高效毛细管电泳测定血清中盐酸反式曲马多对映体
作者：刘会臣 刘铁军 冯超英 侯艳宁
单位：刘会臣 刘铁军 冯超英 侯艳宁(白求恩国际和平医院临床药理室 石家庄 050082)
关键词：盐酸反式曲马多；高效毛细管电泳；对映体拆分；人血清
药物分析杂志000303 摘要 目的：建立测定人血清中盐酸反式曲马多对映体的高效毛细管电泳方法。方法：血清中盐酸曲马多以乙酸乙酯提取、浓缩。含0.8 mmol.L-1磺丁基-β-环糊精的40 mmol.L-1 Tris缓冲液(磷酸调pH至2.5)为分离介质；进样电压10 kV，20 s，入口为阳极；分离电压15 kV，柱温25 ℃，检测波长214 nm。结果：盐酸曲马多的4种立体异构体达到基线分离，且血清组分无干扰峰；以盐酸顺式曲马多的一对映体为内标，(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的血清浓度在2.5～320 ng.mL-1范围内，峰面积与内标峰面积的比值和浓度呈良好的线性关系；回收率在90%和108%之间；日内、日间RSD分别小于18%和21%；最低检测浓度为1.25 ng.mL-1。结论：本方法适用于临床药代动力学研究。
, 百拇医药
Determination of the Enantiomers of Trans Tramadol Hydrochloride in Human Serum by High Performance Capillary Electrophoresis
Liu Huichen，Liu Tiejun，Feng Chaoying，Hou Yanning
(Department of Clinical Pharmacology,Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis(HPCE)method for determining the two enantiomers of trans tramadol hydrochloride in human serum.Methods:The tramadol hydrochloride in human serum was extracted by ethyl acetate and concentrated.The electrophoretic medium was 40 mmol.L-1 Tris buffer(pH adjusted to 2.5 by H3PO4)containing sulfobutylether-β-cyclodextrin.An uncoated capillary used was 37 cm(30 cm to the detector)×75 μm.Detection was carried out with a UV detector at 214 nm.The separations were performed at 25 ℃ with a positive voltage of 15 kV.Samples were injected into the capillary by voltage (10 kV) for 20 s.Results:With one enantiomer of cis tramadol hydrochloride as internal standard,the two enantiomers of trans tramadol hydrochloride were separated well and without interference from human serum.The linear concentration region was 2.5～320 ng.mL-1 for each enantiomer.The relative recoveries were from 90% to 108%.The within-day and between-day RSDs were lower than 18% and 21% respectively.The lowest detective concentration was 1.25 ng.mL-1 for each enantiomer. Conclusion:This method is very suitable for clinical pharmacokinetic study.
, 百拇医药
Key words trans tramadol hydrochloride,high performance capillary electrophoresis(HPCE),enantiomer separation,human sreum
盐酸曲马多(tramadol hydrochloride)的化学结构(见图1)中含2个手性碳原子，有4种立体异构体-(1R，2R)、(1S，2S)、(1R，2S)和(1S，2R)-盐酸曲马多，(+)-(1R，2R)、(-)-(1S，2S)属反式为药用品，文献报道通过激动阿片受体和影响单胺递质释放与再吸收而发挥协同镇痛作用[1～3]。为研究盐酸反式曲马多的体内药代动力学立体选择性，本文建立了测定盐酸反式曲马多对映体的高效毛细管电泳(HPCE)方法。
图1 盐酸曲马多的化学结构式(*示手性中心)
1 仪器、药品与试剂
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P/ACE 5000型HPCE，配紫外检测器及Gold色谱软件；未涂层石英毛细管37 cm×75 μm，有效长度30 cm，美国Beckman公司。盐酸反式曲马多(含量99.7%)、(+)-盐酸反式曲马多(含量99.8%)、(-)-盐酸反式曲马多(含量99.6%)，德国Grünenthal Gmbh公司惠赠；内标物盐酸顺式曲马多，锦州医学院化学教研室合成。磺丁基-β-环糊精，中国科学院兰州化物所合成；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸、氢氧化钠、盐酸均为市售分析纯；超纯水。
2 分析条件
精密称取磺丁基-β-环糊精，以40 mmol.L-1 Tris缓冲液(磷酸调pH至2.5)溶解，配制分离介质，磺丁基-β-环糊精的浓度为0.8 mmol.L-1。进样电压10 kV,20 s，入口为阳极；分离电压15 kV,柱温25 ℃，检测波长214 nm。
, 百拇医药
3 样品处理
1 mL血清中加1 μg.mL-1盐酸顺式曲马多溶液0.1 mL，0.5 mol.L-1氢氧化钠溶液0.5 mL，乙酸乙酯5 mL，充分混匀2 min，离心(4 500 r.min-1)15 min，取上清液4 mL氮气流吹干，残渣用0.1 mL水溶解，30 μL上机分析。
4 分离效果
上述条件下电泳图谱见图2，盐酸曲马多的4种立体异构体达到基线分离，且血清组分无干扰峰。(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多tR分别为9.47和10.30 min；盐酸顺式曲马多两对映体tR分别为8.28和8.74 min。
5 线性范围
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以盐酸顺式曲马多后出峰的对映体为内标，(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的血清浓度在2.5～320 ng.mL-1范围内，其峰面积与内标峰面积的比值和浓度呈良好的线性关系，回归方程(n=9)分别为：
Y=0.035 75+0.020 66C r=0.999 6
Y=0.063 00+0.020 35C r=0.999 4
6 回收率与精密度
图2 HPCE图谱
A.空白血清 B.空白血清加盐酸顺式曲马多
和盐酸反式曲马多 C.血样加盐酸顺式曲马多
1.盐酸顺式曲马多的一对映体 2.盐酸顺式曲
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马多的另一对映体 3.(+)-盐酸反式曲马多
4.(-)-盐酸反式曲马多 5，6，7.未知代谢物
在1天内不同时间或不同日期分别处理并测定浓度为5，20，80，240 ng.mL-1的样品液，共5次。回收率与精密度结果见表1、表2。(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的回收率在90%和108%之间；日内、日间RSD分别小于18%和21%。
表1 (+)-盐酸反式曲马多日内、日间RSD及回收率(n=5) 浓度/ng.mL-1
日内
日间
回收率/%
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RSD/%
回收率/%
RSD/%
5
106.20
17.51
103.60
20.46
20
106.00
6.04
103.00
8.79
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80
98.45
6.68
97.66
7.76
240
100.37
3.61
99.98
3.56
表2 (-)-盐酸反式曲马多日内、日间RSD及回收率(n=5) 浓度/ng.mL-1
, http://www.100md.com 日内
日间
回收率/%
RSD/%
回收率/%
RSD/%
5
94.20
10.40
90.40
16.59
20
104.75
, 百拇医药
8.54
107.80
13.08
80
97.42
2.45
92.30
13.64
240
99.50
4.57
102.52
8.53
, 百拇医药
7 灵敏度
S/N>3，本方法的最低检测浓度为1.25 ng.mL-1。
8 讨论
8.1 本文曾试用20，30，40 mmol.L-1的Tris缓冲液；pH 2.0，2.5，3.0的Tris缓冲液；β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精；1.0，0.9，0.8 mmol.L-1的磺丁基-β-环糊精；10，15，20 kV的分离电压，从分离度、分析时间、峰形、运行电流等方面考察分析条件，最终确定了本文方法。该方法已用于盐酸反式曲马多的人体立体药代动力学研究，有关工作尚在进行中。
8.2 1998年以来，Chan等曾用HPCE方法拆分盐酸反式曲马多及其代谢物对映体[4]，Rudaz等曾用HPCE方法分离测定人尿液中盐酸反式曲马多及其代谢物对映体的浓度[5]。与文献方法相比，本文方法明显提高了分离度，缩短了分析时间。此外，以低浓度磺丁基-β-环糊精为手性拆分剂，大大降低了试验成本；以电压进样对样品进行柱上富集，加之样品用水溶解，可使最低检测浓度达1.25 ng.mL-1(以水-甲醇溶解样品可降低灵敏度)。
, 百拇医药
刘铁军：河北医科大学药学院99级实习生
参考文献
1，Gibson TP.Pharmacokinetics,efficacy,and safety of analgesia with a focus on tramadol HCl.Am J Med,1996，101(Suppl 1A):47s
2，Guo WY,Zhan Q,Zhao Y,et al.Determination of cis and trans isomers of tramadol hydrochloride by capillary zone electrophoresis.Biomed Chromatogr,1998,12:13
3，Raffa RB,Friderichs E,Reimann W,et al.Complementary and synergistic antinociceptive interaction between enantiomers of tramadol.J Pharmacol Exp Ther,1993,267:331
, 百拇医药
4，Chan ECY,Ho PC.Enantiomeric separation of tramadol hydrochloride and its metabolites by cyclodextrin-mediated capillary electrophoresis.J Chromatogr B,1998,707:287
5，Rudaz S,Veuthey JL,Desiderio C,et al.Simultaneous stereoselective analysis by capillary electrophoresis of tramadol enantiomers and their main phase I metabolites in urine.J Chromatogr A，1999,846:227
(本文于1999年5月10日收到), 百拇医药
单位：刘会臣 刘铁军 冯超英 侯艳宁(白求恩国际和平医院临床药理室 石家庄 050082)
关键词：盐酸反式曲马多；高效毛细管电泳；对映体拆分；人血清
药物分析杂志000303 摘要 目的：建立测定人血清中盐酸反式曲马多对映体的高效毛细管电泳方法。方法：血清中盐酸曲马多以乙酸乙酯提取、浓缩。含0.8 mmol.L-1磺丁基-β-环糊精的40 mmol.L-1 Tris缓冲液(磷酸调pH至2.5)为分离介质；进样电压10 kV，20 s，入口为阳极；分离电压15 kV，柱温25 ℃，检测波长214 nm。结果：盐酸曲马多的4种立体异构体达到基线分离，且血清组分无干扰峰；以盐酸顺式曲马多的一对映体为内标，(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的血清浓度在2.5～320 ng.mL-1范围内，峰面积与内标峰面积的比值和浓度呈良好的线性关系；回收率在90%和108%之间；日内、日间RSD分别小于18%和21%；最低检测浓度为1.25 ng.mL-1。结论：本方法适用于临床药代动力学研究。
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Determination of the Enantiomers of Trans Tramadol Hydrochloride in Human Serum by High Performance Capillary Electrophoresis
Liu Huichen，Liu Tiejun，Feng Chaoying，Hou Yanning
(Department of Clinical Pharmacology,Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis(HPCE)method for determining the two enantiomers of trans tramadol hydrochloride in human serum.Methods:The tramadol hydrochloride in human serum was extracted by ethyl acetate and concentrated.The electrophoretic medium was 40 mmol.L-1 Tris buffer(pH adjusted to 2.5 by H3PO4)containing sulfobutylether-β-cyclodextrin.An uncoated capillary used was 37 cm(30 cm to the detector)×75 μm.Detection was carried out with a UV detector at 214 nm.The separations were performed at 25 ℃ with a positive voltage of 15 kV.Samples were injected into the capillary by voltage (10 kV) for 20 s.Results:With one enantiomer of cis tramadol hydrochloride as internal standard,the two enantiomers of trans tramadol hydrochloride were separated well and without interference from human serum.The linear concentration region was 2.5～320 ng.mL-1 for each enantiomer.The relative recoveries were from 90% to 108%.The within-day and between-day RSDs were lower than 18% and 21% respectively.The lowest detective concentration was 1.25 ng.mL-1 for each enantiomer. Conclusion:This method is very suitable for clinical pharmacokinetic study.
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Key words trans tramadol hydrochloride,high performance capillary electrophoresis(HPCE),enantiomer separation,human sreum
盐酸曲马多(tramadol hydrochloride)的化学结构(见图1)中含2个手性碳原子，有4种立体异构体-(1R，2R)、(1S，2S)、(1R，2S)和(1S，2R)-盐酸曲马多，(+)-(1R，2R)、(-)-(1S，2S)属反式为药用品，文献报道通过激动阿片受体和影响单胺递质释放与再吸收而发挥协同镇痛作用[1～3]。为研究盐酸反式曲马多的体内药代动力学立体选择性，本文建立了测定盐酸反式曲马多对映体的高效毛细管电泳(HPCE)方法。
图1 盐酸曲马多的化学结构式(*示手性中心)
1 仪器、药品与试剂
, http://www.100md.com
P/ACE 5000型HPCE，配紫外检测器及Gold色谱软件；未涂层石英毛细管37 cm×75 μm，有效长度30 cm，美国Beckman公司。盐酸反式曲马多(含量99.7%)、(+)-盐酸反式曲马多(含量99.8%)、(-)-盐酸反式曲马多(含量99.6%)，德国Grünenthal Gmbh公司惠赠；内标物盐酸顺式曲马多，锦州医学院化学教研室合成。磺丁基-β-环糊精，中国科学院兰州化物所合成；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸、氢氧化钠、盐酸均为市售分析纯；超纯水。
2 分析条件
精密称取磺丁基-β-环糊精，以40 mmol.L-1 Tris缓冲液(磷酸调pH至2.5)溶解，配制分离介质，磺丁基-β-环糊精的浓度为0.8 mmol.L-1。进样电压10 kV,20 s，入口为阳极；分离电压15 kV,柱温25 ℃，检测波长214 nm。
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3 样品处理
1 mL血清中加1 μg.mL-1盐酸顺式曲马多溶液0.1 mL，0.5 mol.L-1氢氧化钠溶液0.5 mL，乙酸乙酯5 mL，充分混匀2 min，离心(4 500 r.min-1)15 min，取上清液4 mL氮气流吹干，残渣用0.1 mL水溶解，30 μL上机分析。
4 分离效果
上述条件下电泳图谱见图2，盐酸曲马多的4种立体异构体达到基线分离，且血清组分无干扰峰。(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多tR分别为9.47和10.30 min；盐酸顺式曲马多两对映体tR分别为8.28和8.74 min。
5 线性范围
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以盐酸顺式曲马多后出峰的对映体为内标，(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的血清浓度在2.5～320 ng.mL-1范围内，其峰面积与内标峰面积的比值和浓度呈良好的线性关系，回归方程(n=9)分别为：
Y=0.035 75+0.020 66C r=0.999 6
Y=0.063 00+0.020 35C r=0.999 4
6 回收率与精密度
图2 HPCE图谱
A.空白血清 B.空白血清加盐酸顺式曲马多
和盐酸反式曲马多 C.血样加盐酸顺式曲马多
1.盐酸顺式曲马多的一对映体 2.盐酸顺式曲
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马多的另一对映体 3.(+)-盐酸反式曲马多
4.(-)-盐酸反式曲马多 5，6，7.未知代谢物
在1天内不同时间或不同日期分别处理并测定浓度为5，20，80，240 ng.mL-1的样品液，共5次。回收率与精密度结果见表1、表2。(+)-盐酸反式曲马多、(-)-盐酸反式曲马多的回收率在90%和108%之间；日内、日间RSD分别小于18%和21%。
表1 (+)-盐酸反式曲马多日内、日间RSD及回收率(n=5) 浓度/ng.mL-1
日内
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回收率/%
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RSD/%
回收率/%
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106.20
17.51
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6.04
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6.68
97.66
7.76
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100.37
3.61
99.98
3.56
表2 (-)-盐酸反式曲马多日内、日间RSD及回收率(n=5) 浓度/ng.mL-1
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日间
回收率/%
RSD/%
回收率/%
RSD/%
5
94.20
10.40
90.40
16.59
20
104.75
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8.54
107.80
13.08
80
97.42
2.45
92.30
13.64
240
99.50
4.57
102.52
8.53
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7 灵敏度
S/N>3，本方法的最低检测浓度为1.25 ng.mL-1。
8 讨论
8.1 本文曾试用20，30，40 mmol.L-1的Tris缓冲液；pH 2.0，2.5，3.0的Tris缓冲液；β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精；1.0，0.9，0.8 mmol.L-1的磺丁基-β-环糊精；10，15，20 kV的分离电压，从分离度、分析时间、峰形、运行电流等方面考察分析条件，最终确定了本文方法。该方法已用于盐酸反式曲马多的人体立体药代动力学研究，有关工作尚在进行中。
8.2 1998年以来，Chan等曾用HPCE方法拆分盐酸反式曲马多及其代谢物对映体[4]，Rudaz等曾用HPCE方法分离测定人尿液中盐酸反式曲马多及其代谢物对映体的浓度[5]。与文献方法相比，本文方法明显提高了分离度，缩短了分析时间。此外，以低浓度磺丁基-β-环糊精为手性拆分剂，大大降低了试验成本；以电压进样对样品进行柱上富集，加之样品用水溶解，可使最低检测浓度达1.25 ng.mL-1(以水-甲醇溶解样品可降低灵敏度)。
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刘铁军：河北医科大学药学院99级实习生
参考文献
1，Gibson TP.Pharmacokinetics,efficacy,and safety of analgesia with a focus on tramadol HCl.Am J Med,1996，101(Suppl 1A):47s
2，Guo WY,Zhan Q,Zhao Y,et al.Determination of cis and trans isomers of tramadol hydrochloride by capillary zone electrophoresis.Biomed Chromatogr,1998,12:13
3，Raffa RB,Friderichs E,Reimann W,et al.Complementary and synergistic antinociceptive interaction between enantiomers of tramadol.J Pharmacol Exp Ther,1993,267:331
, 百拇医药
4，Chan ECY,Ho PC.Enantiomeric separation of tramadol hydrochloride and its metabolites by cyclodextrin-mediated capillary electrophoresis.J Chromatogr B,1998,707:287
5，Rudaz S,Veuthey JL,Desiderio C,et al.Simultaneous stereoselective analysis by capillary electrophoresis of tramadol enantiomers and their main phase I metabolites in urine.J Chromatogr A，1999,846:227
(本文于1999年5月10日收到), 百拇医药