采用 PCR-SSP法检测HLA-B27基因
作者：王庆华 谭建明
单位：王庆华(南京军区福州总医院泌尿外科，福州350025)；谭建明(南京军区福州总医院泌尿外科，福州350025)
关键词：聚合酶链反应；HLA-B27基因；DNA分型
中国免疫学杂志000313 摘 要：目的：建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法检测HLA-B27基因并与血清学方法比较。方法：设计合成B27特异引物3个和内源性阳性对照2个，建立PCR-SSP方法，用于B27基因分型。血清学分型为一步法单克隆抗体方法。临床样本100份，来源于可疑强直性脊柱炎患者。快速酚氯仿法提取模板DNA。结果：100例临床样本PCR-SSP行B27基因分型均获成功。总耗时4 h。其中B27阴性58例，阳性42例，5例临床诊断为强直性脊柱炎，占11.9%。30份样本同时行血清学分型，20份B27阴性，5份阳性，5份可疑阳性。其中20份阴性中3例为阳性，5份可疑阳性中2例为阴性。结论：PCR-SSP行B27基因分型，分辨度高、特异性强，快捷、准确，适合于临床应用。
, 百拇医药
中国图书分类号：R446
Genotyping for HLA-B27 by polymerase chain reaction with sequence specific primers
WANG Qing-Hua TAN Jian-Ming
(Department of Urology,Fuzhou General Hospital,Fuzhou 350025)
Abstract Objective： Genotyping for HLA-B27 by polymerase(PCR-SSP)was established and compared with serology.Methods:Genotyping for B27 of PCR-SSP method was set up by designing and synthesizing 3 specific priers and 2 control priers according to the HLA-B27 nucleotide sequences.Serology was a one-step monoclonal antibody typing procedure.A total of 100 samples from ambiguous ankylosing spondylitis were entered into the study.Genomic DNA was obtained from rapid phenolchloro form extraction. Results：Genotyping for B27 was successfully typed in 100 samples by PCR-SSP,containing 58 with B27-negative,42 with B27-positive.5 patients with B27-positive(11.9%) were diagnosed ankylosing spondylitis.30 samples was typed by serology,including 20 with B27-negative 5 positive and 5 ambiguous positive.3 out of 20 negative were positive and 2 out of 5 ambiguous positive were negative by PCR-SSP typing for HLA-B27.Conclusion:Genotyping for HLA-B27 by PCR-SSP has proved to be a high-sensitivity,high-specificity,rapid and accurate technique,suitable for clinical application.
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Key words：Polymerase chain reaction HLA-B27 genotype DNA typing
人白细胞抗原(HLA)特异性与许多临床疾病关联，HLA-B27基因与脊柱炎性关节病具有强关联。因此HLA-B27检测被列为临床最有价值的诊断工具之一。我们通过建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)DNA分型方法，取代血清学分型方法，检测HLA-27基因，具有准确、实用、快速、经济的特点，为临床早期诊断治疗提供了有力依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 引物 根据1995年国际组织相容性专题组织公布的HLA-Ⅰ类抗原核苷酸序列[1]，设计HLA-B27特异引物为3个，内源性阳性对照引物2个[2]。引物序列为：5′端引物1个，GCT ACG TGG ACG ACA CGCT，3′端引物2个，CTC GGT CAG TCT GTG CCTT，TCT CGG TAA GTC TGT GCC TT。内源性阳性对照引物2个，5′端引物TGC CAA GTG GAG CAC CAA，3′端引物GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT。引物由中国科学院上海Sangon公司合成，Page纯化。引物解链温度58～62℃，引物浓度2.0 μmol/L，扩增产物片段长度为149碱基对(bp)。
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1.1.2 临床样本 100份均来源于临床怀疑有脊柱炎性关节病的患者。
1.1.3 PCR扩增仪 美国PE-9600扩增仪。
1.1.4 电泳仪 上海西巴斯生物技术公司研制的DY-A电泳仪。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取 肝素抗凝外周血1 ml，分离淋巴细胞，采用快速酚氯仿抽提法[3]，所获得DNA纯度(260/280)A值为1.6～2.0，模板DNA浓度为100～200 μg/μl。
1.2.2 PCR扩增方法 反应混合物每个PCR反应体系总量25 μl，反应混合物包括0.75×PCR缓冲液(37.5 mmol/L KCl,7.5 mmol/L Tris)、1.5 mmol/L MgCl2、0.5U Taq酶、200 μmol/L dNTP、3%DMSO、2 μmol/L特异性引物、0.1 μmol/L阳性对照引物、50～100 ng模板DNA。
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1.2.3 扩增条件 94℃变性2 min,然后循环：95℃30 s、65℃50 s、72℃40 s 10个循环；95℃30 s、62℃50 s、72℃40 s 20个循环，最后72℃延伸5 min。
1.2.4 电泳 1×TAE缓冲液配制含0.5 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖胶，扩增产物10 μl点样，按15V/cm稳压电泳25 min，观察结果。
1.2.5 血清学分型 采用Lee报道的一步法快速单克隆抗体方法[4]。
2 结果
100份临床可疑脊柱炎性关节病的样本中，HLA-B27阴性58例，阳性42例，其中临床上诊断为强直性脊柱炎者5例，占11.9%。30例样本同时行血清学分型，出现B27阳性5份，可疑阳性5份，阳性20份。PCR-SSP单盲比较，27份阴性有3例为阳性，5份可疑阳性中2份为阴性，其他与PCR-SSP分型结果相同。PCR-SSP法HLA-B27分型法可见图1。重复性实验：B27阳性样本和阴性样本DNA各5份，采用PCR-SSP方法重复实验5次，均获得相同结果。
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图1 HLA-B27基因PCR-SSP测定结果
Fig.1 Result of PCR-SSP typing for HLA-B27 gene
Note:M.marker；N.neg.control；Lanes 1-7.positive results of B27 by PCR-SSP;Lane 8:negative B27 sample
3 讨论
HLA-B27抗原为HLA-Ⅰ类抗原，存在于所有有核细胞和血小板表面。脊柱炎性关节病如：强直性脊柱炎、反应性关节炎、幼年风湿性关节炎等与HLA-B27基因具有强相关性。中国人的HLA-B27频率为3.4%[5]，具有HLA-B27抗原者患强直性脊柱炎的机率为7.3%[5]，本组为11.9%。而非HLA-B27抗原者患强直性脊柱炎的机率为1.3[5]，显而易见HLA-B27检测具有显著的临床意义。目前经典的检测HLA-B27抗原方法，是血清学分型或基于血清学分型原理和分辨水平的单克隆抗体分型技术。尽管它操作简便准确性尚可，但仍受到细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度的多态性的影响，而出现错判和误判。与更精确的DNA分型技术比较，存在着一定的误差。本组5例单抗板检测结果可疑，经PCR-SSP法得以证实，且市售的单克隆抗体板为6人一块，不利于临床单个样本的检测。近年来随着分子生物学技术的发展，对HLA分型研究进入到基因水平并逐步取代血清学方法[6]。我们针对HLA-B27基因序列设计引物，建立了PCR-SSP法对HLA-B27基因进行分型。仅对特定序列片段扩增，具有高度的分辨度和特异性。根据是否存在特定产物的阳性条带，即能快速而准确地判断结果。实验操作方法简便、易行，耗时4 h。对单个样本也能随时检测，病人不需预约等待，更适合于临床应用。研究结果证实，PCR-SSP技术检测HLA-B27基因具有准确、实用、快速、经济等优点，适合于临床应用。
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作者简介：王庆华，36岁，主管技师，主要从事HLA组织配型及与HLA疾病相关研究
参考文献：
[1]Arnett K L,Parham P. HLA class Ⅰ nucleotide sequences,1995.Tissue Antigens， 1995；45(3pⅡ)：217
[2]谭建明，唐孝达，谢 桐et al. 人类白细胞抗原-Ⅰ类抗原的DNA分型与临床应用.中华医学杂志， 1998；78(10)：763
[3]谭建明，谢 桐，徐琴君et al.快速盐析法提取 DNA在HLA基因分型中的应用.中华器官移植杂志， 1996；17(1)：9
[4]Lee J H,Lias M,Deng C T et al.A one-step monoclonal antibody typing procedure that simplifies HLA class I and class Ⅱ typing.Tissue Antigens， 1994；44:34
[5]Richard D,Wigle Y. Rheumatic diseases in China.J Rheumatol， 1994;21(8):1484
[6]Dupont B.Human Immunogenetics and Histocompatibility testing,1996.Tissue Antigens， 1996；47:457
收稿日期：1999-02-23
修改日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：王庆华(南京军区福州总医院泌尿外科，福州350025)；谭建明(南京军区福州总医院泌尿外科，福州350025)
关键词：聚合酶链反应；HLA-B27基因；DNA分型
中国免疫学杂志000313 摘 要：目的：建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法检测HLA-B27基因并与血清学方法比较。方法：设计合成B27特异引物3个和内源性阳性对照2个，建立PCR-SSP方法，用于B27基因分型。血清学分型为一步法单克隆抗体方法。临床样本100份，来源于可疑强直性脊柱炎患者。快速酚氯仿法提取模板DNA。结果：100例临床样本PCR-SSP行B27基因分型均获成功。总耗时4 h。其中B27阴性58例，阳性42例，5例临床诊断为强直性脊柱炎，占11.9%。30份样本同时行血清学分型，20份B27阴性，5份阳性，5份可疑阳性。其中20份阴性中3例为阳性，5份可疑阳性中2例为阴性。结论：PCR-SSP行B27基因分型，分辨度高、特异性强，快捷、准确，适合于临床应用。
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Genotyping for HLA-B27 by polymerase chain reaction with sequence specific primers
WANG Qing-Hua TAN Jian-Ming
(Department of Urology,Fuzhou General Hospital,Fuzhou 350025)
Abstract Objective： Genotyping for HLA-B27 by polymerase(PCR-SSP)was established and compared with serology.Methods:Genotyping for B27 of PCR-SSP method was set up by designing and synthesizing 3 specific priers and 2 control priers according to the HLA-B27 nucleotide sequences.Serology was a one-step monoclonal antibody typing procedure.A total of 100 samples from ambiguous ankylosing spondylitis were entered into the study.Genomic DNA was obtained from rapid phenolchloro form extraction. Results：Genotyping for B27 was successfully typed in 100 samples by PCR-SSP,containing 58 with B27-negative,42 with B27-positive.5 patients with B27-positive(11.9%) were diagnosed ankylosing spondylitis.30 samples was typed by serology,including 20 with B27-negative 5 positive and 5 ambiguous positive.3 out of 20 negative were positive and 2 out of 5 ambiguous positive were negative by PCR-SSP typing for HLA-B27.Conclusion:Genotyping for HLA-B27 by PCR-SSP has proved to be a high-sensitivity,high-specificity,rapid and accurate technique,suitable for clinical application.
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Key words：Polymerase chain reaction HLA-B27 genotype DNA typing
人白细胞抗原(HLA)特异性与许多临床疾病关联，HLA-B27基因与脊柱炎性关节病具有强关联。因此HLA-B27检测被列为临床最有价值的诊断工具之一。我们通过建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)DNA分型方法，取代血清学分型方法，检测HLA-27基因，具有准确、实用、快速、经济的特点，为临床早期诊断治疗提供了有力依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 引物 根据1995年国际组织相容性专题组织公布的HLA-Ⅰ类抗原核苷酸序列[1]，设计HLA-B27特异引物为3个，内源性阳性对照引物2个[2]。引物序列为：5′端引物1个，GCT ACG TGG ACG ACA CGCT，3′端引物2个，CTC GGT CAG TCT GTG CCTT，TCT CGG TAA GTC TGT GCC TT。内源性阳性对照引物2个，5′端引物TGC CAA GTG GAG CAC CAA，3′端引物GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT。引物由中国科学院上海Sangon公司合成，Page纯化。引物解链温度58～62℃，引物浓度2.0 μmol/L，扩增产物片段长度为149碱基对(bp)。
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1.1.2 临床样本 100份均来源于临床怀疑有脊柱炎性关节病的患者。
1.1.3 PCR扩增仪 美国PE-9600扩增仪。
1.1.4 电泳仪 上海西巴斯生物技术公司研制的DY-A电泳仪。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取 肝素抗凝外周血1 ml，分离淋巴细胞，采用快速酚氯仿抽提法[3]，所获得DNA纯度(260/280)A值为1.6～2.0，模板DNA浓度为100～200 μg/μl。
1.2.2 PCR扩增方法 反应混合物每个PCR反应体系总量25 μl，反应混合物包括0.75×PCR缓冲液(37.5 mmol/L KCl,7.5 mmol/L Tris)、1.5 mmol/L MgCl2、0.5U Taq酶、200 μmol/L dNTP、3%DMSO、2 μmol/L特异性引物、0.1 μmol/L阳性对照引物、50～100 ng模板DNA。
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1.2.3 扩增条件 94℃变性2 min,然后循环：95℃30 s、65℃50 s、72℃40 s 10个循环；95℃30 s、62℃50 s、72℃40 s 20个循环，最后72℃延伸5 min。
1.2.4 电泳 1×TAE缓冲液配制含0.5 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖胶，扩增产物10 μl点样，按15V/cm稳压电泳25 min，观察结果。
1.2.5 血清学分型 采用Lee报道的一步法快速单克隆抗体方法[4]。
2 结果
100份临床可疑脊柱炎性关节病的样本中，HLA-B27阴性58例，阳性42例，其中临床上诊断为强直性脊柱炎者5例，占11.9%。30例样本同时行血清学分型，出现B27阳性5份，可疑阳性5份，阳性20份。PCR-SSP单盲比较，27份阴性有3例为阳性，5份可疑阳性中2份为阴性，其他与PCR-SSP分型结果相同。PCR-SSP法HLA-B27分型法可见图1。重复性实验：B27阳性样本和阴性样本DNA各5份，采用PCR-SSP方法重复实验5次，均获得相同结果。
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图1 HLA-B27基因PCR-SSP测定结果
Fig.1 Result of PCR-SSP typing for HLA-B27 gene
Note:M.marker；N.neg.control；Lanes 1-7.positive results of B27 by PCR-SSP;Lane 8:negative B27 sample
3 讨论
HLA-B27抗原为HLA-Ⅰ类抗原，存在于所有有核细胞和血小板表面。脊柱炎性关节病如：强直性脊柱炎、反应性关节炎、幼年风湿性关节炎等与HLA-B27基因具有强相关性。中国人的HLA-B27频率为3.4%[5]，具有HLA-B27抗原者患强直性脊柱炎的机率为7.3%[5]，本组为11.9%。而非HLA-B27抗原者患强直性脊柱炎的机率为1.3[5]，显而易见HLA-B27检测具有显著的临床意义。目前经典的检测HLA-B27抗原方法，是血清学分型或基于血清学分型原理和分辨水平的单克隆抗体分型技术。尽管它操作简便准确性尚可，但仍受到细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度的多态性的影响，而出现错判和误判。与更精确的DNA分型技术比较，存在着一定的误差。本组5例单抗板检测结果可疑，经PCR-SSP法得以证实，且市售的单克隆抗体板为6人一块，不利于临床单个样本的检测。近年来随着分子生物学技术的发展，对HLA分型研究进入到基因水平并逐步取代血清学方法[6]。我们针对HLA-B27基因序列设计引物，建立了PCR-SSP法对HLA-B27基因进行分型。仅对特定序列片段扩增，具有高度的分辨度和特异性。根据是否存在特定产物的阳性条带，即能快速而准确地判断结果。实验操作方法简便、易行，耗时4 h。对单个样本也能随时检测，病人不需预约等待，更适合于临床应用。研究结果证实，PCR-SSP技术检测HLA-B27基因具有准确、实用、快速、经济等优点，适合于临床应用。
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作者简介：王庆华，36岁，主管技师，主要从事HLA组织配型及与HLA疾病相关研究
参考文献：
[1]Arnett K L,Parham P. HLA class Ⅰ nucleotide sequences,1995.Tissue Antigens， 1995；45(3pⅡ)：217
[2]谭建明，唐孝达，谢 桐et al. 人类白细胞抗原-Ⅰ类抗原的DNA分型与临床应用.中华医学杂志， 1998；78(10)：763
[3]谭建明，谢 桐，徐琴君et al.快速盐析法提取 DNA在HLA基因分型中的应用.中华器官移植杂志， 1996；17(1)：9
[4]Lee J H,Lias M,Deng C T et al.A one-step monoclonal antibody typing procedure that simplifies HLA class I and class Ⅱ typing.Tissue Antigens， 1994；44:34
[5]Richard D,Wigle Y. Rheumatic diseases in China.J Rheumatol， 1994;21(8):1484
[6]Dupont B.Human Immunogenetics and Histocompatibility testing,1996.Tissue Antigens， 1996；47:457
收稿日期：1999-02-23
修改日期：1999-10-25, 百拇医药