增产菊胺酯对雄性小鼠生殖细胞能量代谢的影响
作者：毛新良 徐以平 宋瑞琨 石年
单位：同济医科大学公共卫生学院环境毒理学教研室, 武汉 430030
关键词：增产菊胺酯；能量代谢；生殖细胞
同济医科大学学报000309 摘要 采用酶组织化学方法研究了小鼠染毒后生殖细 胞SDH、LDH和ATPase活性的变化,结果发现，25.0～125.0 mg/kg体重剂量组染毒35 d后S DH、LDH和ATPase活性均受到抑制，说明增产菊胺酯不仅干扰睾丸细胞的有氧代谢及无氧代 谢的供能过程，还干扰细胞对能量的利用。提示能量代谢障碍可能是增产菊胺酯对雄性生殖 细胞毒 作用的机理之一。
中图法分类号 R595.4， R333.6， R321.1
Effects of Bachmedesh on Energy Met abolism in Male Germ Cells
, http://www.100md.com
Mao Xinliang Xu Yiping Song Ruikun et al
(Department of Environmental Toxicology, School of Publ ic Health,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract In order to investigate the possible toxic pathway of Bachmedesh to male reproductive system, the activities of SDH, LDH and ATPase in male germ cells were studied by using enzymohistochemical methods. It was obser ved that the activities of SDH, LDH and ATPase were dramatically suppressed in m iddle and high dosage experimental group animals, suggesting that Bachmedesh not only interfered with the energy-supply process of aerobic and anaerobic glycol ysis, but also the energy-utilization in germ cells.
, 百拇医药
Key words Bachmedesh; energy metabolism; male germ cells
增产菊胺酯(Bachmedesh)是我国科技工作者首次合成的植物生长调节剂，能较好地提高农 作物的产量和质量，我们在对其进行安全评价过程中发现该化合物具有较强的雄性生殖毒性 作用，主要表现为生殖细胞受到损伤和精子数量减少、质量降低，电镜发现高剂量增产菊胺 酯还能引起生殖细胞线粒体等细胞器损伤。为探讨其毒作用机理，本实验采用酶组织化学方 法从能量代谢的角度进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1受试药物：增产菊胺酯，白色粉末，纯度>99.0%，由武汉大学化学系提供。按急性毒性试验结果分别配制成低剂量组(5.0mg/kg)、中剂量组(25.0mg/kg)和高剂量组(125.0mg/kg)(分别相当于1/125，1/25，1/5LD50)。
, http://www.100md.com
1.1.2 实验动物：昆明种小鼠，雄性，6～7周龄，由同济医科大学实验动物学部提供。 动物经检疫1周后，将健康合格者随机分成4组，即低、中、高剂量组和阴性对照组，每组5 只。
1.1.3 主要试剂：硝基四氮唑蓝(NBT)，尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD)，德国B oehringer Mannhein公司产；琥珀酸钠，ATP，国产分析纯试剂。
1.1.4 主要仪器：AO恒冷箱，美国产；Olympus显微照像系统，日本产。
1.2 方法
1.2.1 动物处理：动物饲养于(25±1)℃的环境中，每d12h光照。实验组隔天灌胃给药1次，连续10次。对照组给予等量双蒸水。第35d脱臼处死动物，小心取出睾丸，用生理盐水洗去血污。
1.2.2 琥珀酸脱氢酶(SDH)的酶组织化学观察：按Nachlas法[1,2]改良后进行。新鲜标本恒冷切片，厚15μm，置入SDH反应液〔内含NBT5mg，双蒸水5ml、0.2mol/L琥珀酸钠2.5ml；0.2mol/LPBS(pH7.6)2.5ml〕,37℃反应20min后，PBS-双蒸水漂洗，晾干，常规封片，镜下观察。
, 百拇医药
1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)酶组织化学观察：方法见文献[3,4]，新鲜标本切片置入LDH反应液〔内含NAD10mg,NBT5mg，乳酸钠80mg及0.05mol/LPBS10ml(pH7.6～8.0)〕,于37℃反应15min后，用PBS-双蒸水漂洗，晾干，常规封片，镜下观察。
1.2.4 Mg2+-ATP酶(Mg2+-ATPase)的酶组织化学观察：按文献[5]进行，睾丸组织用福尔马林钙液固定过夜，冰冻切片，厚15μm，将切片置入含ATP20mg，0.2mol/LTris缓冲液(pH7.2)10ml，20g/LPb(NO3)21.5ml,0.1mol/LMgSO42.5ml，2mol/LKCl2.0ml的反应液中，37℃反应15min后，PBS漂洗后与10g/L(NH4)2S反应1min，用PBS-双蒸水漂洗，晾干，镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 增产菊胺酯对SDH活性的影响
用NBT法检测细胞内SDH的活性，可见反应产物呈蓝色或深蓝色Formazon颗粒，均匀分布于胞浆。在对照组中，小鼠睾丸曲细精管完整，各级生精细胞SDH活性呈中等阳性，反应产物呈蓝色；精子SDH活性为强阳性，染成蓝黑色(图1)，染毒组，SDH活性不同程度地下降，表现为SDH酶组织反应颜色变浅，在高剂量组，生精上皮SDH活性明显减弱，呈浅蓝色或阴性反应(图2)。
2.2 增产菊胺酯对LDH的影响
对照组睾丸生精上皮细胞LDH反应表现为分布于胞浆的蓝色或蓝黑色颗粒，以精子细胞和精子的活性最高(图3)。在染毒组，尤其是高剂量给药组，其活性显著受抑，表现为弱阳性或阴性(图4)。
2.3 增产菊胺酯对ATPase的影响
, 百拇医药
ATPase主要存在于细胞膜上。在对照组，可以见到小鼠睾丸基膜，生精上皮各级生精细胞胞膜上棕褐色或棕黄色ATP反应沉淀物，ATPase活性呈强阳性(图5)，在高剂量染毒组，基膜ATPase活性减弱，生精细胞ATPase活性显著性受抑，棕色反应产物减少或消失(图6)。
3 讨论
上述结果表明，增产菊胺酯在高剂量时能显著抑制SDH、LDH和ATPase活性。已经知道，琥珀 酸脱氢酶(SDH)主要定位于线粒体膜上(酶组织化学反应表现为胞浆蓝色反应颗粒)，它 催化三羧酸循环中琥珀酸和延胡索酸间的反应，是生精细胞和精子进行有氧呼吸的关键酶， 其活性大小与精子的发生成熟密切相关[6]，乳酸脱氢酶(LDH)主要存在于精母细 胞，精 子细胞胞质及精子尾中段线粒体上，催化丙酮酸转化为乳酸进行无氧代谢，由于睾丸曲细精 管精母细胞粗线期以后的各级生精细胞位于支持细胞紧密连接的上方，难以直接通过基膜从 间质获取营养，而主要依靠糖酵解进行，所以LDH是生精细胞糖代谢生能的主要酶，LDH活性 与生精过程及精子活动、获能及受精有关，可作为预测生精能力的重要指标[7]， 一些外来化合物可以通过影响LDH-X(LDH在睾丸及精浆中的主要同工酶)而引起精子损伤 [8]， 男性不育者，其精浆LDH活性显著降低[9] 。ATPase是精子利用能量的关键酶，也 是质膜 上重要的离子泵，对维持细胞膜结构的完整性和保持细胞正常的生理生化活动具有重要作用 ，与精子动力臂收缩而使精子运动有关[6]。本实验发现，增产菊胺酯明显引起生 精细胞 及精子的SDH、LDH、ATPase活性下降，说明增产菊胺酯不仅干扰了生精细胞的有氧代谢和无 氧供能，还抑制了细胞对能量的利用，而能量代谢障碍是外来化合物引起机体毒作用的重要 机理之一[10]。 精子活动力、存活力与其能量代谢密切相关，SDH、LDH和ATPase 活性是 其重要体现。本研究结果表明，增产菊胺酯对生殖细胞能量代谢的干扰，可能是造成其生殖 细胞毒作用的原因之一。
, 百拇医药
图1 对照组，睾丸SDH阳性，反应颗粒呈蓝色，均匀分布于胞浆，核不着色，精子呈蓝
黑色， 为强阳性 ×200
图2 高剂量染毒组，各级生精细胞SDH反应为弱阳性，颜色明显变浅 ×200
图3 对照组，睾丸LDH反应阳性，蓝色反应产物均匀分布于胞浆 ×200
图4 高剂量染毒组，睾丸细胞LDH活性明显受抑，为弱阳性 ×200
, 百拇医药
图5 对照组，生精上皮基膜及各级生精细胞质膜上可见棕褐色或棕黄色ATPase反应产物分 布，为强阳性(→所示) ×400
图6 高剂量染毒组，生精上皮基膜ATPase活性减弱(→所示)。各级生精细胞ATPase产物 减少
或消失，为弱阳性或阴性(→所示) ×400
国家“八五”科技攻关项目(No.85-504-03-12)
毛新良， 男，1971年生，博士研究生
参 考 文 献
1，武内忠男，小川和朗主编. 新酶组织化学. 北京：人民卫生出版社， 1983. 62～67
, 百拇医药
2，熊希凯，郑达人，港子聪等. 硝硫氢胺对小白鼠肝脏的组织化学观察.武汉医 学院学报, 1981,10(1)：72
3，Chayen J, Bitenshy L, Butoher R. Practical histochemistry. London: John Wiley & Sons Press, 1973. 197～199
4，张 艳，熊希凯. 戊巴比妥钠对小鼠肝脏影响的组织化学研究. 中国组织化 学与细胞化学杂志，1995，4(4)：361
5，Wachstein M, Miesel E. Histochemistry of hepatic phosphatase at a p hysiologic pH with special reference to the demonstration of bile canaliculi. Am J Clin Pathol, 1957,27:13
, 百拇医药
6，赵永荃. 生精细胞之细胞化学研究进展. 国外医学计划生育分册，1988，7( 4)：193
7，李 震，王 浩，王振林. 外源性雌、雄激素对大鼠睾丸组织中LDH-X的影 响. 生殖与避孕，1988，8(1)：53
8，田 健，余振钰，周孝瑚. 雷公藤多甙对大鼠生精细胞及其酶活性的影响. 生殖与避孕，1993，13(2)：127
9，梁 鹰，王敏玲，陈淑华. 正常男性与不育男性精浆酶活性比较. 生殖与避 孕，1993，13(4):264
10，王移兰，刚保琪主编. 现代劳动卫生学. 北京：人民卫生出版社，1994.17 8～183
(1998-12-30 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学公共卫生学院环境毒理学教研室, 武汉 430030
关键词：增产菊胺酯；能量代谢；生殖细胞
同济医科大学学报000309 摘要 采用酶组织化学方法研究了小鼠染毒后生殖细 胞SDH、LDH和ATPase活性的变化,结果发现，25.0～125.0 mg/kg体重剂量组染毒35 d后S DH、LDH和ATPase活性均受到抑制，说明增产菊胺酯不仅干扰睾丸细胞的有氧代谢及无氧代 谢的供能过程，还干扰细胞对能量的利用。提示能量代谢障碍可能是增产菊胺酯对雄性生殖 细胞毒 作用的机理之一。
中图法分类号 R595.4， R333.6， R321.1
Effects of Bachmedesh on Energy Met abolism in Male Germ Cells
, http://www.100md.com
Mao Xinliang Xu Yiping Song Ruikun et al
(Department of Environmental Toxicology, School of Publ ic Health,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract In order to investigate the possible toxic pathway of Bachmedesh to male reproductive system, the activities of SDH, LDH and ATPase in male germ cells were studied by using enzymohistochemical methods. It was obser ved that the activities of SDH, LDH and ATPase were dramatically suppressed in m iddle and high dosage experimental group animals, suggesting that Bachmedesh not only interfered with the energy-supply process of aerobic and anaerobic glycol ysis, but also the energy-utilization in germ cells.
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Key words Bachmedesh; energy metabolism; male germ cells
增产菊胺酯(Bachmedesh)是我国科技工作者首次合成的植物生长调节剂，能较好地提高农 作物的产量和质量，我们在对其进行安全评价过程中发现该化合物具有较强的雄性生殖毒性 作用，主要表现为生殖细胞受到损伤和精子数量减少、质量降低，电镜发现高剂量增产菊胺 酯还能引起生殖细胞线粒体等细胞器损伤。为探讨其毒作用机理，本实验采用酶组织化学方 法从能量代谢的角度进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1受试药物：增产菊胺酯，白色粉末，纯度>99.0%，由武汉大学化学系提供。按急性毒性试验结果分别配制成低剂量组(5.0mg/kg)、中剂量组(25.0mg/kg)和高剂量组(125.0mg/kg)(分别相当于1/125，1/25，1/5LD50)。
, http://www.100md.com
1.1.2 实验动物：昆明种小鼠，雄性，6～7周龄，由同济医科大学实验动物学部提供。 动物经检疫1周后，将健康合格者随机分成4组，即低、中、高剂量组和阴性对照组，每组5 只。
1.1.3 主要试剂：硝基四氮唑蓝(NBT)，尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD)，德国B oehringer Mannhein公司产；琥珀酸钠，ATP，国产分析纯试剂。
1.1.4 主要仪器：AO恒冷箱，美国产；Olympus显微照像系统，日本产。
1.2 方法
1.2.1 动物处理：动物饲养于(25±1)℃的环境中，每d12h光照。实验组隔天灌胃给药1次，连续10次。对照组给予等量双蒸水。第35d脱臼处死动物，小心取出睾丸，用生理盐水洗去血污。
1.2.2 琥珀酸脱氢酶(SDH)的酶组织化学观察：按Nachlas法[1,2]改良后进行。新鲜标本恒冷切片，厚15μm，置入SDH反应液〔内含NBT5mg，双蒸水5ml、0.2mol/L琥珀酸钠2.5ml；0.2mol/LPBS(pH7.6)2.5ml〕,37℃反应20min后，PBS-双蒸水漂洗，晾干，常规封片，镜下观察。
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1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)酶组织化学观察：方法见文献[3,4]，新鲜标本切片置入LDH反应液〔内含NAD10mg,NBT5mg，乳酸钠80mg及0.05mol/LPBS10ml(pH7.6～8.0)〕,于37℃反应15min后，用PBS-双蒸水漂洗，晾干，常规封片，镜下观察。
1.2.4 Mg2+-ATP酶(Mg2+-ATPase)的酶组织化学观察：按文献[5]进行，睾丸组织用福尔马林钙液固定过夜，冰冻切片，厚15μm，将切片置入含ATP20mg，0.2mol/LTris缓冲液(pH7.2)10ml，20g/LPb(NO3)21.5ml,0.1mol/LMgSO42.5ml，2mol/LKCl2.0ml的反应液中，37℃反应15min后，PBS漂洗后与10g/L(NH4)2S反应1min，用PBS-双蒸水漂洗，晾干，镜下观察。
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2 结果
2.1 增产菊胺酯对SDH活性的影响
用NBT法检测细胞内SDH的活性，可见反应产物呈蓝色或深蓝色Formazon颗粒，均匀分布于胞浆。在对照组中，小鼠睾丸曲细精管完整，各级生精细胞SDH活性呈中等阳性，反应产物呈蓝色；精子SDH活性为强阳性，染成蓝黑色(图1)，染毒组，SDH活性不同程度地下降，表现为SDH酶组织反应颜色变浅，在高剂量组，生精上皮SDH活性明显减弱，呈浅蓝色或阴性反应(图2)。
2.2 增产菊胺酯对LDH的影响
对照组睾丸生精上皮细胞LDH反应表现为分布于胞浆的蓝色或蓝黑色颗粒，以精子细胞和精子的活性最高(图3)。在染毒组，尤其是高剂量给药组，其活性显著受抑，表现为弱阳性或阴性(图4)。
2.3 增产菊胺酯对ATPase的影响
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ATPase主要存在于细胞膜上。在对照组，可以见到小鼠睾丸基膜，生精上皮各级生精细胞胞膜上棕褐色或棕黄色ATP反应沉淀物，ATPase活性呈强阳性(图5)，在高剂量染毒组，基膜ATPase活性减弱，生精细胞ATPase活性显著性受抑，棕色反应产物减少或消失(图6)。
3 讨论
上述结果表明，增产菊胺酯在高剂量时能显著抑制SDH、LDH和ATPase活性。已经知道，琥珀 酸脱氢酶(SDH)主要定位于线粒体膜上(酶组织化学反应表现为胞浆蓝色反应颗粒)，它 催化三羧酸循环中琥珀酸和延胡索酸间的反应，是生精细胞和精子进行有氧呼吸的关键酶， 其活性大小与精子的发生成熟密切相关[6]，乳酸脱氢酶(LDH)主要存在于精母细 胞，精 子细胞胞质及精子尾中段线粒体上，催化丙酮酸转化为乳酸进行无氧代谢，由于睾丸曲细精 管精母细胞粗线期以后的各级生精细胞位于支持细胞紧密连接的上方，难以直接通过基膜从 间质获取营养，而主要依靠糖酵解进行，所以LDH是生精细胞糖代谢生能的主要酶，LDH活性 与生精过程及精子活动、获能及受精有关，可作为预测生精能力的重要指标[7]， 一些外来化合物可以通过影响LDH-X(LDH在睾丸及精浆中的主要同工酶)而引起精子损伤 [8]， 男性不育者，其精浆LDH活性显著降低[9] 。ATPase是精子利用能量的关键酶，也 是质膜 上重要的离子泵，对维持细胞膜结构的完整性和保持细胞正常的生理生化活动具有重要作用 ，与精子动力臂收缩而使精子运动有关[6]。本实验发现，增产菊胺酯明显引起生 精细胞 及精子的SDH、LDH、ATPase活性下降，说明增产菊胺酯不仅干扰了生精细胞的有氧代谢和无 氧供能，还抑制了细胞对能量的利用，而能量代谢障碍是外来化合物引起机体毒作用的重要 机理之一[10]。 精子活动力、存活力与其能量代谢密切相关，SDH、LDH和ATPase 活性是 其重要体现。本研究结果表明，增产菊胺酯对生殖细胞能量代谢的干扰，可能是造成其生殖 细胞毒作用的原因之一。
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图1 对照组，睾丸SDH阳性，反应颗粒呈蓝色，均匀分布于胞浆，核不着色，精子呈蓝
黑色， 为强阳性 ×200
图2 高剂量染毒组，各级生精细胞SDH反应为弱阳性，颜色明显变浅 ×200
图3 对照组，睾丸LDH反应阳性，蓝色反应产物均匀分布于胞浆 ×200
图4 高剂量染毒组，睾丸细胞LDH活性明显受抑，为弱阳性 ×200
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图5 对照组，生精上皮基膜及各级生精细胞质膜上可见棕褐色或棕黄色ATPase反应产物分 布，为强阳性(→所示) ×400
图6 高剂量染毒组，生精上皮基膜ATPase活性减弱(→所示)。各级生精细胞ATPase产物 减少
或消失，为弱阳性或阴性(→所示) ×400
国家“八五”科技攻关项目(No.85-504-03-12)
毛新良， 男，1971年生，博士研究生
参 考 文 献
1，武内忠男，小川和朗主编. 新酶组织化学. 北京：人民卫生出版社， 1983. 62～67
, 百拇医药
2，熊希凯，郑达人，港子聪等. 硝硫氢胺对小白鼠肝脏的组织化学观察.武汉医 学院学报, 1981,10(1)：72
3，Chayen J, Bitenshy L, Butoher R. Practical histochemistry. London: John Wiley & Sons Press, 1973. 197～199
4，张 艳，熊希凯. 戊巴比妥钠对小鼠肝脏影响的组织化学研究. 中国组织化 学与细胞化学杂志，1995，4(4)：361
5，Wachstein M, Miesel E. Histochemistry of hepatic phosphatase at a p hysiologic pH with special reference to the demonstration of bile canaliculi. Am J Clin Pathol, 1957,27:13
, 百拇医药
6，赵永荃. 生精细胞之细胞化学研究进展. 国外医学计划生育分册，1988，7( 4)：193
7，李 震，王 浩，王振林. 外源性雌、雄激素对大鼠睾丸组织中LDH-X的影 响. 生殖与避孕，1988，8(1)：53
8，田 健，余振钰，周孝瑚. 雷公藤多甙对大鼠生精细胞及其酶活性的影响. 生殖与避孕，1993，13(2)：127
9，梁 鹰，王敏玲，陈淑华. 正常男性与不育男性精浆酶活性比较. 生殖与避 孕，1993，13(4):264
10，王移兰，刚保琪主编. 现代劳动卫生学. 北京：人民卫生出版社，1994.17 8～183
(1998-12-30 收稿), 百拇医药