丁型肝炎病人肝组织HDVRNA与HBVDNA的表达及关系
作者：顾小红 李奇芬 王宇明ayn, http://www.100md.com
单位：顾小红(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；李奇芬(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；王宇明(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)ayn, http://www.100md.com
关键词：丁型肝炎；丁型肝炎病毒抗原；丁型肝炎病毒核糖核酸；乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸ayn, http://www.100md.com
免疫学杂志000315 [摘 要]目的 探讨丁型肝炎病人肝组织中HDAg、HDVRNA与HBVDNA表达及关系。方法 应用免疫组化和原位杂交技术检测了79例丁型肝炎病人肝组织HDAg、HDVRAN、HBVDNA表达，以52例乙型肝炎病人肝组织HBVDNA表达作对照。结果 丁型肝炎HBVDNA检出率(27%)低于乙型肝炎(44%)(P<0.05)。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积或HDAg呈浆型强表达，HDAg与HDVRNA表达及分布呈一致性(P>0.05)。HBVDNA与HDAg表达强度呈负性相关(P<0.05)。结论 HDV感染会抑制HBV复制，尤其是HDAg或HDVRNA强表达时；在HDV致病机制中可能既有HDV的直接细胞毒性作用，也有HBV和HDV的协同作用。ayn, http://www.100md.com
[中图分类号]R512.64 [文献标识码]Aayn, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0214-04ayn, http://www.100md.com
Study on the expression and relationship between HDVRNA and HBVDNA in liver tissue of the patients with hepatitis Dayn, http://www.100md.com
GU Xiao-hong，LI Qi-fen，WANG Yu-mingayn, http://www.100md.com
(Infectious Disease Center Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)ayn, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To explore the expression and relationship of hepatitis D virus antigen (HDAg)/hepatitis delta virus ribonucleic acid(HDVRNA) and hepatitis B virus deoxyribonucleic acid(HBVDNA) in liver tissue of the patients with hepatitis D(HD).Methods HDAg，HDVRNA and HBVDNA in paraffin-embedded liver tissue from 79 liver biopsy or autopsy samples from the patients with HD were studied with immunohistochemical techniques and hybridization in situ，meanwhile，compared with the expression of HBVDNA in liver tissues of the patients with hepatitis B(HB).Results It showed that the detection rate of HBVDNA in liver specimens of HD(27%，21/79) was lower than that of hepatitis B(44%，23/52)(P<0.05).Strong expression of HDAg and HDVRNA were shown in the bollooning degeneration hepatocytes and hepatocyts near piecemeal necrosis region.HDAg expression was significently negative association with HBVDNA expression(P<0.05).Conclusion HDV infection can inhibit replication of HBVDNA，espcially at strong expressiong of HDAg or HDVRNA. Besides interactions between HBV and HDV，it is possible that direct cytotoxicity of HDV may play an important pathogenetic role in pathogenetic mechanisms of HDV.
[Key words]hepatitis D；hepatitis D virus antigen；hepatitis delta virus ribonucleic acid；hepatitis B virus deoxyribonuc-leic acidlk5/l, 百拇医药
丁型肝炎病毒(HDV)是一缺陷性RNA病毒，其病毒颗粒由乙型肝炎病毒(HBV)提供的HBsAg组成的外壳及HDAg和HDVRNA组成的核壳体构成。在丁型肝炎的发病机理中HDV和HBV的作用并不十分清楚，本研究采用免疫组化及原位杂交技术检测丁型肝炎病人肝组织HDAg、HDVRNA与HBVDNA表达及关系，以探讨HDV和HBV在丁型肝炎发病机理中的作用，现报道如下：lk5/l, 百拇医药
1 材料和方法lk5/l, 百拇医药
1.1 研究对象 所有患者均为我科1990～1998年住院的急、慢性丁型肝炎患者共79例，其中急性肝炎(acute hepatitis，AHD)8例，轻度慢性肝炎(mild chronic hepatitis，Mild-CH)23例，中度慢性肝炎(moderate chronic hepatitis，Mode-CH)27例，重型肝炎(sever hepatitis，SH)21例(包括慢性重型肝炎8例，亚急性重型肝炎6例，急性重型肝炎1例，重度慢性肝炎6例)。同时以54例乙型肝炎作对照，其中AH9例，Mild-CH13例，Mode-CH 20例，SH12例(慢性重型肝炎2例，亚急性重症肝炎2例，慢性肝炎重度8例)。所有病例经血清或肝组织病理检查确诊，诊断标准以1995年《病毒性肝炎防治方案(试行)》为依据。lk5/l, 百拇医药
1.2 主要试剂及来源 免疫组化SP试剂盒为Maxim Biotech产品，购置福州迈新公司。地高辛标记HDVcDNA和HBVDNA探针原位杂交试剂盒购置华西医科大学附一院肝病研究室。丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备[1]，工作浓度1∶160。lk5/l, 百拇医药
1.3 操作方法及步骤 操作方法及步骤均按产品说明书进行操作。lk5/l, 百拇医药
1.4 对照 阳性对照为预试中HBVDNA阳性乙型肝炎肝组织切片和HDVRNA、HDAg阳性丁型肝炎肝组织切片。阴性对照选自正常人肝组织，其血清各型肝炎标志物均阴性，此外，分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作为替代实验，每例切片先检测HDAg，然后进行原位杂交。
原位杂交均设如下对照：①除不加探针外，其余过程同原位杂交，结果为阴性；②切片在杂交前用RNase消化2h，37°C，杂交结果为阴性。{h0, http://www.100md.com
1.5 结果判断标准 HDVRNA、HBVDNA原位杂交结果判断：①阴性：肝组织无紫红-紫蓝色染色。②阳性：肝细胞胞浆和/或胞核呈紫红-紫蓝色染色。阳性程度分三级：低倍镜视野阳性细胞少于1/3为(+)，2/3为(++)，大于2/3为(+++)。{h0, http://www.100md.com
1.6 统计学处理 采用计数资料的χ2检验和秩相关分析。{h0, http://www.100md.com
2 结果{h0, http://www.100md.com
2.1 丁型肝炎患者肝组织中HDAg表达 HDAg分布于肝细胞浆和/或膜和/或核内，以核型表达为主，其次是胞浆型表达。阳性细胞呈弥散型、灶状或片簇状分布于肝小叶内，尤其在门脉周围、坏死灶处较密集。在坏死灶边缘和气球样变性的肝细胞浆内有大量的HDAg表达，还观察到HDAg阳性标记呈眉弓状分布在有病变的肝细胞膜下。中度慢性肝炎和重型肝炎组肝组织中，HDAg阳性细胞主要呈弥散型、片簇状分布于肝小叶内，在坏死灶处及其周围较多，有时可见HDAg阳性细胞以门脉为中心沿肝索分布整个肝小叶(见图1)。在急性肝炎和轻度慢性肝炎肝组织中，HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布。秩相关分析发现重型肝炎和中度慢性肝炎HDAg表达强于急性肝炎和慢性肝炎轻度，且有统计学差别意义(见表1)。
{h0, http://www.100md.com
图1 中度慢性丁型肝炎病人肝组织HDAg表达，SP×200{h0, http://www.100md.com
Fig1 Expression of HDAg in liver tissue of the patient with moderate chronic hepatitis D，(SP×200){h0, http://www.100md.com
表1 各型丁型肝炎患者肝组织HDAg表达状况(%){h0, http://www.100md.com
Tab1 The degree of HDAg expression in different types of hepatitis D HDAg expression{h0, http://www.100md.com
AH
Mild-CHjcw, 百拇医药
Mode-CH*jcw, 百拇医药
SH*jcw, 百拇医药
-jcw, 百拇医药
2jcw, 百拇医药
5jcw, 百拇医药
4jcw, 百拇医药
2jcw, 百拇医药
+jcw, 百拇医药
4jcw, 百拇医药
13jcw, 百拇医药
4jcw, 百拇医药
1jcw, 百拇医药
++jcw, 百拇医药
2jcw, 百拇医药
5jcw, 百拇医药
11jcw, 百拇医药
8jcw, 百拇医药
+++jcw, 百拇医药
0jcw, 百拇医药
0jcw, 百拇医药
8jcw, 百拇医药
10jcw, 百拇医药
Totaljcw, 百拇医药
8jcw, 百拇医药
23jcw, 百拇医药
27jcw, 百拇医药
21jcw, 百拇医药
ridit analysis SH and Model-CH，*P<0.05，compared with AHjcw, 百拇医药
2.2 丁型肝炎患者肝组织HDVRNA表达 丁型肝炎患者肝组织中HDVRNA检出率为76%(60/79)，阳性颗粒可呈核型、浆型、及核浆型表达，以核型表达为主，阳性细胞分布可呈散在型、小灶状或片簇状分布于肝小叶周边，尤其是门脉周围和碎屑状坏死区。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积(见图2)。秩相关分析重型肝炎和中度慢性肝炎HDVRNA表达强于急性肝炎和轻度慢性肝炎(P<0.05)，阳性细胞分布也较后两者多而密集(见表2)。
图2 慢性丁型肝炎病人肝组织HDVRNA表达，ISH×400/':, http://www.100md.com
Fig2 Expression of HDVRNA in liver tissue of the patient with chronic hepatitis D，ISH×400/':, http://www.100md.com
表2 各型丁型肝炎HDVRNA表达状况(%)/':, http://www.100md.com
Tab2 Status of HDVRNA expression in different types of hepatitis D Clinic type/':, http://www.100md.com
n/':, http://www.100md.com
-/':, http://www.100md.com
+/':, http://www.100md.com
++/':, http://www.100md.com
+++/':, http://www.100md.com
Total(%)/':, http://www.100md.com
AHD/':, http://www.100md.com
8/':, http://www.100md.com
2/':, http://www.100md.com
4/':, http://www.100md.com
2/':, http://www.100md.com
0/':, http://www.100md.com
6(75)/':, http://www.100md.com
Mild-CH/':, http://www.100md.com
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12/':, http://www.100md.com
3/':, http://www.100md.com
0/':, http://www.100md.com
15(64)/':, http://www.100md.com
Mode-CH/':, http://www.100md.com
27
7\:2, http://www.100md.com
3\:2, http://www.100md.com
10\:2, http://www.100md.com
7\:2, http://www.100md.com
20(74)\:2, http://www.100md.com
SH\:2, http://www.100md.com
21\:2, http://www.100md.com
2\:2, http://www.100md.com
2\:2, http://www.100md.com
8\:2, http://www.100md.com
9\:2, http://www.100md.com
19(90)\:2, http://www.100md.com
Total\:2, http://www.100md.com
79\:2, http://www.100md.com
19(24)\:2, http://www.100md.com
21(27)\:2, http://www.100md.com
23(29)\:2, http://www.100md.com
16(20)\:2, http://www.100md.com
60(76)\:2, http://www.100md.com
ridit analysis SH and Mode-CH，P<0.05，compared with AH\:2, http://www.100md.com
2.3 HBVDNA在丁型肝炎患者肝组织表达 丁型肝炎患者肝组织HBVDNA阳性率为27%(21/79)，HBVDNA阳性颗粒呈稀疏散在分布在肝细胞浆或核内，以细胞核内分布为主，着色浅淡(见图3)，与HDAg表达强度呈负相关(P<0.05)(见表3)；而对照组HBVDNA阳性率为44%(23/52)，阳性颗粒主要密集分布于肝细胞浆内，有时可集中在细胞核周围，个别细胞核内亦可见少数浅染的阳性颗粒，着色较深，表明乙型肝炎组HBV复制活跃而且HBVDNA的基因拷贝数较多，两者比较有显著差别意义(P<0.05)。
\:2, http://www.100md.com
图3 慢性丁型肝炎病人肝组织HBVDNA表达，ISH×200
Fig3 Expression of HBVDNA in liver tissue of the patient with chronic hepatitis D，ISH×2000m)70, 百拇医药
表3 79例丁型肝炎患者肝内HDAg表达强度与HBVDAN表达关系0m)70, 百拇医药
Tab3 The relationship between HDAg expression and HBVDNA expression in liver tissues of the patients with 79 hepatitis D0m)70, 百拇医药
HDAg expression0m)70, 百拇医药
n0m)70, 百拇医药
+0m)70, 百拇医药
-0m)70, 百拇医药
Positive rate(%)0m)70, 百拇医药
-0m)70, 百拇医药
130m)70, 百拇医药
70m)70, 百拇医药
60m)70, 百拇医药
540m)70, 百拇医药
+0m)70, 百拇医药
220m)70, 百拇医药
90m)70, 百拇医药
130m)70, 百拇医药
410m)70, 百拇医药
++0m)70, 百拇医药
260m)70, 百拇医药
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210m)70, 百拇医药
190m)70, 百拇医药
+++0m)70, 百拇医药
18
0!y%nf, 百拇医药
18!y%nf, 百拇医药
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Total!y%nf, 百拇医药
79!y%nf, 百拇医药
21(27)!y%nf, 百拇医药
58(73)!y%nf, 百拇医药
χ2 test：χ2＝14.50，P<0.05!y%nf, 百拇医药
3 讨论!y%nf, 百拇医药
普遍认为HDV感染相关性肝炎比HBV单独感染病情更严重、更易慢性化，其机理并不十分肯定。通过对HBV和HDV联合感染及重叠感染患者肝组织中HDAg和HDVRNA的表达研究，发现HDAg、HDVRNA均以肝细胞核型表达为主，其次是胞浆表达，阳性细胞呈弥散型、灶型、片簇状分布于肝小叶内，尤其是在门脉周围、坏死灶处及其附近较密集，在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积或HDAg呈浆型强阳性表达，提示有HDVRNA的活动性复制，大量HDV堆积在病变肝细胞内，可以直接损害肝细胞，还观察到HDAg阳性标记呈眉弓状分布在病变肝细胞膜下，这可能预示将有大量HDV从该细胞释放而感染邻近细胞。根据半定量分析可发现HDVRNA的表达基本上与HDAg表达一致。有研究发现，在HDAg血症期，HDVRNA的血清浓度与HDAg平行[2]，1986年SMEDILE等用核酸分子杂交技术检测了120例HDV感染者血清中HDV-RNA，结果58%(43/74)的慢性丁型肝炎患者为阳性，61%(17/28)的急性丁型肝炎患者为阳性，而8例急性丁型肝炎恢复期患者或抗-HD阳性的无症状HBsAg携带者均为阴性，提示HDVRNA的检测是判断HDV是否在体内复制及判断其传染性的重要手段。!y%nf, 百拇医药
HDV是一缺陷性病毒，HDV感染对HBV存在依赖关系，但慢性乙型肝炎重叠感染HDV会抑制HBV复制或HBcAg表达[5]，不少学者在HDV感染者血清中检测了各种HBV标记物的变化，甚至观察了血清和肝组织HBVDNA的含量(Southern blot法)[4]，得出相同结果。本研究采用地高辛标记的HBVDNA探针在同一肝组织作HBVDNA原位杂交，结果发现丁型肝炎HBVDNA阳性检测率及表达强度均没有乙型肝炎组高；而且有报道丁型肝炎HBcAg主要呈核型表达，HBcAg阳性细胞数明显少于HDAg阳性细胞数，HDAg很少与HBcAg共存[5]；HBVDNA颗粒稀疏且着色较淡，表明HBVDNA基因拷贝数较少，甚至阴性，而且HBVDNA复制与HDAg表达强度呈负相关。在无HDV感染的乙型肝炎组中HBVDNA多为灶性分布，颗粒密集，且着色较深，表明HBVDNA基因拷贝数较多，这一结果证明了HDV感染有抑制HBV复制或表达的作用，特别是在HDV复制活跃的阶段，即HDAg大量表达时，HBV复制受到的抑制最为明显，当抗HD阳性时，HDAg表达较弱，HBV复制受到的抑制就较少，因此仍有HBVDNA被检出，此表明HBV复制的受抑制可能是一过性的，一旦HDAg转阴，HBV复制又重新开始。HDV感染时HBV的抑制状况，因HDV感染的不同阶段而异，这与RIZZETTO等在动物实验中观察的结果亦相一致[6]。虽然丁型肝炎HBVDNA颗粒稀疏且着色较淡，仍提示有HBV呈活动性复制状态，即HDV和HBV可以同时复制[7]，以提供HBsAg为HDV复制创造有利条件。提示在HDV的致病机制中，既有HDV对肝细胞的直接细胞毒性作用，也有HBV和HDV的协同作用。
[作者简介]顾小红(1968-)，女，四川绵阳市人，主治医师，硕士，主要从事肝炎发病机理研究。现在第三军医大学大坪医院消化内科工作，重庆，400042。cv, 百拇医药
[参考文献]cv, 百拇医药
[1]郑红，李奇芬，林小红，等.人工合成丁型肝炎病毒抗原多肽片段的特征与临床应用[J].中华医学杂志，1993，77：273～275.cv, 百拇医药
[2]DENNISTON KJ，HOYER BH，SMEDILE A，et al.Cloned fragmant of the hepatitis delta virus RNA genome：sequence and dignostic application[J].Science，1986，232：873～875.cv, 百拇医药
[3]RIZZETTO M.The delta agent[J].Hepatology，1983，3：729～737.cv, 百拇医药
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[5]RIZZTTO M，CANESE MG，ARICO O，et al.Immu-nofluorescence detection of a new antigen-antibody system(delta/anti-delta)associated to the hepatitis B virus in the liver and the serum of HBsAg carriers[J].Gut，1977，18：997～1003.cv, 百拇医药
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[7]THEILMANN L，GMELIN K，WILL H，et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum positive for antibody to Delta antigen[J].J Infect Dis，1984，150：118～120.cv, 百拇医药
[收稿日期]1999-10-28；[修回日期]1999-12-03(作者：顾小红 李奇芬 王宇明)
单位：顾小红(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；李奇芬(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；王宇明(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)ayn, http://www.100md.com
关键词：丁型肝炎；丁型肝炎病毒抗原；丁型肝炎病毒核糖核酸；乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸ayn, http://www.100md.com
免疫学杂志000315 [摘 要]目的 探讨丁型肝炎病人肝组织中HDAg、HDVRNA与HBVDNA表达及关系。方法 应用免疫组化和原位杂交技术检测了79例丁型肝炎病人肝组织HDAg、HDVRAN、HBVDNA表达，以52例乙型肝炎病人肝组织HBVDNA表达作对照。结果 丁型肝炎HBVDNA检出率(27%)低于乙型肝炎(44%)(P<0.05)。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积或HDAg呈浆型强表达，HDAg与HDVRNA表达及分布呈一致性(P>0.05)。HBVDNA与HDAg表达强度呈负性相关(P<0.05)。结论 HDV感染会抑制HBV复制，尤其是HDAg或HDVRNA强表达时；在HDV致病机制中可能既有HDV的直接细胞毒性作用，也有HBV和HDV的协同作用。ayn, http://www.100md.com
[中图分类号]R512.64 [文献标识码]Aayn, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0214-04ayn, http://www.100md.com
Study on the expression and relationship between HDVRNA and HBVDNA in liver tissue of the patients with hepatitis Dayn, http://www.100md.com
GU Xiao-hong，LI Qi-fen，WANG Yu-mingayn, http://www.100md.com
(Infectious Disease Center Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)ayn, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To explore the expression and relationship of hepatitis D virus antigen (HDAg)/hepatitis delta virus ribonucleic acid(HDVRNA) and hepatitis B virus deoxyribonucleic acid(HBVDNA) in liver tissue of the patients with hepatitis D(HD).Methods HDAg，HDVRNA and HBVDNA in paraffin-embedded liver tissue from 79 liver biopsy or autopsy samples from the patients with HD were studied with immunohistochemical techniques and hybridization in situ，meanwhile，compared with the expression of HBVDNA in liver tissues of the patients with hepatitis B(HB).Results It showed that the detection rate of HBVDNA in liver specimens of HD(27%，21/79) was lower than that of hepatitis B(44%，23/52)(P<0.05).Strong expression of HDAg and HDVRNA were shown in the bollooning degeneration hepatocytes and hepatocyts near piecemeal necrosis region.HDAg expression was significently negative association with HBVDNA expression(P<0.05).Conclusion HDV infection can inhibit replication of HBVDNA，espcially at strong expressiong of HDAg or HDVRNA. Besides interactions between HBV and HDV，it is possible that direct cytotoxicity of HDV may play an important pathogenetic role in pathogenetic mechanisms of HDV.
[Key words]hepatitis D；hepatitis D virus antigen；hepatitis delta virus ribonucleic acid；hepatitis B virus deoxyribonuc-leic acidlk5/l, 百拇医药
丁型肝炎病毒(HDV)是一缺陷性RNA病毒，其病毒颗粒由乙型肝炎病毒(HBV)提供的HBsAg组成的外壳及HDAg和HDVRNA组成的核壳体构成。在丁型肝炎的发病机理中HDV和HBV的作用并不十分清楚，本研究采用免疫组化及原位杂交技术检测丁型肝炎病人肝组织HDAg、HDVRNA与HBVDNA表达及关系，以探讨HDV和HBV在丁型肝炎发病机理中的作用，现报道如下：lk5/l, 百拇医药
1 材料和方法lk5/l, 百拇医药
1.1 研究对象 所有患者均为我科1990～1998年住院的急、慢性丁型肝炎患者共79例，其中急性肝炎(acute hepatitis，AHD)8例，轻度慢性肝炎(mild chronic hepatitis，Mild-CH)23例，中度慢性肝炎(moderate chronic hepatitis，Mode-CH)27例，重型肝炎(sever hepatitis，SH)21例(包括慢性重型肝炎8例，亚急性重型肝炎6例，急性重型肝炎1例，重度慢性肝炎6例)。同时以54例乙型肝炎作对照，其中AH9例，Mild-CH13例，Mode-CH 20例，SH12例(慢性重型肝炎2例，亚急性重症肝炎2例，慢性肝炎重度8例)。所有病例经血清或肝组织病理检查确诊，诊断标准以1995年《病毒性肝炎防治方案(试行)》为依据。lk5/l, 百拇医药
1.2 主要试剂及来源 免疫组化SP试剂盒为Maxim Biotech产品，购置福州迈新公司。地高辛标记HDVcDNA和HBVDNA探针原位杂交试剂盒购置华西医科大学附一院肝病研究室。丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备[1]，工作浓度1∶160。lk5/l, 百拇医药
1.3 操作方法及步骤 操作方法及步骤均按产品说明书进行操作。lk5/l, 百拇医药
1.4 对照 阳性对照为预试中HBVDNA阳性乙型肝炎肝组织切片和HDVRNA、HDAg阳性丁型肝炎肝组织切片。阴性对照选自正常人肝组织，其血清各型肝炎标志物均阴性，此外，分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作为替代实验，每例切片先检测HDAg，然后进行原位杂交。
原位杂交均设如下对照：①除不加探针外，其余过程同原位杂交，结果为阴性；②切片在杂交前用RNase消化2h，37°C，杂交结果为阴性。{h0, http://www.100md.com
1.5 结果判断标准 HDVRNA、HBVDNA原位杂交结果判断：①阴性：肝组织无紫红-紫蓝色染色。②阳性：肝细胞胞浆和/或胞核呈紫红-紫蓝色染色。阳性程度分三级：低倍镜视野阳性细胞少于1/3为(+)，2/3为(++)，大于2/3为(+++)。{h0, http://www.100md.com
1.6 统计学处理 采用计数资料的χ2检验和秩相关分析。{h0, http://www.100md.com
2 结果{h0, http://www.100md.com
2.1 丁型肝炎患者肝组织中HDAg表达 HDAg分布于肝细胞浆和/或膜和/或核内，以核型表达为主，其次是胞浆型表达。阳性细胞呈弥散型、灶状或片簇状分布于肝小叶内，尤其在门脉周围、坏死灶处较密集。在坏死灶边缘和气球样变性的肝细胞浆内有大量的HDAg表达，还观察到HDAg阳性标记呈眉弓状分布在有病变的肝细胞膜下。中度慢性肝炎和重型肝炎组肝组织中，HDAg阳性细胞主要呈弥散型、片簇状分布于肝小叶内，在坏死灶处及其周围较多，有时可见HDAg阳性细胞以门脉为中心沿肝索分布整个肝小叶(见图1)。在急性肝炎和轻度慢性肝炎肝组织中，HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布。秩相关分析发现重型肝炎和中度慢性肝炎HDAg表达强于急性肝炎和慢性肝炎轻度，且有统计学差别意义(见表1)。
{h0, http://www.100md.com图1 中度慢性丁型肝炎病人肝组织HDAg表达，SP×200{h0, http://www.100md.com
Fig1 Expression of HDAg in liver tissue of the patient with moderate chronic hepatitis D，(SP×200){h0, http://www.100md.com
表1 各型丁型肝炎患者肝组织HDAg表达状况(%){h0, http://www.100md.com
Tab1 The degree of HDAg expression in different types of hepatitis D HDAg expression{h0, http://www.100md.com
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Mild-CHjcw, 百拇医药
Mode-CH*jcw, 百拇医药
SH*jcw, 百拇医药
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4jcw, 百拇医药
2jcw, 百拇医药
+jcw, 百拇医药
4jcw, 百拇医药
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4jcw, 百拇医药
1jcw, 百拇医药
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2jcw, 百拇医药
5jcw, 百拇医药
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8jcw, 百拇医药
+++jcw, 百拇医药
0jcw, 百拇医药
0jcw, 百拇医药
8jcw, 百拇医药
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Totaljcw, 百拇医药
8jcw, 百拇医药
23jcw, 百拇医药
27jcw, 百拇医药
21jcw, 百拇医药
ridit analysis SH and Model-CH，*P<0.05，compared with AHjcw, 百拇医药
2.2 丁型肝炎患者肝组织HDVRNA表达 丁型肝炎患者肝组织中HDVRNA检出率为76%(60/79)，阳性颗粒可呈核型、浆型、及核浆型表达，以核型表达为主，阳性细胞分布可呈散在型、小灶状或片簇状分布于肝小叶周边，尤其是门脉周围和碎屑状坏死区。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积(见图2)。秩相关分析重型肝炎和中度慢性肝炎HDVRNA表达强于急性肝炎和轻度慢性肝炎(P<0.05)，阳性细胞分布也较后两者多而密集(见表2)。
图2 慢性丁型肝炎病人肝组织HDVRNA表达，ISH×400/':, http://www.100md.com
Fig2 Expression of HDVRNA in liver tissue of the patient with chronic hepatitis D，ISH×400/':, http://www.100md.com
表2 各型丁型肝炎HDVRNA表达状况(%)/':, http://www.100md.com
Tab2 Status of HDVRNA expression in different types of hepatitis D Clinic type/':, http://www.100md.com
n/':, http://www.100md.com
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Total(%)/':, http://www.100md.com
AHD/':, http://www.100md.com
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2/':, http://www.100md.com
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6(75)/':, http://www.100md.com
Mild-CH/':, http://www.100md.com
23/':, http://www.100md.com
8/':, http://www.100md.com
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3/':, http://www.100md.com
0/':, http://www.100md.com
15(64)/':, http://www.100md.com
Mode-CH/':, http://www.100md.com
27
7\:2, http://www.100md.com
3\:2, http://www.100md.com
10\:2, http://www.100md.com
7\:2, http://www.100md.com
20(74)\:2, http://www.100md.com
SH\:2, http://www.100md.com
21\:2, http://www.100md.com
2\:2, http://www.100md.com
2\:2, http://www.100md.com
8\:2, http://www.100md.com
9\:2, http://www.100md.com
19(90)\:2, http://www.100md.com
Total\:2, http://www.100md.com
79\:2, http://www.100md.com
19(24)\:2, http://www.100md.com
21(27)\:2, http://www.100md.com
23(29)\:2, http://www.100md.com
16(20)\:2, http://www.100md.com
60(76)\:2, http://www.100md.com
ridit analysis SH and Mode-CH，P<0.05，compared with AH\:2, http://www.100md.com
2.3 HBVDNA在丁型肝炎患者肝组织表达 丁型肝炎患者肝组织HBVDNA阳性率为27%(21/79)，HBVDNA阳性颗粒呈稀疏散在分布在肝细胞浆或核内，以细胞核内分布为主，着色浅淡(见图3)，与HDAg表达强度呈负相关(P<0.05)(见表3)；而对照组HBVDNA阳性率为44%(23/52)，阳性颗粒主要密集分布于肝细胞浆内，有时可集中在细胞核周围，个别细胞核内亦可见少数浅染的阳性颗粒，着色较深，表明乙型肝炎组HBV复制活跃而且HBVDNA的基因拷贝数较多，两者比较有显著差别意义(P<0.05)。
\:2, http://www.100md.com图3 慢性丁型肝炎病人肝组织HBVDNA表达，ISH×200
Fig3 Expression of HBVDNA in liver tissue of the patient with chronic hepatitis D，ISH×2000m)70, 百拇医药
表3 79例丁型肝炎患者肝内HDAg表达强度与HBVDAN表达关系0m)70, 百拇医药
Tab3 The relationship between HDAg expression and HBVDNA expression in liver tissues of the patients with 79 hepatitis D0m)70, 百拇医药
HDAg expression0m)70, 百拇医药
n0m)70, 百拇医药
+0m)70, 百拇医药
-0m)70, 百拇医药
Positive rate(%)0m)70, 百拇医药
-0m)70, 百拇医药
130m)70, 百拇医药
70m)70, 百拇医药
60m)70, 百拇医药
540m)70, 百拇医药
+0m)70, 百拇医药
220m)70, 百拇医药
90m)70, 百拇医药
130m)70, 百拇医药
410m)70, 百拇医药
++0m)70, 百拇医药
260m)70, 百拇医药
50m)70, 百拇医药
210m)70, 百拇医药
190m)70, 百拇医药
+++0m)70, 百拇医药
18
0!y%nf, 百拇医药
18!y%nf, 百拇医药
0!y%nf, 百拇医药
Total!y%nf, 百拇医药
79!y%nf, 百拇医药
21(27)!y%nf, 百拇医药
58(73)!y%nf, 百拇医药
χ2 test：χ2＝14.50，P<0.05!y%nf, 百拇医药
3 讨论!y%nf, 百拇医药
普遍认为HDV感染相关性肝炎比HBV单独感染病情更严重、更易慢性化，其机理并不十分肯定。通过对HBV和HDV联合感染及重叠感染患者肝组织中HDAg和HDVRNA的表达研究，发现HDAg、HDVRNA均以肝细胞核型表达为主，其次是胞浆表达，阳性细胞呈弥散型、灶型、片簇状分布于肝小叶内，尤其是在门脉周围、坏死灶处及其附近较密集，在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDVRNA蓄积或HDAg呈浆型强阳性表达，提示有HDVRNA的活动性复制，大量HDV堆积在病变肝细胞内，可以直接损害肝细胞，还观察到HDAg阳性标记呈眉弓状分布在病变肝细胞膜下，这可能预示将有大量HDV从该细胞释放而感染邻近细胞。根据半定量分析可发现HDVRNA的表达基本上与HDAg表达一致。有研究发现，在HDAg血症期，HDVRNA的血清浓度与HDAg平行[2]，1986年SMEDILE等用核酸分子杂交技术检测了120例HDV感染者血清中HDV-RNA，结果58%(43/74)的慢性丁型肝炎患者为阳性，61%(17/28)的急性丁型肝炎患者为阳性，而8例急性丁型肝炎恢复期患者或抗-HD阳性的无症状HBsAg携带者均为阴性，提示HDVRNA的检测是判断HDV是否在体内复制及判断其传染性的重要手段。!y%nf, 百拇医药
HDV是一缺陷性病毒，HDV感染对HBV存在依赖关系，但慢性乙型肝炎重叠感染HDV会抑制HBV复制或HBcAg表达[5]，不少学者在HDV感染者血清中检测了各种HBV标记物的变化，甚至观察了血清和肝组织HBVDNA的含量(Southern blot法)[4]，得出相同结果。本研究采用地高辛标记的HBVDNA探针在同一肝组织作HBVDNA原位杂交，结果发现丁型肝炎HBVDNA阳性检测率及表达强度均没有乙型肝炎组高；而且有报道丁型肝炎HBcAg主要呈核型表达，HBcAg阳性细胞数明显少于HDAg阳性细胞数，HDAg很少与HBcAg共存[5]；HBVDNA颗粒稀疏且着色较淡，表明HBVDNA基因拷贝数较少，甚至阴性，而且HBVDNA复制与HDAg表达强度呈负相关。在无HDV感染的乙型肝炎组中HBVDNA多为灶性分布，颗粒密集，且着色较深，表明HBVDNA基因拷贝数较多，这一结果证明了HDV感染有抑制HBV复制或表达的作用，特别是在HDV复制活跃的阶段，即HDAg大量表达时，HBV复制受到的抑制最为明显，当抗HD阳性时，HDAg表达较弱，HBV复制受到的抑制就较少，因此仍有HBVDNA被检出，此表明HBV复制的受抑制可能是一过性的，一旦HDAg转阴，HBV复制又重新开始。HDV感染时HBV的抑制状况，因HDV感染的不同阶段而异，这与RIZZETTO等在动物实验中观察的结果亦相一致[6]。虽然丁型肝炎HBVDNA颗粒稀疏且着色较淡，仍提示有HBV呈活动性复制状态，即HDV和HBV可以同时复制[7]，以提供HBsAg为HDV复制创造有利条件。提示在HDV的致病机制中，既有HDV对肝细胞的直接细胞毒性作用，也有HBV和HDV的协同作用。
[作者简介]顾小红(1968-)，女，四川绵阳市人，主治医师，硕士，主要从事肝炎发病机理研究。现在第三军医大学大坪医院消化内科工作，重庆，400042。cv, 百拇医药
[参考文献]cv, 百拇医药
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[收稿日期]1999-10-28；[修回日期]1999-12-03(作者：顾小红 李奇芬 王宇明)