孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前基因分析
作者：邹丽 朱剑文 徐可树 张会军
单位：同济医科大学附属协和医院妇产科，武汉 430022
关键词：孕妇外周血；单个胎儿有核红细胞；引物延伸预扩增；性别测定
同济医科大学学报000421 摘要 为探讨母血中单个胎儿有核红细胞(NRBC)行产 前基因分析的可行性，对45名孕妇外周血行不 连续密度梯度离心，显微操作获取单个NRBC，A组24例进行引物延伸预扩增(PEP)，后行Y 染色体特异性DYZ1基因的聚合酶链反应(PCR)，B组21例直接进行Y染色体特异性DYZ1基因的P CR。 发现45名孕妇中有24名检出NRBC， A组中男胎符合率为70%，总符合率为83.3%，B组 则均未扩增到PCR产物。提示用母血中单个胎儿NRBC经PEP-PCR法行产前基因分析是可行的 。
中图法分类号 R730.43， R714.52
, http://www.100md.com
Prenatal Genetic Analysis of Single Fetal Nuclea ted
Red Blood Cell from Maternal Blood
Zou Li Zhu Jianwen Xu Keshu et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xiehe Hospita l, Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract In oder to study the feasibility of prenatal genetic analysis of s ingle fetal nucleated red blood cell (NRBC) from maternal blood, peripheral bloo d from 45 pregnant women was subjected to discontinuous density gradient centrifugation to obtain single NRBC by using a micromanipulator. Primer extension preamplificati on (PEP) and polymerase chain reaction (PCR) of a Y-chromosome-specific rep eat sequence were performed in 24 patients (group A). Only PCR of a Y-chromosom e-specific repeat sequence was performed in the remaining 21 cases (group B). I t was found that NRBCs were detectable in 24 out of 45 pregnant women. In group A, male pregnancy was correctly predicted in 70 %. The overall agreement of the diagnosis was 83.3 %. In group B, the Y-specific DNA sequence was not amplifie d. It was suggested that the prenatal genetic analysis of single fetal NRBC by usi ng PEP-PCR method is feasible.
, 百拇医药
Key words maternal peripheral blood; single fetal nucleated re d blood cell; sex identification; primer extension preamplification
从孕妇外周血中获取胎儿细胞为无创性产前诊断开辟了一条颇具前景的道路，其中胎儿有核 红细胞(NRBC)被公认为是可用于无创性产前诊断比较好的胎儿遗传物质来源[1，2] 。由于通常采用的分离技术如：荧光激活细胞分离技术(FACS)和磁激活细胞分离技术(M ACS)等，所得到的胎儿细胞并不能避免少量母血细胞的污染，因此努力使胎儿遗传物质得到 纯化对于无创性产前遗传学诊断是具有重大意义的。本研究通过采用显微操作法，尝试在单 个细胞水平对胎儿进行产前基因分析。
1 资料与方法
1.1 标本来源
, http://www.100md.com
外周血采自1999年5月至12月,孕龄为11～30周、年龄21～30岁的妊娠妇女，共45例，无贫 血等合并症。每次采血7 ml，置于盛有EDTA抗凝剂的无菌试管中，生理盐水等倍稀释后备用 ；另外各选5名正常男性及5名无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 不连续密度梯度离心富集胎儿NRBC：所用分离介质为Pharmaci公司生产的Percoll细胞分离液。具体步骤为：用密度为1.085g/ml和1.075g/ml的Percoll细胞分离液在离心管中制成密度梯度，将7ml外周血用生理盐水等倍稀释后缓慢加入。4℃下以3000r/min离心30min，收集中层分离界面细胞，以生理盐水洗涤后，4℃保存备用。
1.2.2 显微操作法获取单个NRBC：将分离后的细胞制成涂片，用May-Giemsa复合染色法 染色，光学显微镜下识别NRBC并进行计数。在NRBC出现的相应范围内滴1～2滴2.5 g/L trypsin(胰蛋白酶)溶液，使之易于从玻片上松解下来，然后用微操作器(日本 Narishige产品)轻轻吸取之，置于装有10 μl蒸馏水的离心管中，-20 ℃保存备用。
, 百拇医药
1.2.3 DNA提取及引物延伸预扩增(PEP)：将上述获得的细胞在95℃下热变性，随后进 行碱处理(200 mmol/L KOH/50 mmol/L 二硫代苏糖醇[3])65 ℃,2 min，再用中 和液进行中和。参照Ferdinand法[4]，向反应管中加入PEP反应物，其各物质终浓 度如下：400 μmol/L 15mer随机引物(加拿大Sangon公司生产)，0.01 g/L gelatin,10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 2 mmol/L MgCl2, 50 mmol/L KCl, 0.2 mmol/L dNTP, 5 I U Taq多聚酶。反应体积为50 μl。扩增程序为：92℃，1 min，37℃，2 min，37℃升至55 ℃(1℃/10 s)，55℃，4 min，共50个循环。取10 μl反应产物，进行下一步。
1.2.4 DYZ1靶序列的扩增：聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR): 参照Tak abayashi[5]法，引物选自人Y染色体长臂特异性重复序列DYZ1区的一部分，扩增片 段长度为149 bp。引物序列为 Y1.1: 5′-TCC ACT TTA TTC CAG GCC TGT CC-3′ Y1. 2: 5′-TTG AAT GGA ATG GGA ACG AAT GG-3′反应总体积50 μl，条件为: 94℃，30 s ，64 ℃，90 s，共40个循环，72 ℃，15 min。 取扩增产物10 μl，加溴酚蓝2 μl，混匀 ，点样于2%琼脂糖凝胶上，EB(溴化乙锭)电泳，100 V，30 min，紫外灯下观察结果，照相 记 录。每次扩增均以1例无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
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2 结果
2.1 母血中NRBC出现频率
45例孕妇中，有24例检出有NRBC，其余21例未检出。检出数量从4个/7 ml～20个/7 ml不等， 平均为8个/7 ml。另外5例正常未孕女性及5例正常男性的外周血中均未检出有NRBC。
2.2 PEP及PCR结果
将获取的24例单个NRBC行引物延伸预扩增(PEP)后，其中有20例出现有非特异性的扩增带 ，继续行聚合酶链反应(PCR)，结果有7例扩增出Y染色体的特异性片段，其余13例则未扩 增出。预测胎儿性别男胎符合率为7/10(70%)，女胎符合率为13/14(92.9%)，总符合率 为20/24(83.3%)。
2.3 PCR结果
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将21例获取的单个NRBC全部用于PCR，结果均未扩增出Y染色体的特异性片段。
3 讨论
3.1 母血中胎儿NRBC的富积和纯化
在孕妇外周血中，胎儿NRBC数量甚微，有研究结果表明胎/母细胞数目之比在1∶1×105～1 ∶ 1×107之间[6]，如何对这些少量的细胞进行富积和纯化是进行胎儿性别和遗传 性疾病诊 断的先决条件。目前，识别母血中胎儿细胞主要应用的是单克隆抗体识别技术，包括荧光激 活细胞分离法(FACS)和磁激活细胞分离法(MACS)，此类方法均具有快速、准确的特点，但仍 不可避免母血细胞的污染，因而限制了其应用范围。在本研究中，我们首先用Percoll富积N RBC，从形态学上识别NRBC，然后采用显微操作法在显微镜下获取单个NRBC。尽管 成人外周血中NRBC极为罕见，几乎可以认为若在母体中发现NRBC则必来自胎儿，但仍有作者 提出早孕期孕妇外周血中的NRBC可能由孕妇本身产生[7]。本研究发现经显微操作 法获取 的单个NRBC用PEP-PCR扩增法证实7例男性胎儿，另2例男胎因获取的单个NRBC在PEP过程中 没 有得到扩增产物，因而就无法再经PCR证实其性别。因此我们认为从形态学上对胎儿NRBC进 行识别，用显微操作法获取单个NRBC是纯化母血中胎儿遗传物质较准确而可行的方法。
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3.2 PEP-PCR扩增技术在单个NRBC基因诊断上的应用
引物延伸预扩增法(primer extension preamplification,PEP)[8]是一种通过随 机引物 将细胞克隆或单个细胞进行全基因组扩增，使模板DNA的含量达到足以被检测水平的较为有 效的方法。在此基础上再进行特异序列的扩增，聚合酶链反应即可完成对微量靶基因 的分析。这对用孕妇外周血中极少量的胎儿细胞进行产前 基因诊断是十分重要的，因为它更使得用一个样本来完成多个位点的基因分析成为可能。 本研究将A组获取的单个NRBC全部进行PEP-PCR扩增，除了4例在PEP过程中没有出现扩增产 物以外，其余的均得到了非特异性的扩增产物，在接下来的PCR过程中更是扩增出7例Y染色 体的特异片段，因而使NRBC的胎儿来源得到证实。这说明PEP-PCR法用于单个NRBC的基因 分析是可行的，尽管此法在应用过程中存在不稳定性，但其作为无创性产前遗传学诊断的方 法之一，无疑将有广泛的应用前景，以后的实践中，不断加以改进和完善。
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卫生部回国人员启动基金资助项目(卫科教交发[1996]第024号)和国家教委资助课 题(教外司留[1996]644号)
邹丽，女，1961年生，主任医师，副教授
参 考 文 献
1，Bianchi D W. Clinical trials and experience:Boston. Ann N Y Acad Sci ,1994, 731:92
2，Sekizawa A, Samura O, Zhen D K et al. Fetal cell recycling:diagn osis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retrieved from maternal blood . Am J Obstet Gynecol,1999, 181:1237
, 百拇医药
3，Cui K H, Haan E A, Wang L J et al. Optimal Polymerase chain reac tion amplification for preimplantation diagnosis in cystic fibrosis. BMJ,1995,311:53 6
4，Ferdinand von Eggeling, Susanne M, Michael G et al. Determinatio n of the origin of singl nucleated cells in maternal circulation by means of random PCR and a set of length polymorphisms. Hum Genet,1997,99:266
5，Takabayashi H, Kuwabara S, Ukita T et al.Development of noninvas ive fetal DNA diagnosis from maternal blood.Prenat Diagn,1995,15:74
, http://www.100md.com
6，Simpson J I, Simpson J L, Elias S. Isolating fetal cells in the mate rnal circulation. Hum Reprod,1995,4:409
7，Steele C D, Wapner R J, Smith J B et al. Prenatal diagnosis usin g fe tal cells isolated from maternal peripheral blood:A review. Clin Obstet Gynecol, 1996,39:801
8，Zhang L, Cui X F, Schmitt K et al. Whole genome amplification fr om a single cell: implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89: 5847
(2000-04-04 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属协和医院妇产科，武汉 430022
关键词：孕妇外周血；单个胎儿有核红细胞；引物延伸预扩增；性别测定
同济医科大学学报000421 摘要 为探讨母血中单个胎儿有核红细胞(NRBC)行产 前基因分析的可行性，对45名孕妇外周血行不 连续密度梯度离心，显微操作获取单个NRBC，A组24例进行引物延伸预扩增(PEP)，后行Y 染色体特异性DYZ1基因的聚合酶链反应(PCR)，B组21例直接进行Y染色体特异性DYZ1基因的P CR。 发现45名孕妇中有24名检出NRBC， A组中男胎符合率为70%，总符合率为83.3%，B组 则均未扩增到PCR产物。提示用母血中单个胎儿NRBC经PEP-PCR法行产前基因分析是可行的 。
中图法分类号 R730.43， R714.52
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Prenatal Genetic Analysis of Single Fetal Nuclea ted
Red Blood Cell from Maternal Blood
Zou Li Zhu Jianwen Xu Keshu et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xiehe Hospita l, Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract In oder to study the feasibility of prenatal genetic analysis of s ingle fetal nucleated red blood cell (NRBC) from maternal blood, peripheral bloo d from 45 pregnant women was subjected to discontinuous density gradient centrifugation to obtain single NRBC by using a micromanipulator. Primer extension preamplificati on (PEP) and polymerase chain reaction (PCR) of a Y-chromosome-specific rep eat sequence were performed in 24 patients (group A). Only PCR of a Y-chromosom e-specific repeat sequence was performed in the remaining 21 cases (group B). I t was found that NRBCs were detectable in 24 out of 45 pregnant women. In group A, male pregnancy was correctly predicted in 70 %. The overall agreement of the diagnosis was 83.3 %. In group B, the Y-specific DNA sequence was not amplifie d. It was suggested that the prenatal genetic analysis of single fetal NRBC by usi ng PEP-PCR method is feasible.
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Key words maternal peripheral blood; single fetal nucleated re d blood cell; sex identification; primer extension preamplification
从孕妇外周血中获取胎儿细胞为无创性产前诊断开辟了一条颇具前景的道路，其中胎儿有核 红细胞(NRBC)被公认为是可用于无创性产前诊断比较好的胎儿遗传物质来源[1，2] 。由于通常采用的分离技术如：荧光激活细胞分离技术(FACS)和磁激活细胞分离技术(M ACS)等，所得到的胎儿细胞并不能避免少量母血细胞的污染，因此努力使胎儿遗传物质得到 纯化对于无创性产前遗传学诊断是具有重大意义的。本研究通过采用显微操作法，尝试在单 个细胞水平对胎儿进行产前基因分析。
1 资料与方法
1.1 标本来源
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外周血采自1999年5月至12月,孕龄为11～30周、年龄21～30岁的妊娠妇女，共45例，无贫 血等合并症。每次采血7 ml，置于盛有EDTA抗凝剂的无菌试管中，生理盐水等倍稀释后备用 ；另外各选5名正常男性及5名无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 不连续密度梯度离心富集胎儿NRBC：所用分离介质为Pharmaci公司生产的Percoll细胞分离液。具体步骤为：用密度为1.085g/ml和1.075g/ml的Percoll细胞分离液在离心管中制成密度梯度，将7ml外周血用生理盐水等倍稀释后缓慢加入。4℃下以3000r/min离心30min，收集中层分离界面细胞，以生理盐水洗涤后，4℃保存备用。
1.2.2 显微操作法获取单个NRBC：将分离后的细胞制成涂片，用May-Giemsa复合染色法 染色，光学显微镜下识别NRBC并进行计数。在NRBC出现的相应范围内滴1～2滴2.5 g/L trypsin(胰蛋白酶)溶液，使之易于从玻片上松解下来，然后用微操作器(日本 Narishige产品)轻轻吸取之，置于装有10 μl蒸馏水的离心管中，-20 ℃保存备用。
, 百拇医药
1.2.3 DNA提取及引物延伸预扩增(PEP)：将上述获得的细胞在95℃下热变性，随后进 行碱处理(200 mmol/L KOH/50 mmol/L 二硫代苏糖醇[3])65 ℃,2 min，再用中 和液进行中和。参照Ferdinand法[4]，向反应管中加入PEP反应物，其各物质终浓 度如下：400 μmol/L 15mer随机引物(加拿大Sangon公司生产)，0.01 g/L gelatin,10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 2 mmol/L MgCl2, 50 mmol/L KCl, 0.2 mmol/L dNTP, 5 I U Taq多聚酶。反应体积为50 μl。扩增程序为：92℃，1 min，37℃，2 min，37℃升至55 ℃(1℃/10 s)，55℃，4 min，共50个循环。取10 μl反应产物，进行下一步。
1.2.4 DYZ1靶序列的扩增：聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR): 参照Tak abayashi[5]法，引物选自人Y染色体长臂特异性重复序列DYZ1区的一部分，扩增片 段长度为149 bp。引物序列为 Y1.1: 5′-TCC ACT TTA TTC CAG GCC TGT CC-3′ Y1. 2: 5′-TTG AAT GGA ATG GGA ACG AAT GG-3′反应总体积50 μl，条件为: 94℃，30 s ，64 ℃，90 s，共40个循环，72 ℃，15 min。 取扩增产物10 μl，加溴酚蓝2 μl，混匀 ，点样于2%琼脂糖凝胶上，EB(溴化乙锭)电泳，100 V，30 min，紫外灯下观察结果，照相 记 录。每次扩增均以1例无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
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2 结果
2.1 母血中NRBC出现频率
45例孕妇中，有24例检出有NRBC，其余21例未检出。检出数量从4个/7 ml～20个/7 ml不等， 平均为8个/7 ml。另外5例正常未孕女性及5例正常男性的外周血中均未检出有NRBC。
2.2 PEP及PCR结果
将获取的24例单个NRBC行引物延伸预扩增(PEP)后，其中有20例出现有非特异性的扩增带 ，继续行聚合酶链反应(PCR)，结果有7例扩增出Y染色体的特异性片段，其余13例则未扩 增出。预测胎儿性别男胎符合率为7/10(70%)，女胎符合率为13/14(92.9%)，总符合率 为20/24(83.3%)。
2.3 PCR结果
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将21例获取的单个NRBC全部用于PCR，结果均未扩增出Y染色体的特异性片段。
3 讨论
3.1 母血中胎儿NRBC的富积和纯化
在孕妇外周血中，胎儿NRBC数量甚微，有研究结果表明胎/母细胞数目之比在1∶1×105～1 ∶ 1×107之间[6]，如何对这些少量的细胞进行富积和纯化是进行胎儿性别和遗传 性疾病诊 断的先决条件。目前，识别母血中胎儿细胞主要应用的是单克隆抗体识别技术，包括荧光激 活细胞分离法(FACS)和磁激活细胞分离法(MACS)，此类方法均具有快速、准确的特点，但仍 不可避免母血细胞的污染，因而限制了其应用范围。在本研究中，我们首先用Percoll富积N RBC，从形态学上识别NRBC，然后采用显微操作法在显微镜下获取单个NRBC。尽管 成人外周血中NRBC极为罕见，几乎可以认为若在母体中发现NRBC则必来自胎儿，但仍有作者 提出早孕期孕妇外周血中的NRBC可能由孕妇本身产生[7]。本研究发现经显微操作 法获取 的单个NRBC用PEP-PCR扩增法证实7例男性胎儿，另2例男胎因获取的单个NRBC在PEP过程中 没 有得到扩增产物，因而就无法再经PCR证实其性别。因此我们认为从形态学上对胎儿NRBC进 行识别，用显微操作法获取单个NRBC是纯化母血中胎儿遗传物质较准确而可行的方法。
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3.2 PEP-PCR扩增技术在单个NRBC基因诊断上的应用
引物延伸预扩增法(primer extension preamplification,PEP)[8]是一种通过随 机引物 将细胞克隆或单个细胞进行全基因组扩增，使模板DNA的含量达到足以被检测水平的较为有 效的方法。在此基础上再进行特异序列的扩增，聚合酶链反应即可完成对微量靶基因 的分析。这对用孕妇外周血中极少量的胎儿细胞进行产前 基因诊断是十分重要的，因为它更使得用一个样本来完成多个位点的基因分析成为可能。 本研究将A组获取的单个NRBC全部进行PEP-PCR扩增，除了4例在PEP过程中没有出现扩增产 物以外，其余的均得到了非特异性的扩增产物，在接下来的PCR过程中更是扩增出7例Y染色 体的特异片段，因而使NRBC的胎儿来源得到证实。这说明PEP-PCR法用于单个NRBC的基因 分析是可行的，尽管此法在应用过程中存在不稳定性，但其作为无创性产前遗传学诊断的方 法之一，无疑将有广泛的应用前景，以后的实践中，不断加以改进和完善。
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卫生部回国人员启动基金资助项目(卫科教交发[1996]第024号)和国家教委资助课 题(教外司留[1996]644号)
邹丽，女，1961年生，主任医师，副教授
参 考 文 献
1，Bianchi D W. Clinical trials and experience:Boston. Ann N Y Acad Sci ,1994, 731:92
2，Sekizawa A, Samura O, Zhen D K et al. Fetal cell recycling:diagn osis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retrieved from maternal blood . Am J Obstet Gynecol,1999, 181:1237
, 百拇医药
3，Cui K H, Haan E A, Wang L J et al. Optimal Polymerase chain reac tion amplification for preimplantation diagnosis in cystic fibrosis. BMJ,1995,311:53 6
4，Ferdinand von Eggeling, Susanne M, Michael G et al. Determinatio n of the origin of singl nucleated cells in maternal circulation by means of random PCR and a set of length polymorphisms. Hum Genet,1997,99:266
5，Takabayashi H, Kuwabara S, Ukita T et al.Development of noninvas ive fetal DNA diagnosis from maternal blood.Prenat Diagn,1995,15:74
, http://www.100md.com
6，Simpson J I, Simpson J L, Elias S. Isolating fetal cells in the mate rnal circulation. Hum Reprod,1995,4:409
7，Steele C D, Wapner R J, Smith J B et al. Prenatal diagnosis usin g fe tal cells isolated from maternal peripheral blood:A review. Clin Obstet Gynecol, 1996,39:801
8，Zhang L, Cui X F, Schmitt K et al. Whole genome amplification fr om a single cell: implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89: 5847
(2000-04-04 收稿), http://www.100md.com