自体造血干细胞移植物的免疫净化
http://www.100md.com
国外医学内科学分册 1999年第26卷第1期
第一军医大学附属珠江医院肿瘤内科(510282)曹漫明综述 汪森明审校
摘 要 高剂量化疗联合自体造血干细胞移植治疗恶性肿瘤失败的主要原因是疾病的复发。目前认为，肿瘤细胞随着移植物再次输入人体是导致复发的重要因素。本文综述了近年来用免疫学方法在体外净化自体造血干细胞移植的一些新进展。
关键词：自体造血干细胞移植；自体骨髓移植；自体外周造血干细胞移植；免疫净化
高剂量化疗联合自体造血干细胞移植已极大地提高了恶性血液系疾病和某些实体瘤的近期疗效，但由于回输的移植物中含有残留的肿瘤细胞，因而复发率高，病人的长期无病生存受到严重影响。最近的基因标记实验证实了在急性髓性白血病(AML)和神经母细胞瘤病人，自体移植物中残留肿瘤细胞对人体的再输入是复发的重要因素。因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的。在体外用免疫学的方法消除移植中残留肿瘤细胞的措施称为免疫净化(immunologic purging)，与其它净化方法相比，它具有特异性高，杀伤力强，费时短的优点，在自体造血干细胞移植的体外净化中占有重要地位，术文仅就近年来此方面的研究进展作一简要综述。
, http://www.100md.com
免疫正净化
免疫正净化(immunologic positive purging)是指利用免疫学方法将正常造血干细胞从移植物中纯化。目前从移植物中分离造血干细胞和祖细胞主要依靠其表面的CD34抗原，CD34+抗原分子是一种酸性糖基化膜蛋白，编码基因位于人染色体1q32区，共27kb，有9个外显子。CD34+ mRNA高水平表达于造血干细胞和祖细胞，随着细胞的分化成熟，其表达强度逐渐下降。目前临床进行CD34+选择的方法多已商品化，如Ceprate SC和 Baxter lsolex 300分离柱等，它们的基本原理都是以抗CD34单克隆抗体(McAb)为探针，利用免疫吸附柱、免疫磁珠、免疫荧光及间接免疫包被(panning)的方法分离得到高纯度的CD34+细胞，这一过程使3个对数级的肿瘤细胞得到清除[1]。作为免疫正净化的产物，移植物中CD34+细胞的数量是决定移植后造血重建能否成功的一个关键因素，Bensinger[2]强调，为了保证血小板在2周内恢复到>20×109/L的水平，CD34+细胞必须≥5×106/kg;如果低于1×106/kg，那么移植失败的危险将大大增加。许多研究者[3,4]的临床资料都显示：高剂量化疗后，回输经CD34+正净化的移植，在中位时间15天和11天后，中性粒细胞和血小板可分别达以0.5×109/L和20×109/L，此结果与未净化的移植物产生的效果类似，证明CD34+细胞具有完全重建造血的能力。
, 百拇医药
近年深入的研究发现，许多造血系恶性肿瘤细胞，包括多数髓性白血病、部分急性淋巴母细胞白血病及淋巴瘤细胞皆可表达CD34抗原，对于多发性骨髓瘤病人的CD34+细胞群是否含有恶性成分，目前仍有争论。根据这些发现，有人认为[1,2,5]：在CD34+细胞纯化的同时也可能使肿瘤干细胞富集于移植物中。针对这一问题，人们已开始尝试使用CD34+ Thy-1+ Lin- 或CD34+CD38-或CD34+ HLA-DR为细胞表面标志，以分离真正纯净的造血干细胞和祖细胞。如此虽可得到肿瘤负荷极低的干细胞移植物，但常使T、B细胞、NK细胞(CD56+)、单核细胞(CD14+)和T辅助细胞(CD4+)丢失，从而导致病人免疫恢复延迟。
, http://www.100md.com
免疫负净化
利用免疫学方法将肿瘤细胞从自体移植物中清降称为免疫负净化(immunologic negative purging)，目前常用下列5种方法进行临床和临床前研究。
补体依赖的细胞毒作用 补体(C)依赖的细胞毒作用即将McAb与肿瘤细胞结合后再加入补体，从而杀死肿瘤细胞，达到净化造血干细胞移植物的目的，也称为McAb法。目前补体在临床的应用仍存在一些问题，例如大量补体的细胞毒作用常有变异，有时甚至对正常细胞也产生非特异性毒性。有人研究发现，作为补体来源的兔的年龄对取得最佳细胞毒效应是重要的，取自25天兔血浆的补体优于35天或45天兔；另外为避免补体失活带来的弊端，用McAb-C进行多次处理比单次处理效果更好。
由于肿瘤细胞存在抗原异质性，单一的McAb加补体只能清除2个对数级的胩瘤细胞，目前临床研究多使用抗多种不同抗原决定簇的复合型McAb，可除去4个对数级的肿瘤细胞。Anderson等[6]曾报告了用单抗(抗CD10、CD20和PCA-1)加兔补体对26例多发性骨髓瘤病人进行骨髓体外净化的临床研究结果：在骨髓回输后，23例获造血重建，粒细胞和血小板恢复(≥0.5×109/L和≥20×109/L)的中位时间分别为23天和25天。治疗后完全缓解(CR)11例，部分缓解(PR)14例；随访至报告时，中位无进展生存率(PFS)达36个月，近期和远期疗效均令人满意。
, 百拇医药
免疫磁珠 用抗肿瘤McAb与磁性颗粒结合，在磁场作用下，可使与免疫磁珠相连的肿瘤细胞从移植中分离出来。与McAb-C法相比，免疫磁珠不仅可清除低密度表达靶抗原的肿瘤细胞，而且对已耐受补体细胞毒作用的B细胞肿瘤也有显著疗效，可清除4～6个对数级的肿瘤细胞，因此已成为目前临床研究中最常用的体外净化方法之一[5，7]。
免疫毒素 用于体外净化的免疫毒素是由特异性抗体与细胞毒素结合而成，结合物中的抗体能特异地识别肿瘤细胞，使毒素对其产生选择性杀伤效应。常用的毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、皂角毒等，大多通过抑制靶细胞核糖体的蛋白质合成而产生细胞毒，为减轻这些毒素对正常造血细胞的毒性，人们采用单链免疫毒素(如苦瓜毒素)净化移植或对某些免疫毒素的结构进行修饰，如通过封闭蓖麻毒素B链的半乳糖结合区来阻止其与“非靶细胞”的非特异性结合。目前已发展了抗CD5、CD7、CD13、CD14和CD33、的免疫毒素，与McAb-C法相比，此法可更有效地清除肿瘤细胞，对正常造血祖细胞保持较低毒性[8]。
, http://www.100md.com
双特异抗体 最近已有人用双特异抗体(bispecific antibody ,BsAb )开展了自体骨髓体外净化的临床前研究。BsAb能够同时识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用的双重功能，经过合理设计的BsAb能结合和聚集效应细胞于肿瘤部位，激活效应细胞的活性，诱导肿瘤细胞溶解。Kanekno等[9]用IL-2和抗CD3单抗刺激外周血单个核细胞产生LAK活性，称之为T3LAK细胞，加用抗CD3×抗CD13的BsAb后，可明显增强对CD13+白血病细胞的杀伤。Silla等[10]研制的251×3G8的BsAb，可同时与CD33+肿瘤靶细胞和CD16+的NK细胞结合，对正常骨髓中混入的HL-60白血病细胞株有较强毒性，但不损害造血祖细胞。
细胞因子激活的免疫效应细胞 自外周血来源的LAK细胞体外净化急性淋巴细胞白血病病人骨髓获得成功以来，如何利用人体自身的免疫效应细胞进行移植物净化已成为日益受到重视的研究方向。Margolin等[11]进一步研究了IL-2激活的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells ,BMMC)后发现：对于进行自体骨髓移植的缓解期的急性白血病人，BMMC对耐药的微小残留病(MRD)有显著的细胞毒作用，并不影响造血细胞的生长。
, http://www.100md.com
在许多慢性髓性白血病(CML)病例，LAK细胞却不能有效地杀伤肿瘤细胞，关于CML细胞对LAK细胞产生抵抗的原因目前尚不清楚。有学者报告，用外周血淋巴细胞与IFN-α孵育1天后再加入IL-1、涸和CD3单抗共同孵育1天，可得到细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced kill cells CIK cells)它能高效地杀灭CML细胞。实验显示[12]：CIK细胞对CML细胞显著的细胞毒作用主要来自细胞因子刺激产生的CD3+/CD56+细胞。Dickinson等[13]的研究表明，IL-2联用IFN-γ或TNF-α与骨髓在体外共同孵育，不仅激活骨髓中NK细胞产生LAK活性，而且使CD3+、CD8+、CD25+和CD56+细胞数量明显增多，这些被激活的免疫效应细胞共同发挥杀伤肿瘤细胞的作用，使细胞毒作用显著增强。
免疫双净化
, 百拇医药
将免疫正、负净化法结合起来进行移植物体外净化被称为免疫双净化(immunologic double purging)。1996年Nimgaonker等[14]报道了用CD34+正净化联合McAb-C 负净化对AML病人移植物进行双净化，证实此法能使净化效果明显提高，使白血病细胞减少7个对数级，CD15+细胞减少1～4个对数级，造血细胞无明显损失。最近的临床研究表明，用免疫磁珠CD34+正净化联合抗B细胞抗体的免疫磁珠负净化明显优于单一的免疫正净化或负净化，而外周血造血祖细胞重建造血功能并未降低。研究者们[5]将此法用于被肿瘤严重污染的慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人骨髓，清除了超过6个对数级的CLL细胞，他们认为此法不仅可达到更为彻底的净化，而且可清除CD34+细胞纯化后可能存在于移植物中的肿瘤干细胞(CD34+ CD19+)。Beaujean等[7]的临床研究也得到了类似的结果。
, 百拇医药
综上所述，免疫净化法因其特异性强、杀伤肿瘤细胞效率高，对造血细胞损伤小等优点，已广泛应用于临床自体造血干细胞移植的体外净化。从长远看，CD34+正净化联合免疫负净化的双净化措施可保留高纯度的造血干细胞，最大限度地清除肿瘤细胞，在自体造血干细胞移植中有着广阔的应用前景。
参考文献
1 Cremer FW, Kiel K,Sucker C et al .Leukemia,1997;11(Suppl 5):S41-S46
2 Bensinger WI.Bone Marrow Transplant,1998;21:113-115
3 Koc ON, Gerson SL,Phillips GL et al.Bone Marrow Transplant,1998;21:337-343
, 百拇医药
4 Hohaus S,Pforsich M, Murea S et al .Br J Haematol,1997;97:881-888
5 Paulus U,Schmitz N,Viehmann K et al.Bone Marrow Transplant,1997;20:415-420
6 Anderson KC,Anderson J,Soiffer R et al. Blood,1993;82(8):2568-2576
7 Beaujean F, Bennaceur AL,Brault P et al.Bone Marrow Transplant,1997;19(Suppl 1):S53
8 Roy DC,Perreault C,Belanger R et al.Clin Immunol,1995;15:51-57
, 百拇医药
9 Kanekno T, Fusanch Y, Kakui Y et al .Leuk Lymphoma,1994;14(3-4):219-229
10 Silla IM,Chen J ,Zhong RK et al.Br J Haematol,1995;89:712-718
11 Margolin KA,Wright C, Foman SJ et al .Leukemia,1997;11(57):723-728
12 Scheffoldd C,Brandt K,Johnston V et al .Bone Marrow Transplant,1995;15(1):33-39
13 Dickinson AM,Middleton SL,Latham J et al.Leukemia,1995;9(3):4444-449
14 Nimgaonkar M, Kemp A, Lancia J et al ,J Hematother,1996;5(1):39-48
(收稿：1998-03-20)
校对：2000-03-09 22：30 杜育苗, 百拇医药
摘 要 高剂量化疗联合自体造血干细胞移植治疗恶性肿瘤失败的主要原因是疾病的复发。目前认为，肿瘤细胞随着移植物再次输入人体是导致复发的重要因素。本文综述了近年来用免疫学方法在体外净化自体造血干细胞移植的一些新进展。
关键词：自体造血干细胞移植；自体骨髓移植；自体外周造血干细胞移植；免疫净化
高剂量化疗联合自体造血干细胞移植已极大地提高了恶性血液系疾病和某些实体瘤的近期疗效，但由于回输的移植物中含有残留的肿瘤细胞，因而复发率高，病人的长期无病生存受到严重影响。最近的基因标记实验证实了在急性髓性白血病(AML)和神经母细胞瘤病人，自体移植物中残留肿瘤细胞对人体的再输入是复发的重要因素。因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的。在体外用免疫学的方法消除移植中残留肿瘤细胞的措施称为免疫净化(immunologic purging)，与其它净化方法相比，它具有特异性高，杀伤力强，费时短的优点，在自体造血干细胞移植的体外净化中占有重要地位，术文仅就近年来此方面的研究进展作一简要综述。
, http://www.100md.com
免疫正净化
免疫正净化(immunologic positive purging)是指利用免疫学方法将正常造血干细胞从移植物中纯化。目前从移植物中分离造血干细胞和祖细胞主要依靠其表面的CD34抗原，CD34+抗原分子是一种酸性糖基化膜蛋白，编码基因位于人染色体1q32区，共27kb，有9个外显子。CD34+ mRNA高水平表达于造血干细胞和祖细胞，随着细胞的分化成熟，其表达强度逐渐下降。目前临床进行CD34+选择的方法多已商品化，如Ceprate SC和 Baxter lsolex 300分离柱等，它们的基本原理都是以抗CD34单克隆抗体(McAb)为探针，利用免疫吸附柱、免疫磁珠、免疫荧光及间接免疫包被(panning)的方法分离得到高纯度的CD34+细胞，这一过程使3个对数级的肿瘤细胞得到清除[1]。作为免疫正净化的产物，移植物中CD34+细胞的数量是决定移植后造血重建能否成功的一个关键因素，Bensinger[2]强调，为了保证血小板在2周内恢复到>20×109/L的水平，CD34+细胞必须≥5×106/kg;如果低于1×106/kg，那么移植失败的危险将大大增加。许多研究者[3,4]的临床资料都显示：高剂量化疗后，回输经CD34+正净化的移植，在中位时间15天和11天后，中性粒细胞和血小板可分别达以0.5×109/L和20×109/L，此结果与未净化的移植物产生的效果类似，证明CD34+细胞具有完全重建造血的能力。
, 百拇医药
近年深入的研究发现，许多造血系恶性肿瘤细胞，包括多数髓性白血病、部分急性淋巴母细胞白血病及淋巴瘤细胞皆可表达CD34抗原，对于多发性骨髓瘤病人的CD34+细胞群是否含有恶性成分，目前仍有争论。根据这些发现，有人认为[1,2,5]：在CD34+细胞纯化的同时也可能使肿瘤干细胞富集于移植物中。针对这一问题，人们已开始尝试使用CD34+ Thy-1+ Lin- 或CD34+CD38-或CD34+ HLA-DR为细胞表面标志，以分离真正纯净的造血干细胞和祖细胞。如此虽可得到肿瘤负荷极低的干细胞移植物，但常使T、B细胞、NK细胞(CD56+)、单核细胞(CD14+)和T辅助细胞(CD4+)丢失，从而导致病人免疫恢复延迟。
, http://www.100md.com
免疫负净化
利用免疫学方法将肿瘤细胞从自体移植物中清降称为免疫负净化(immunologic negative purging)，目前常用下列5种方法进行临床和临床前研究。
补体依赖的细胞毒作用 补体(C)依赖的细胞毒作用即将McAb与肿瘤细胞结合后再加入补体，从而杀死肿瘤细胞，达到净化造血干细胞移植物的目的，也称为McAb法。目前补体在临床的应用仍存在一些问题，例如大量补体的细胞毒作用常有变异，有时甚至对正常细胞也产生非特异性毒性。有人研究发现，作为补体来源的兔的年龄对取得最佳细胞毒效应是重要的，取自25天兔血浆的补体优于35天或45天兔；另外为避免补体失活带来的弊端，用McAb-C进行多次处理比单次处理效果更好。
由于肿瘤细胞存在抗原异质性，单一的McAb加补体只能清除2个对数级的胩瘤细胞，目前临床研究多使用抗多种不同抗原决定簇的复合型McAb，可除去4个对数级的肿瘤细胞。Anderson等[6]曾报告了用单抗(抗CD10、CD20和PCA-1)加兔补体对26例多发性骨髓瘤病人进行骨髓体外净化的临床研究结果：在骨髓回输后，23例获造血重建，粒细胞和血小板恢复(≥0.5×109/L和≥20×109/L)的中位时间分别为23天和25天。治疗后完全缓解(CR)11例，部分缓解(PR)14例；随访至报告时，中位无进展生存率(PFS)达36个月，近期和远期疗效均令人满意。
, 百拇医药
免疫磁珠 用抗肿瘤McAb与磁性颗粒结合，在磁场作用下，可使与免疫磁珠相连的肿瘤细胞从移植中分离出来。与McAb-C法相比，免疫磁珠不仅可清除低密度表达靶抗原的肿瘤细胞，而且对已耐受补体细胞毒作用的B细胞肿瘤也有显著疗效，可清除4～6个对数级的肿瘤细胞，因此已成为目前临床研究中最常用的体外净化方法之一[5，7]。
免疫毒素 用于体外净化的免疫毒素是由特异性抗体与细胞毒素结合而成，结合物中的抗体能特异地识别肿瘤细胞，使毒素对其产生选择性杀伤效应。常用的毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、皂角毒等，大多通过抑制靶细胞核糖体的蛋白质合成而产生细胞毒，为减轻这些毒素对正常造血细胞的毒性，人们采用单链免疫毒素(如苦瓜毒素)净化移植或对某些免疫毒素的结构进行修饰，如通过封闭蓖麻毒素B链的半乳糖结合区来阻止其与“非靶细胞”的非特异性结合。目前已发展了抗CD5、CD7、CD13、CD14和CD33、的免疫毒素，与McAb-C法相比，此法可更有效地清除肿瘤细胞，对正常造血祖细胞保持较低毒性[8]。
, http://www.100md.com
双特异抗体 最近已有人用双特异抗体(bispecific antibody ,BsAb )开展了自体骨髓体外净化的临床前研究。BsAb能够同时识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用的双重功能，经过合理设计的BsAb能结合和聚集效应细胞于肿瘤部位，激活效应细胞的活性，诱导肿瘤细胞溶解。Kanekno等[9]用IL-2和抗CD3单抗刺激外周血单个核细胞产生LAK活性，称之为T3LAK细胞，加用抗CD3×抗CD13的BsAb后，可明显增强对CD13+白血病细胞的杀伤。Silla等[10]研制的251×3G8的BsAb，可同时与CD33+肿瘤靶细胞和CD16+的NK细胞结合，对正常骨髓中混入的HL-60白血病细胞株有较强毒性，但不损害造血祖细胞。
细胞因子激活的免疫效应细胞 自外周血来源的LAK细胞体外净化急性淋巴细胞白血病病人骨髓获得成功以来，如何利用人体自身的免疫效应细胞进行移植物净化已成为日益受到重视的研究方向。Margolin等[11]进一步研究了IL-2激活的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells ,BMMC)后发现：对于进行自体骨髓移植的缓解期的急性白血病人，BMMC对耐药的微小残留病(MRD)有显著的细胞毒作用，并不影响造血细胞的生长。
, http://www.100md.com
在许多慢性髓性白血病(CML)病例，LAK细胞却不能有效地杀伤肿瘤细胞，关于CML细胞对LAK细胞产生抵抗的原因目前尚不清楚。有学者报告，用外周血淋巴细胞与IFN-α孵育1天后再加入IL-1、涸和CD3单抗共同孵育1天，可得到细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced kill cells CIK cells)它能高效地杀灭CML细胞。实验显示[12]：CIK细胞对CML细胞显著的细胞毒作用主要来自细胞因子刺激产生的CD3+/CD56+细胞。Dickinson等[13]的研究表明，IL-2联用IFN-γ或TNF-α与骨髓在体外共同孵育，不仅激活骨髓中NK细胞产生LAK活性，而且使CD3+、CD8+、CD25+和CD56+细胞数量明显增多，这些被激活的免疫效应细胞共同发挥杀伤肿瘤细胞的作用，使细胞毒作用显著增强。
免疫双净化
, 百拇医药
将免疫正、负净化法结合起来进行移植物体外净化被称为免疫双净化(immunologic double purging)。1996年Nimgaonker等[14]报道了用CD34+正净化联合McAb-C 负净化对AML病人移植物进行双净化，证实此法能使净化效果明显提高，使白血病细胞减少7个对数级，CD15+细胞减少1～4个对数级，造血细胞无明显损失。最近的临床研究表明，用免疫磁珠CD34+正净化联合抗B细胞抗体的免疫磁珠负净化明显优于单一的免疫正净化或负净化，而外周血造血祖细胞重建造血功能并未降低。研究者们[5]将此法用于被肿瘤严重污染的慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人骨髓，清除了超过6个对数级的CLL细胞，他们认为此法不仅可达到更为彻底的净化，而且可清除CD34+细胞纯化后可能存在于移植物中的肿瘤干细胞(CD34+ CD19+)。Beaujean等[7]的临床研究也得到了类似的结果。
, 百拇医药
综上所述，免疫净化法因其特异性强、杀伤肿瘤细胞效率高，对造血细胞损伤小等优点，已广泛应用于临床自体造血干细胞移植的体外净化。从长远看，CD34+正净化联合免疫负净化的双净化措施可保留高纯度的造血干细胞，最大限度地清除肿瘤细胞，在自体造血干细胞移植中有着广阔的应用前景。
参考文献
1 Cremer FW, Kiel K,Sucker C et al .Leukemia,1997;11(Suppl 5):S41-S46
2 Bensinger WI.Bone Marrow Transplant,1998;21:113-115
3 Koc ON, Gerson SL,Phillips GL et al.Bone Marrow Transplant,1998;21:337-343
, 百拇医药
4 Hohaus S,Pforsich M, Murea S et al .Br J Haematol,1997;97:881-888
5 Paulus U,Schmitz N,Viehmann K et al.Bone Marrow Transplant,1997;20:415-420
6 Anderson KC,Anderson J,Soiffer R et al. Blood,1993;82(8):2568-2576
7 Beaujean F, Bennaceur AL,Brault P et al.Bone Marrow Transplant,1997;19(Suppl 1):S53
8 Roy DC,Perreault C,Belanger R et al.Clin Immunol,1995;15:51-57
, 百拇医药
9 Kanekno T, Fusanch Y, Kakui Y et al .Leuk Lymphoma,1994;14(3-4):219-229
10 Silla IM,Chen J ,Zhong RK et al.Br J Haematol,1995;89:712-718
11 Margolin KA,Wright C, Foman SJ et al .Leukemia,1997;11(57):723-728
12 Scheffoldd C,Brandt K,Johnston V et al .Bone Marrow Transplant,1995;15(1):33-39
13 Dickinson AM,Middleton SL,Latham J et al.Leukemia,1995;9(3):4444-449
14 Nimgaonkar M, Kemp A, Lancia J et al ,J Hematother,1996;5(1):39-48
(收稿：1998-03-20)
校对：2000-03-09 22：30 杜育苗, 百拇医药