离子对RP-HPLC法测定人尿中的左氧氟沙星
作者：徐庆 姚彤炜 蒋惠娣
单位：杭州 310031 浙江大学湖滨校区药学院
关键词：
中国现代应用药学000417 左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)是第4代喹诺酮类药物， 其抗菌谱广，作用强，目前广泛用于治疗呼吸道、泌尿道、肠道、皮肤、关节等多种系统的 感染。人尿中LVFX的测定方法目前国内外已有紫外分光光度法、HPLC-荧光检测法，微生物 法、及高效液相色谱法[1～4],本实验采用离子对RP-HPLC法测定尿药中LVFX的浓 度，并建立了含中草药黄芪、黄芩的LVFX尿药浓度测定方法。方法简便，专属性好，结果可 靠。
1 试药与仪器
左氧氟沙星片(批号)，左氧氟沙 星标准品(纯度>99%)均为浙江新昌制药厂产品，黄芩，黄芪购自浙江中医学院药房，磷酸 二氢钾，四丁基溴化铵，甲醇为色谱纯或分析纯。
, http://www.100md.com
LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津) ,SPD10AVP型紫外检测器，分离柱ODS(15cm×4.6mmID),UPPER色谱数据处理机。
2 实验方法与结果
2.1 标准溶液的配制 精密称取L VFX适量，以甲醇为溶剂配成1mg/ml的标准储备液，于冰箱内4℃保存，用时以流动相稀释成 不同浓度的标准溶液。
2.2 HPLC色谱条件 流动相：甲醇-0.01M磷酸 盐缓冲液-0.5M四甲基溴化铵(20∶80∶4);流速0.8～1.0ml/min;检测波长：294nm;进 样量20μl。
2.3 LVFX标准曲线的制备 分别精取LVFX储备液置8支具 塞离心试管中，加入流动相，配成含量为12.5,20.0,62.5,125,200,300,500和700μg/ml LV FX甲醇液，取20μl在上述色谱条件下进样测定，得到相应峰面积(Y)对LVFA浓 度(X)进行线性回归，得回归方程:Y=38786.4X-118722,r=0.9995(n=3)。线性范围为12.5～700μg/ml,检出限20ng/ml。
, 百拇医药
2.4 精密度 分别精取空白尿样1ml,各加入LFVX标准溶液，使其浓度分别为12.5,125,500μg/ml,每 个浓度各制备5管，样品经3500r/min离心,0.45μm薄膜过滤后进样测定，计算日内差异，每 天重新配制3个浓度，连续测定5d计算日间差异，结果见表1。
表1 精密度测试结果 测定间隔
加入浓度/μg.ml-1
测得峰面积
加入浓 度/μg.ml-1
测得峰面积
加入浓度/μg.ml-1
, http://www.100md.com
测得峰面积
0h
15.63
486738
125.0
4159811
500.0
19731952
1h
15.63
456697
125.0
4240044
, 百拇医药
500.0
19682838
2h
15.63
463887
125.0
4231752
500.0
19615420
3h
15.63
449201
125.0
, 百拇医药
4302421
500.0
19370160
4h
15.62
446604
125.0
4305280
500.0
19484136
RSD
3.49%
1.26%
, http://www.100md.com
0.76%1
0d
15.63
498055
125.0
4159711
500.0
19614520
1d
15.63
433712
125.0
4372200
, 百拇医药
500.0
19647430
2d
15.63
481714
125.0
4379996
500.0
19077344
3d
15.63
472662
125.0
, http://www.100md.com
4282510
500.0
20153882
4d
15.62
444234
125.0
4428785
500.0
20185096
RSD
5.71%
2.45%
, 百拇医药
2.31%
2.5 样品回收率精密吸取LVFX标准溶液，加入到 空白尿样中，配制成浓度为12.5,125和500μg/ml的LVFX尿溶液，进样测定，峰面积与LVFX 加到流动相中测定出的峰面积相比，计算绝对回收率，结果见表2。表2 回收率测定结果/n=3 加和量
/μg.ml-1
测得峰
面积
测得量
/μg.ml-1
加样回收
率/%
, 百拇医药
平均回收
率 /%
RSD
/%
15.63
486738
15.63
456697
15.06±0.43
96.35
15.63
449201
125.0
, 百拇医药
4353227
125.0
4240044
113.9±1.73
91.2
96.23±4.29
4.45
125.0
4231752
500.0
19484136
500.0
, http://www.100md.com
19370166
505.5±3.18
101.1
500.0
19615420
2.6 方法专属性 以空白尿样、空白尿分别加100μl LVFX、黄芩、黄芪 、空白尿+LVFX+黄芪、空白尿+LVFX+黄芩(LVFX浓度为20μg/ml、黄芩、黄芪均为7g生药加2 00g水提取液)分别测定，结果见图1。
图1
A-空白尿；B-空白尿+LVFX；C-空白尿+黄芪；D-空白尿+黄芩；E-空白尿+黄芩+LV FX；F-空白尿+黄芪+LVFX
, 百拇医药 2.7 受试者尿样的测定 健康志愿者8名，年龄20～42岁，平均25岁 ，体重46～56kg,平均51.8kg,受试前2周禁服任何药物，试验时分别在1,8和15d服用L VFX片200mg、LVFX片200mg+黄芩7g、LVFX片200mg+黄芪7g,LVFX用200ml水送服，黄芩和黄芪 分别用200ml水煎煮服用、收集1,2,4,6,8,12和24h尿液，准确记录尿量，取适量依法测定尿 浓度，计算累积排药量X0～240,结果见图3。
图2 8名志愿者服用LVFX(1-系列1)、LVFX+黄芩(2- 系列2)、LVFX+黄芪(3-系列3)后尿药排出量-时间曲线
3 讨 论
本研究采用离子对RP-HPLC法测定健康人尿 中LVFX的浓度，并建立了中草药黄芪、黄芩中测定LVFX的方法，实验采用甲醇-磷酸盐缓冲 液(0.01M)-四丁基溴化胺(0.5M)为80∶20∶4的比例作流动相，LVFX与黄芪、黄芩、杂质得 到良好分离，分离度>1.5,线性范围为12.5～700μg/ml,r=0.9995,尿中回收 率为91.2%～101.1%,测定波长为294nm,在此条件下，空白尿、黄芩、黄芪对LVFX测定无干扰 。本方法简单快速，专属性好，可用于左氧氟沙星、左氧氟沙星与黄芩、左氧氟沙星与黄芪 合用时的尿样进行药代动力学研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]徐庆，朱卡林，马明铭.紫外分光光度法测定人尿中左氧 氟沙星.浙江医科大学学报，1998，27(2)∶88.
[2]Rybak MJ,Bailey EM,Reddy VN.Clinical evaluation o f teicoplanin fluorescence polarization immunoassay.Antimicrob Agents Chemother, 1991,35∶1586.
[3]Beringer PM,Holtom PR,Rho JP.Comparing the newest fluoroquinolones:levofloxacin and sparfloxacin.Formulary,1997,32∶926.
[4]Wong FA,Juzwin SJ,Flor SC,et al.Rapid stereospecific high-performance liquid chromatographic determination of levofl oxacin in human plasma and urine.J PHarm Biomed Anal,1997,15(6)∶765.
收稿日期：1999-07-16, 百拇医药
单位：杭州 310031 浙江大学湖滨校区药学院
关键词：
中国现代应用药学000417 左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)是第4代喹诺酮类药物， 其抗菌谱广，作用强，目前广泛用于治疗呼吸道、泌尿道、肠道、皮肤、关节等多种系统的 感染。人尿中LVFX的测定方法目前国内外已有紫外分光光度法、HPLC-荧光检测法，微生物 法、及高效液相色谱法[1～4],本实验采用离子对RP-HPLC法测定尿药中LVFX的浓 度，并建立了含中草药黄芪、黄芩的LVFX尿药浓度测定方法。方法简便，专属性好，结果可 靠。
1 试药与仪器
左氧氟沙星片(批号)，左氧氟沙 星标准品(纯度>99%)均为浙江新昌制药厂产品，黄芩，黄芪购自浙江中医学院药房，磷酸 二氢钾，四丁基溴化铵，甲醇为色谱纯或分析纯。
, http://www.100md.com
LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津) ,SPD10AVP型紫外检测器，分离柱ODS(15cm×4.6mmID),UPPER色谱数据处理机。
2 实验方法与结果
2.1 标准溶液的配制 精密称取L VFX适量，以甲醇为溶剂配成1mg/ml的标准储备液，于冰箱内4℃保存，用时以流动相稀释成 不同浓度的标准溶液。
2.2 HPLC色谱条件 流动相：甲醇-0.01M磷酸 盐缓冲液-0.5M四甲基溴化铵(20∶80∶4);流速0.8～1.0ml/min;检测波长：294nm;进 样量20μl。
2.3 LVFX标准曲线的制备 分别精取LVFX储备液置8支具 塞离心试管中，加入流动相，配成含量为12.5,20.0,62.5,125,200,300,500和700μg/ml LV FX甲醇液，取20μl在上述色谱条件下进样测定，得到相应峰面积(Y)对LVFA浓 度(X)进行线性回归，得回归方程:Y=38786.4X-118722,r=0.9995(n=3)。线性范围为12.5～700μg/ml,检出限20ng/ml。
, 百拇医药
2.4 精密度 分别精取空白尿样1ml,各加入LFVX标准溶液，使其浓度分别为12.5,125,500μg/ml,每 个浓度各制备5管，样品经3500r/min离心,0.45μm薄膜过滤后进样测定，计算日内差异，每 天重新配制3个浓度，连续测定5d计算日间差异，结果见表1。
表1 精密度测试结果 测定间隔
加入浓度/μg.ml-1
测得峰面积
加入浓 度/μg.ml-1
测得峰面积
加入浓度/μg.ml-1
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测得峰面积
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15.63
486738
125.0
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500.0
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15.62
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4305280
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19484136
RSD
3.49%
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0.76%1
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RSD
5.71%
2.45%
, 百拇医药
2.31%
2.5 样品回收率精密吸取LVFX标准溶液，加入到 空白尿样中，配制成浓度为12.5,125和500μg/ml的LVFX尿溶液，进样测定，峰面积与LVFX 加到流动相中测定出的峰面积相比，计算绝对回收率，结果见表2。表2 回收率测定结果/n=3 加和量
/μg.ml-1
测得峰
面积
测得量
/μg.ml-1
加样回收
率/%
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平均回收
率 /%
RSD
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15.63
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500.0
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2.6 方法专属性 以空白尿样、空白尿分别加100μl LVFX、黄芩、黄芪 、空白尿+LVFX+黄芪、空白尿+LVFX+黄芩(LVFX浓度为20μg/ml、黄芩、黄芪均为7g生药加2 00g水提取液)分别测定，结果见图1。
图1
A-空白尿；B-空白尿+LVFX；C-空白尿+黄芪；D-空白尿+黄芩；E-空白尿+黄芩+LV FX；F-空白尿+黄芪+LVFX
, 百拇医药 2.7 受试者尿样的测定 健康志愿者8名，年龄20～42岁，平均25岁 ，体重46～56kg,平均51.8kg,受试前2周禁服任何药物，试验时分别在1,8和15d服用L VFX片200mg、LVFX片200mg+黄芩7g、LVFX片200mg+黄芪7g,LVFX用200ml水送服，黄芩和黄芪 分别用200ml水煎煮服用、收集1,2,4,6,8,12和24h尿液，准确记录尿量，取适量依法测定尿 浓度，计算累积排药量X0～240,结果见图3。
图2 8名志愿者服用LVFX(1-系列1)、LVFX+黄芩(2- 系列2)、LVFX+黄芪(3-系列3)后尿药排出量-时间曲线
3 讨 论
本研究采用离子对RP-HPLC法测定健康人尿 中LVFX的浓度，并建立了中草药黄芪、黄芩中测定LVFX的方法，实验采用甲醇-磷酸盐缓冲 液(0.01M)-四丁基溴化胺(0.5M)为80∶20∶4的比例作流动相，LVFX与黄芪、黄芩、杂质得 到良好分离，分离度>1.5,线性范围为12.5～700μg/ml,r=0.9995,尿中回收 率为91.2%～101.1%,测定波长为294nm,在此条件下，空白尿、黄芩、黄芪对LVFX测定无干扰 。本方法简单快速，专属性好，可用于左氧氟沙星、左氧氟沙星与黄芩、左氧氟沙星与黄芪 合用时的尿样进行药代动力学研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]徐庆，朱卡林，马明铭.紫外分光光度法测定人尿中左氧 氟沙星.浙江医科大学学报，1998，27(2)∶88.
[2]Rybak MJ,Bailey EM,Reddy VN.Clinical evaluation o f teicoplanin fluorescence polarization immunoassay.Antimicrob Agents Chemother, 1991,35∶1586.
[3]Beringer PM,Holtom PR,Rho JP.Comparing the newest fluoroquinolones:levofloxacin and sparfloxacin.Formulary,1997,32∶926.
[4]Wong FA,Juzwin SJ,Flor SC,et al.Rapid stereospecific high-performance liquid chromatographic determination of levofl oxacin in human plasma and urine.J PHarm Biomed Anal,1997,15(6)∶765.
收稿日期：1999-07-16, 百拇医药