、6、12、24、48、72 h共8组。每组均为8只。其中每组6只大鼠用作免疫及生化检测，其余则用于组织病理学观 察。
1.3 MPO活性测定
缺血区MPO活性测定用Barone等
[4]报道的方法。MPO活性用标准溶液计算。1 U MPO定义为：25 ℃下每min分解1 μmol过氧化物。
1.4 CINC水平测定
断头取脑，MCA梗塞区、ACA区脑组织按时间点切除；每组脑组织都先经氯化-2，3，5 -三苯基四氮唑(TTC)染色以确定缺血区范围。用5倍体积PBS(含5 g/L小牛血清，0.5 ml/ L Tween-20)用匀浆器 (100 mg湿重/0.5 ml)，匀浆液离心, 3000 r/min, 15min，4℃。 收集上清于-80℃保存待检。按ELISA法测定标本中CINC水平。
1.5 统计学处理
结果以
±s表示。组内不同灌注时程以及组间差异采用单因素方差分 析和非配对资料的t检验。
2 结果
2.1 脑组织内CINC浓度
再灌注1 h以上各组，脑组织内CINC浓度与未再灌注时比较都有明显升高，差异均有极显著 性意义(均为P<0.01)。再灌注1 h脑组织内CINC即开始升高，高峰在再灌注12 h，以 后逐渐下降，再灌注72 h时仍处于较高水平。再灌注6～24 h三组MCA区CINC浓度明显高于AC A区，差异均有极显著性意义(均为P<0.01)，见表1。
表1 缺血1 h不同再灌注时间MCA、ACA区CINC浓度(ng/g湿重)
未再灌注
再灌注时间(h)
1
3
6
12
24
48
72
MCA
0.15±0.03
0.80±0.30
*
1.80±0.20
*
4.80±1.10
* △
1 4.50±1.80
*△
6.30±0.70
*△
1.20±0.30
*
1.50±0. 50
*
ACA
0.14±0.04
0.60±0.20
*
1.20±0.50
*
2.20±0.80
*
4.50±1.20
*
3.40±1.00
*
1.00±0.20
*
0.80±0.24
*
与未再灌注组比较
* P<0.01;与同期ACA区比较
△ P<0.0 12.2 脑组织内MPO活性
再灌注6 h MCA区MPO活性开始升高，而ACA区MPO活性较低并于再灌注12 h才开始升高，高峰 都位于再灌注24 h。再灌注72 h时ACA区MPO活性恢复正常水平。MCA区MPO活性在再灌注12～ 72 h各组与再灌注3 h比较，差异均有极显著性意义(均为P<0.01)。与同期ACA区MPO 活性比较，再灌注12～72 h各组MCA区MPO活性均高，差异均有极显著性意义(均为P<0 .01)，见表2。
表2 缺血1 h再灌注不同时间MCA、ACA区MPO活性(U/g湿重)
未再
灌注
再灌注时间(h)
1
3
6
12
24
48
72
MCA
0
0
0.04±0.01
0.05±0.01
0.13±0.02
△*
0. 32±0.06
△*
0.26±0.04
△*
0.18±0.01
△*
ACA
0
0
0
0.04±0.01
0.05±0.01
0.07±0.02
0.04 ±0.01
0.03±0.01
与未再灌注3 h组比较
△P<0.01;与同期ACA区比较
*P<0.013 讨论
本研究表明：①脑缺血侧MCA区CINC出现早，早于MPO活性升高；浓度高，约为同期ACA 区的3～4倍，而ACA区仍呈低水平表达；高峰在再灌注12 h；②MPO活性变化与病变组织内中 性粒细胞浸润程度成正比，随着CINC浓度的下降，病变组织内中性粒细胞的聚积和浸润过程 逐渐发生了逆转。这些结果提示：短暂脑缺血再灌注时，脑组织内CINC的表达可能发挥促进 脑损伤的作用。
Wu等
[5]报道用2 mg抗CINC抗体经腹腔注射入鼠体内可显著抑制缺血脑组织中 CINC的产生，浸润的中性粒细胞数目减少，同时脑水肿程度也明显减轻。Yamasaki等
[ 1，2]用抗CINC抗体治疗脑缺血再灌注动物时发现，治疗后缺血脑组织内的MPO活性显著 地被抑制，再灌注7 d后的缺血坏死区面积显著地减小。这些研究报道和本研究的结果都提 示CINC能促进缺血再灌注脑损伤。
短暂脑缺血再灌注时CINC是如何产生的呢？有研究认为
[6]，低氧或缺氧状态 可诱导中性粒细胞，单核细胞和血管内皮细胞产生CINC/IL-8，但其幅度不高而同时伴有IL -8 mRNA表达增加；再灌注引起的组织内氧浓度的增加可进一步诱导白细胞和内皮细胞产生 CINC；再灌注时产生的H
2O
2，O
2-，OH
-等自由基能显著地诱导人单核细胞产 生 IL-8；低氧能诱导鼠心肌细胞产生CINC，而这一过程又能被再灌注过程所加强。Hisama等
[7]研究发现再灌注前静脉内注射了肝素可减少再灌注后CINC的浓度。由于肝素是 通过加强血浆抗血栓素-Ⅲ活性，抑制血栓素从而防止静脉血栓的形成，阻止纤维蛋白的形 成，因此作者推测微血栓的形成有助于缺血再灌注时细胞因子的产生。从实验结果看，再灌 注组的CINC水平比相应缺血组的水平都高。随着血液和组织中氧浓度的恢复，缺血再灌注产 生的自由基及时清除，凝血机制趋于正常，血管内皮细胞功能的改善等，脑组织内的CINC浓 度逐渐下降至正常水平。
MPO是中性粒细胞和单核细胞所特有的细胞内酶，以MPO活性反映组织内中性粒细胞积聚 并作为炎性细胞浸润的定量指标是很有价值的。Matsuo等
[8]认为缺血1 h再灌注提 供了足够的刺激诱导缺血脑区中性粒细胞积聚。本实验发现，缺血1 h再灌注24 h MPO活性 达高峰，以后逐渐下降。从缺血1 h不同再灌注时相分析，CINC浓度升高早于MPO活性升高的 时相。CINC具有特异性地趋化中性粒细胞的作用，从两者出现的时相看，缺血再灌注早期脑 组织内CINC的升高有助于随后中性粒细胞在组织内的积聚和MPO活性的升高。再灌注时缺血 侧ACA区CINC浓度升高对ACA区脑组织有何影响呢？在再灌注MPO活性观察中，我们发现ACA区 的MPO活性并无显著的升高也未见有大量的中性粒细胞积聚。CINC趋化中性粒细胞向组织内 浸润，必须 通过ICAM-1与CD
11/CD
18结合使中性粒细胞粘附于血管内皮才能游出血管壁到 组织中。研究已发现
[6]，再灌注时缺血区血管内皮ICAM-1和CD
11/CD
1 8表达增高，PAF和PAF介导的活性氧也能增加CD
11/CD
18-ICAM-1依赖性中 性粒细胞与内皮细胞的粘附，而未缺血区未见异常表达。我们推测，ACA区MPO活性不高可能 与血管内皮ICAM-1和CD
11/CD
18表达有关，但是这仍有待进一步的研究加以论 证。
(致 谢：本实验得到了同济医院神经科张苏明教授、王伟博士后、卜碧涛副教授的 热忱帮助，特此一并致谢。)
曹学兵，男，1968年生，博士研究生
参 考 文 献
1，Yamasaki Y, Matsuo Y, Zagorski J et al. New therapeutic possib ility of blocking cytokine-induced neutrophil chemoattractant on transient isc hemic brain damage in rats. Brain Research, 1997，759：103
2，Yamasaki Y. Involvement of cytokine production in pathogenesis of transient cerebral ischemic damage. Keio J Med, 1996，45:225
3，Yuji K, Kazuo M, Takenori Y et al. Nylonmonofilament for intralu minal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke,1995,26:1655
4，Bederson J B,Pitts L H,Tsuji M et al. Rat middle cerebral arter y occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examinat ion. Stroke,1986，17:472
5，Wu X, Wittwer A J, Carr L S et al. Cytokine-induced neutrophil chemoattractant mediates neutrophil influx in immune complex glomerulonephri tis in rat. J Clin Invest,1994，94：337
6，Karakurum M, Shreeniwas R, Chen J et al. Hypoxic induction of in terleukin-8 gene expression in human endothelial cells. J Clin Invest, 1994 ，93:1564
7，Hisama N, Yamaguchi Y, Ishiko T et al. Kupffer cell production o f cytokine-induced neutrophil chemoattractant following ischemia/reperfus ion injury in rats. Hepatology, 1996，24:1193
8，Matsuo Y, Onodera H, Shiga M et al. Correlation between myelo peroxidase-quantified neutrophil accumulation and ischemic brain injury i n the rat: Effects of neutrophil depletion. Stroke,1994，25:1469
(1998-12-21 收稿)
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