壳聚糖作为敏感膜材料的研究
作者：方华丰 周宜开 袁津玮 任恕
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：壳聚糖；敏感膜；化学发光；生物传感器
同济医科大学学报000310 摘要 以壳聚糖为膜材料制成薄膜，运用生物素-亲和素系统将辣根过氧化物酶(HRP)固定在膜 上，固定化过程对HRP的活性无影响，而其稳定性提高，运用Luminol-H2O2-HRP化学 发光体系，对水样中微量H2O2进行检测，在10-6 ～10-9 mol/L范围内线 性关系良好，回归方程：Y=20.648X-215.239(X:nmol/L), 检测灵敏度为0.5 nmol/ L。实验研制的壳聚糖膜可制成生物传感器多功能敏感膜。
, 百拇医药 中图法分类号 R318.021， R329.2
Study on Chitosan as Sensing Membrane M aterials
Fang Huafeng Zhou Yikai Yuan Jinwei et al
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030)
Abstract Biotin-avidin system was used to fix HRP on a thin me mbrane which was made from chitosan.The trace hydrogen peroxide in water samples was determined by using enhanced chemiluminescence (ECL) detection with Luminol -H2O2-HRP reaction system. The linear correlation was good at the range of 10-6 to 10-9 mol/L. Correlation formulation: Y=20.648X-215.239 (X:nmol). The lower detection limit for H2O2 was 0.5 nmol. The manufactur ed HRP-chitosan membrane could be used as a sensing membrane of biosensor for dete ction of H2O2 in vivo.
, 百拇医药
Key words chitosan； sensing membrane； biosensor； chemilum inescene
近几年来，固定化技术取得了较大的发展，很多生物活性物质被固定于电极表面，制成专一 性强、灵敏度高的生物传感器[1]。通过选择适当的载体及固定方法，可以大大提 高生物活性物质的稳定性，维持其生物活性。亲和素-生物素之间具有高度专一和强烈的相 互作用,在pH、温度、有机溶剂或变性剂等较大的变化范围内均能稳定存在，已广泛应用于 蛋白质的固定及生物传感器[2]，亲和素-生物素系统的应用开辟了一类新的固定 化方法，它可方便地设计分子结构单元来赋予膜特定的功能[3]。
人们对壳聚糖用于固定酶等生物大分子很感兴趣，主要是由于它无毒，具有生物相容性等优 良的生物学性能，制成膜后，无色透明，具有较好的物理机械性能，它有丰富的氨基，可以 与酶共价偶联。Krajewska等用戊二醛的方法将尿激酶固定于壳聚糖膜上[4]。然而 用这种方法很容易使壳聚糖膜变黄、变硬、变脆，膜很容易破碎，不宜用于制备敏感膜，我 们采用了一系列浓度的戊二醛和甲醛实验都得到同样的结果，在本实验中，我们采用了一种 新的固定化方法。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
活性生物素(biotin-LC-NHS, Sigma公司)；亲和素(Avidin， Sigma公司)；生物素化辣根 过氧化物酶(B-HRP，Sigma公司)；亲和素辣根过氧化物酶(A-HRP，Sigma公司)； HRP (T YPE VI RI=3.0，sigma公司)；鲁米诺(luminol, Serva公司)；对碘苯酚(paraiodophenol, PIP, Merck公司)；H2O2(浙江省临安县化工二厂)；壳聚糖(脱乙酰度80%，自制)。
发光工作液用0.2 mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制(含luminol 3.0×10-4 mol/L；H 2O2 5.0×10-3 mol/L；PIP 6.0×10-4 mol/L)，发光工作液临用前 配制，静置2 h后使用。
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1.2 壳聚糖膜的制备
壳聚糖膜的制备方法参考Amiji等[5]人的方法，将适量的壳聚糖溶于0.1 mol/L冰 醋酸溶液，制成0.1 %(w/v)溶液，抽滤，将滤液置于塑料培养皿内，自然晾干，然后置于0 .1 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h，用去离子双蒸水反复洗涤、浸泡，80 ℃烘干或贮存于PBS (pH7.4)中备用，调整壳聚糖用量后，可制得不同厚度的壳聚糖膜。
1.3 壳聚糖膜吸水率的测定
取膜厚约45～50 μm的壳聚糖膜浸泡于10 mmol/L冰醋酸及 PBS(pH7.4)中各10 min， 测定其吸水率。
吸水率=(Ws-Wd)/Ws×100%
(Ws：吸水后膜湿重； Wd：膜干重)
, 百拇医药
1.4 壳聚糖膜的生物素化
取约2 cm2壳聚糖膜，加Biotin-LC-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)液0.5 ml (1 mg/ml) ，0.1 mol/L NaHCO3溶液1 ml，置于小烧杯中，室温振动反应4 h，然后置4 ℃冰箱中过 夜。用PBS反复洗涤，浸泡。
1.5 壳聚糖膜上HRP固定
固定HRP采用A、B两种方法，见图1。
图1 辣根过氧化物酶固定于壳聚糖膜
1.5.1 A:取生物素化的壳聚糖膜，加Av-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反应 30 min，PBS洗涤3次。为了检验该过程，同时作对照实验：①取未生物素化膜，其余过程同 上；②取生物素化壳聚糖膜，先加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, 再与Av-HRP反应。
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1.5.2 B：取生物素化的壳聚糖膜，加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反 应30 min，PBS洗涤3次，再加Biotin-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反应30 mi n，PBS洗涤3次。同时作对照实验：①取未生物素化的壳聚糖膜，其余过程同上，②不加亲 和素，直接加Biotin-HRP，其余过程同上，③以HRP替代B-HRP。
1.6 化学发光检测HRP
检测方法参照袁津玮等报道的方法[5]，取壳聚糖膜约2 cm2,置发光管中 ，加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没壳聚糖膜，加发光工作液100 μl，静置5 min，25 ℃， 记录连续测定的发光强度最大值及6 s积分值。
1.7 HRP-壳聚糖膜检测水样中H2O2
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取固定有HRP的壳聚糖膜约2 cm2，加入发光管,加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没膜，加入 不同H2O2浓度的发光工作液100 μl，摇匀后，静置5 min,在LKB-1251发光仪(Pharma cia公司)上，连续测定最大发光强度。
1.8 壳聚糖膜上HRP稳定性
为了检验壳聚糖膜上HRP的稳定性,将HRP壳聚膜(约2 cm2)置于pH7.4 PBS中，同时用 与HRP壳聚糖膜发光强度近似的游离HRP(2×10-9 mol/L)作对照，4 ℃贮存，定时 取样，按1.6方法测定发光强度。
2 结果
2.1 壳聚糖膜的制备
文献报道的制备壳聚糖膜的方法[6]是将壳聚糖醋酸溶液倾注于平板玻璃上，晾干 后即可成膜。实验中发现，壳聚糖膜对玻璃的粘附性很强，这样制得的膜很难取下，需用甘 油预涂表面，本实验改在具有一定极性的塑料培养皿中制膜,效果很好。壳聚糖对塑料表面 有一定的润湿能力，可以铺展成膜,晾干后粘附力降低，壳聚糖膜可以完整地取下,而且调整 壳聚糖用量，可以得到不同厚度的壳聚糖膜，本实验制得的壳聚糖膜无色透明,柔韧性好,具 有较好的机械强度。
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2.2 壳聚糖膜的稳定性及吸水率
研究表明，介质pH对壳聚糖膜的稳定性影响很大，在酸性条件下，壳聚糖膜易溶解，介质pH 越低，壳聚糖膜的稳定性越差。在pH3.5的溶液中壳聚糖膜0.5 h即变为絮状，但在pH>7 .0的条件下，壳聚糖膜不溶解，较稳定。壳聚糖膜有较高的吸水率，吸水后膜变厚，其吸 水率与介质pH有关，在酸性介质中，吸水率较高。
表1 壳聚糖膜在不同介质中吸水率和厚度 介 质
吸水率(%)
膜厚(μm)
冰醋酸
72.30±3.27
62.50±0.86
, 百拇医药
磷酸盐缓冲液
37.90±1.52
47.00±4.78
2.3 壳聚糖膜的生物素化及化学发光检测
壳聚糖上有丰富的伯氨基,性质较活泼,可以与生物素琥珀酰亚胺脂反应。影响增强化学发光强度的因素很多[7],如各物质的浓度,缓冲液pH、反应时间 、反应 温度等，本文增强化学发光检测条件是按有关文献进行的[5]。实验表明,在Lumino l-H2O2-HRP-PIP发光体系中，为了获得理想的发光检测效果，pH在8.0～8.7之间 为宜， 由于HRP的化学发光属于较平稳的持续发光， 因而增强化学发光达到相对稳定需要 一定时间，一般以静置5 min为宜。壳聚糖膜上HRP催化Luminol氧化发光，其检测结果见表 2。
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表2 化学发光检测壳聚糖膜上HRP 固定方法
最大发光强度
(RLU/cm2)
分光强度
6S积分值
(RLU/cm2)
A
Av-HRP
3 037±52
18 458±212
Av Av-HRP
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1 156±37
6 438±106
non-biotinylated
membrane Av-HRP
25±3
131±6
B
Av B-HRP
2 951±86
17 875±187
B-HRP
103±32
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615±87
Av HRP
38±5
215±38
non-biotinylated
membrane B-HRP
27±6
129±12
2.4 水样中H2O2检测
H2O2浓度对化学发光影响较为显著, 可能是在不同条件下,化学发光反应机制不同所致 [8] , 一定范围内H2O2浓度与发光强度呈正相关,但其浓度不宜太高,否则,背景会相应增加, 而H2O2 浓度太低时,由于其本身不稳定,导致发光强度变异较大,因而我们采用去离子双蒸水配制 系列浓度H2O2,其检测结果见图2。直线方程为：Y=20.648X-215.239(X：nmol/ L)r=0.994，检测限为0.5 nmol/L。
, 百拇医药
图2 壳聚糖膜检测水样中H2O2
2.5 壳聚糖膜上HRP的固定及稳定性
我们在实验中发现,壳聚糖膜在醛基的作用下变黄、变脆，而且脱乙酰度越大，这种现 象越明显，这种壳聚糖膜极易破碎，不宜作为敏感膜，我们采用生物素-亲和素间的桥连作 用，成功地将HRP固定到壳聚糖膜上，而不改变膜的基本特征，所制备的敏感膜无色透明， 柔韧，机械性能较好，可以作为自载膜。
HRP固定于壳聚糖膜后，其稳定性增加，结果见图3。
图3 壳聚糖膜上HRP 的稳定性(4℃)
3 讨论
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本文首次报道将壳聚糖膜生物素化，并将HRP成功地固定于壳聚糖膜, 这种制备敏感膜的 方法有多种优点。① 壳聚糖是天然的高分子聚合物，其来源丰富，可根据不同需要很容易 制成不同厚度的薄膜；壳聚糖膜具有较好的机械性能，可制成自载膜， 在中性、碱性溶液 中稳定，可以在pH>7.0的水中长期浸泡；②生物素化生物大分子可以在壳聚糖膜上形成有 序膜或单分子层膜，可适用于蛋白质、酶、多肽、DNA等生物大分子的固定,制备过程不需复 杂的反应及有机溶剂， 对生物活性几乎没有影响，因而生物素化壳聚糖膜在医药工业及生 物传感器等方面，均有潜在的价值； ③应用载酶(HRP)壳聚糖膜，与化学发光反应相 结合，可对生物样品中的微量H2O2进行快速、灵敏检测。为构建生物体内H2O2自由 基生物传感器打下基础。
国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士研究生。
, http://www.100md.com
△ 通信联络人
参 考 文 献
1，Ziegler C, Gopel W .Biosensor development. Curr Opin Chem Biol， 1998，2:585
2，Wilchek M, Bayer E A. The avidin-biotin comples in bioanalytical applications. Anal Biochem，1988，171:1
3，方华丰,周宜开. 生物素-亲和素系统在生物传感器中的应用.化学传感器，1997，17：177
4，Barbara K, Maciej L,Wieslawa Z. Urease immobilized on chitosan membrane: preparation and properties. J chen Tech Biotechnol， 1990，48：337
, 百拇医药
5，袁津玮, 周宜开, 孙雅量等.应用化学发光自显影技术检测甲型肝炎病毒和 人IgM. 同济医科大学学报，1997，26(5): 362
6，Amiji M M. Permeability and blood compatibility properties of chitosan-poly(ethylene oxide) blend membranes for haemodialysis. Biomaterials，1995，16:593
7，梁 雁,林汉华,袁津玮等.化学发光法测定辣根过氧化物酶浓度的实验条件探 讨.同济医科大学学报，1998，27(6):445
8，Bibjanna C，Boris C, Reith R et al. Effect of oxygen abstraction on the peroxidase-luminol-perborate system: relevance to the HRP enhanced che miluminescence mechanism. J Biolumin Chemilumin，1994，9:273
(1999-07-12 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：壳聚糖；敏感膜；化学发光；生物传感器
同济医科大学学报000310 摘要 以壳聚糖为膜材料制成薄膜，运用生物素-亲和素系统将辣根过氧化物酶(HRP)固定在膜 上，固定化过程对HRP的活性无影响，而其稳定性提高，运用Luminol-H2O2-HRP化学 发光体系，对水样中微量H2O2进行检测，在10-6 ～10-9 mol/L范围内线 性关系良好，回归方程：Y=20.648X-215.239(X:nmol/L), 检测灵敏度为0.5 nmol/ L。实验研制的壳聚糖膜可制成生物传感器多功能敏感膜。
, 百拇医药 中图法分类号 R318.021， R329.2
Study on Chitosan as Sensing Membrane M aterials
Fang Huafeng Zhou Yikai Yuan Jinwei et al
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030)
Abstract Biotin-avidin system was used to fix HRP on a thin me mbrane which was made from chitosan.The trace hydrogen peroxide in water samples was determined by using enhanced chemiluminescence (ECL) detection with Luminol -H2O2-HRP reaction system. The linear correlation was good at the range of 10-6 to 10-9 mol/L. Correlation formulation: Y=20.648X-215.239 (X:nmol). The lower detection limit for H2O2 was 0.5 nmol. The manufactur ed HRP-chitosan membrane could be used as a sensing membrane of biosensor for dete ction of H2O2 in vivo.
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Key words chitosan； sensing membrane； biosensor； chemilum inescene
近几年来，固定化技术取得了较大的发展，很多生物活性物质被固定于电极表面，制成专一 性强、灵敏度高的生物传感器[1]。通过选择适当的载体及固定方法，可以大大提 高生物活性物质的稳定性，维持其生物活性。亲和素-生物素之间具有高度专一和强烈的相 互作用,在pH、温度、有机溶剂或变性剂等较大的变化范围内均能稳定存在，已广泛应用于 蛋白质的固定及生物传感器[2]，亲和素-生物素系统的应用开辟了一类新的固定 化方法，它可方便地设计分子结构单元来赋予膜特定的功能[3]。
人们对壳聚糖用于固定酶等生物大分子很感兴趣，主要是由于它无毒，具有生物相容性等优 良的生物学性能，制成膜后，无色透明，具有较好的物理机械性能，它有丰富的氨基，可以 与酶共价偶联。Krajewska等用戊二醛的方法将尿激酶固定于壳聚糖膜上[4]。然而 用这种方法很容易使壳聚糖膜变黄、变硬、变脆，膜很容易破碎，不宜用于制备敏感膜，我 们采用了一系列浓度的戊二醛和甲醛实验都得到同样的结果，在本实验中，我们采用了一种 新的固定化方法。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
活性生物素(biotin-LC-NHS, Sigma公司)；亲和素(Avidin， Sigma公司)；生物素化辣根 过氧化物酶(B-HRP，Sigma公司)；亲和素辣根过氧化物酶(A-HRP，Sigma公司)； HRP (T YPE VI RI=3.0，sigma公司)；鲁米诺(luminol, Serva公司)；对碘苯酚(paraiodophenol, PIP, Merck公司)；H2O2(浙江省临安县化工二厂)；壳聚糖(脱乙酰度80%，自制)。
发光工作液用0.2 mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制(含luminol 3.0×10-4 mol/L；H 2O2 5.0×10-3 mol/L；PIP 6.0×10-4 mol/L)，发光工作液临用前 配制，静置2 h后使用。
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1.2 壳聚糖膜的制备
壳聚糖膜的制备方法参考Amiji等[5]人的方法，将适量的壳聚糖溶于0.1 mol/L冰 醋酸溶液，制成0.1 %(w/v)溶液，抽滤，将滤液置于塑料培养皿内，自然晾干，然后置于0 .1 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h，用去离子双蒸水反复洗涤、浸泡，80 ℃烘干或贮存于PBS (pH7.4)中备用，调整壳聚糖用量后，可制得不同厚度的壳聚糖膜。
1.3 壳聚糖膜吸水率的测定
取膜厚约45～50 μm的壳聚糖膜浸泡于10 mmol/L冰醋酸及 PBS(pH7.4)中各10 min， 测定其吸水率。
吸水率=(Ws-Wd)/Ws×100%
(Ws：吸水后膜湿重； Wd：膜干重)
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1.4 壳聚糖膜的生物素化
取约2 cm2壳聚糖膜，加Biotin-LC-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)液0.5 ml (1 mg/ml) ，0.1 mol/L NaHCO3溶液1 ml，置于小烧杯中，室温振动反应4 h，然后置4 ℃冰箱中过 夜。用PBS反复洗涤，浸泡。
1.5 壳聚糖膜上HRP固定
固定HRP采用A、B两种方法，见图1。
图1 辣根过氧化物酶固定于壳聚糖膜
1.5.1 A:取生物素化的壳聚糖膜，加Av-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反应 30 min，PBS洗涤3次。为了检验该过程，同时作对照实验：①取未生物素化膜，其余过程同 上；②取生物素化壳聚糖膜，先加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, 再与Av-HRP反应。
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1.5.2 B：取生物素化的壳聚糖膜，加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反 应30 min，PBS洗涤3次，再加Biotin-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml，室温反应30 mi n，PBS洗涤3次。同时作对照实验：①取未生物素化的壳聚糖膜，其余过程同上，②不加亲 和素，直接加Biotin-HRP，其余过程同上，③以HRP替代B-HRP。
1.6 化学发光检测HRP
检测方法参照袁津玮等报道的方法[5]，取壳聚糖膜约2 cm2,置发光管中 ，加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没壳聚糖膜，加发光工作液100 μl，静置5 min，25 ℃， 记录连续测定的发光强度最大值及6 s积分值。
1.7 HRP-壳聚糖膜检测水样中H2O2
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取固定有HRP的壳聚糖膜约2 cm2，加入发光管,加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没膜，加入 不同H2O2浓度的发光工作液100 μl，摇匀后，静置5 min,在LKB-1251发光仪(Pharma cia公司)上，连续测定最大发光强度。
1.8 壳聚糖膜上HRP稳定性
为了检验壳聚糖膜上HRP的稳定性,将HRP壳聚膜(约2 cm2)置于pH7.4 PBS中，同时用 与HRP壳聚糖膜发光强度近似的游离HRP(2×10-9 mol/L)作对照，4 ℃贮存，定时 取样，按1.6方法测定发光强度。
2 结果
2.1 壳聚糖膜的制备
文献报道的制备壳聚糖膜的方法[6]是将壳聚糖醋酸溶液倾注于平板玻璃上，晾干 后即可成膜。实验中发现，壳聚糖膜对玻璃的粘附性很强，这样制得的膜很难取下，需用甘 油预涂表面，本实验改在具有一定极性的塑料培养皿中制膜,效果很好。壳聚糖对塑料表面 有一定的润湿能力，可以铺展成膜,晾干后粘附力降低，壳聚糖膜可以完整地取下,而且调整 壳聚糖用量，可以得到不同厚度的壳聚糖膜，本实验制得的壳聚糖膜无色透明,柔韧性好,具 有较好的机械强度。
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2.2 壳聚糖膜的稳定性及吸水率
研究表明，介质pH对壳聚糖膜的稳定性影响很大，在酸性条件下，壳聚糖膜易溶解，介质pH 越低，壳聚糖膜的稳定性越差。在pH3.5的溶液中壳聚糖膜0.5 h即变为絮状，但在pH>7 .0的条件下，壳聚糖膜不溶解，较稳定。壳聚糖膜有较高的吸水率，吸水后膜变厚，其吸 水率与介质pH有关，在酸性介质中，吸水率较高。
表1 壳聚糖膜在不同介质中吸水率和厚度 介 质
吸水率(%)
膜厚(μm)
冰醋酸
72.30±3.27
62.50±0.86
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磷酸盐缓冲液
37.90±1.52
47.00±4.78
2.3 壳聚糖膜的生物素化及化学发光检测
壳聚糖上有丰富的伯氨基,性质较活泼,可以与生物素琥珀酰亚胺脂反应。影响增强化学发光强度的因素很多[7],如各物质的浓度,缓冲液pH、反应时间 、反应 温度等，本文增强化学发光检测条件是按有关文献进行的[5]。实验表明,在Lumino l-H2O2-HRP-PIP发光体系中，为了获得理想的发光检测效果，pH在8.0～8.7之间 为宜， 由于HRP的化学发光属于较平稳的持续发光， 因而增强化学发光达到相对稳定需要 一定时间，一般以静置5 min为宜。壳聚糖膜上HRP催化Luminol氧化发光，其检测结果见表 2。
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表2 化学发光检测壳聚糖膜上HRP 固定方法
最大发光强度
(RLU/cm2)
分光强度
6S积分值
(RLU/cm2)
A
Av-HRP
3 037±52
18 458±212
Av Av-HRP
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1 156±37
6 438±106
non-biotinylated
membrane Av-HRP
25±3
131±6
B
Av B-HRP
2 951±86
17 875±187
B-HRP
103±32
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615±87
Av HRP
38±5
215±38
non-biotinylated
membrane B-HRP
27±6
129±12
2.4 水样中H2O2检测
H2O2浓度对化学发光影响较为显著, 可能是在不同条件下,化学发光反应机制不同所致 [8] , 一定范围内H2O2浓度与发光强度呈正相关,但其浓度不宜太高,否则,背景会相应增加, 而H2O2 浓度太低时,由于其本身不稳定,导致发光强度变异较大,因而我们采用去离子双蒸水配制 系列浓度H2O2,其检测结果见图2。直线方程为：Y=20.648X-215.239(X：nmol/ L)r=0.994，检测限为0.5 nmol/L。
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图2 壳聚糖膜检测水样中H2O2
2.5 壳聚糖膜上HRP的固定及稳定性
我们在实验中发现,壳聚糖膜在醛基的作用下变黄、变脆，而且脱乙酰度越大，这种现 象越明显，这种壳聚糖膜极易破碎，不宜作为敏感膜，我们采用生物素-亲和素间的桥连作 用，成功地将HRP固定到壳聚糖膜上，而不改变膜的基本特征，所制备的敏感膜无色透明， 柔韧，机械性能较好，可以作为自载膜。
HRP固定于壳聚糖膜后，其稳定性增加，结果见图3。
图3 壳聚糖膜上HRP 的稳定性(4℃)
3 讨论
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本文首次报道将壳聚糖膜生物素化，并将HRP成功地固定于壳聚糖膜, 这种制备敏感膜的 方法有多种优点。① 壳聚糖是天然的高分子聚合物，其来源丰富，可根据不同需要很容易 制成不同厚度的薄膜；壳聚糖膜具有较好的机械性能，可制成自载膜， 在中性、碱性溶液 中稳定，可以在pH>7.0的水中长期浸泡；②生物素化生物大分子可以在壳聚糖膜上形成有 序膜或单分子层膜，可适用于蛋白质、酶、多肽、DNA等生物大分子的固定,制备过程不需复 杂的反应及有机溶剂， 对生物活性几乎没有影响，因而生物素化壳聚糖膜在医药工业及生 物传感器等方面，均有潜在的价值； ③应用载酶(HRP)壳聚糖膜，与化学发光反应相 结合，可对生物样品中的微量H2O2进行快速、灵敏检测。为构建生物体内H2O2自由 基生物传感器打下基础。
国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士研究生。
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△ 通信联络人
参 考 文 献
1，Ziegler C, Gopel W .Biosensor development. Curr Opin Chem Biol， 1998，2:585
2，Wilchek M, Bayer E A. The avidin-biotin comples in bioanalytical applications. Anal Biochem，1988，171:1
3，方华丰,周宜开. 生物素-亲和素系统在生物传感器中的应用.化学传感器，1997，17：177
4，Barbara K, Maciej L,Wieslawa Z. Urease immobilized on chitosan membrane: preparation and properties. J chen Tech Biotechnol， 1990，48：337
, 百拇医药
5，袁津玮, 周宜开, 孙雅量等.应用化学发光自显影技术检测甲型肝炎病毒和 人IgM. 同济医科大学学报，1997，26(5): 362
6，Amiji M M. Permeability and blood compatibility properties of chitosan-poly(ethylene oxide) blend membranes for haemodialysis. Biomaterials，1995，16:593
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(1999-07-12 收稿), http://www.100md.com