用紫外与可见光分光分析仪测定PASMC增殖的MTT比色法
作者：廖国宁 雷景迈 何善述
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：MTT比色法；细胞增殖
同济医科大学学报000408 摘要 为使MTT比色法得到更广泛的应用，对紫外与可 见光分光分析仪测定细胞增殖MTT比色法的实验条件进行了探索。结果发现：以5 mg/ml MTT 在0.1×104～2.4×104细胞范围内进行检测，可获得较好的线性检测结果(γ=0.987 2)。与酶标仪直接测定比较，具有灵敏度高、数据准确、检测范围广，值得推广应用。
中图法分类号 R446.61， R361.3
PASMC Proliferation Detected by MTT Co lorimetric Assay
, http://www.100md.com
with Ultraviolet and Visible Spectrophotometers
Liao Guoning Lei Jingmai He Shanshu
(Department of Biochemistry，School of Basic Medical Sc iences, Tongji Medical University，Wuhan 430030)
Abstract In order to apply MTT colorimetric assay widely，the e xperimental conditions detecting cellular proliferation by MTT colorimetric assa y with ultraviolet and visible spectrophotometers were explored. The results sho wed that good linearity results could be obtained at the range of 0.1×104 to 2.4×104 of cell number with 5 mg/ml MTT. This method is characterized by hig h sensitivity, data accuracy and wide range of cell number.
, http://www.100md.com
Key words MTT colorimetric assay； cellular proliferation
在细胞水平研究中，检测细胞增殖的常规方法有两种，即细胞计数法和同位素掺入法，这两 种方法或因操作繁琐，不够准确或因使用放射性同位素，易污染环境，因而在实际工作 中都有其局限性。1983年Mosmann首创用[3-(4，5-dimethylthiazolzyl)2，5-diphen yl tetrazolium bromide四甲基偶氮唑盐，MTT]经活细胞线粒体内脱氢酶催化还原产生甲
(formazan)的颜色反应检测细胞增殖[1] 。因 此法操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，现已用于生物医学的许多研究中 。为了使MTT比色法得到更广泛的应用，我们对原方法做了一些改进，并用U-2000型紫外与 可见光分光分析仪测定了肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
MTT购自Fluka公司；二甲基亚砜(dimethyle sulfoxide，DMSO)、无血清培养基(serum- free medium，SFM)等购自Sigma公司；紫外与可见光分光分析仪(HITACHI U-2000型，日 本)。
1.2 方法
将第三代PASMC稀释至不同密度，种于96孔板(150 μl /孔)培养24 h，弃去培养液，用PB S洗两次，每孔加入110 μl MTT反应液[含100 μl SFM +10 μl MTT(5 mg/ml)]37 ℃ 、5% CO2培养箱培养4 h，每孔吸取80 μl培养液，加入100 μl DMSO，转入EP管，用DMS O稀释至310 μl，立即在U-2000型紫外与可见光分光分析仪(570 nm下读取A值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 MTT甲溶 液可见光区扫描吸收光谱
甲吸收峰位于570 nm附近，而MTT的吸收峰在380 nm。并且残留的SFM、 MTT及DMSO对测定均无影响。故选择测定波长为570 nm。
2.2 检测范围
MTT甲是细胞能量代谢的反映，其生成量随细胞数的 增多而增加，由图1可见，细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与A值呈正相关，线性 良好，其相关系数r=0.9872 ，MTT10 μl (5 mg/ml)基本能准确灵敏地反映对数生长期细胞增殖的情况。 
, 百拇医药
图1 MTT比色法吸光度(A)与细胞数(104)的关系
2.3 温育时间对甲月 替生成的影响
A 值随温育时间增加而增高，实际测定时选取4 h，见图2。
图2 保温时间对甲生成的影 响
A. 1.5×104细胞 B. 0.5×104细胞
2.4 测定时间对稳定性的影响
由图3可见，2 h内测定对结果没有影响，2 h后测定结果偏高，提示测定最好在2 h内完成。
, 百拇医药
图3 测定时间对稳定性的影响
A. 1.5×104 细胞 B. 0.5×104细胞
3 讨论
MTT是一种淡黄色唑氮盐，是活细胞线粒体脱氢酶的底物，经酶催化还原为不溶于水的蓝紫 色甲(formazan)结晶，该物质溶解后，在560～610 nm中有一个较宽的最大吸收峰，用分 光分析仪可对其进行测量，其值与活细胞之间有良好的线性关系[2]。有关MTT比色 法的文 献报道很多，但实验方法各有差异，一般可用酶标仪直接检测，若无酶标仪，也可用可见光 分析仪进行检测。本实验对使用U-2000型紫外与可见光分光分析仪测定PASMC增殖的MTT比 色 法进行了探索，并得到如下实验条件：(1)测定时换成含MTT的SFM以排除杂蛋白的干扰； (2)测定波长为570 nm；(3)37℃、5% CO2条件，MTT温育4 h；(4)当温度较低时 (<20℃)，溶剂选用DMSO较好；(5)以5 mg/ml的MTT浓度在0.1×104 ～ 2.4×104 的细胞数范围内，可获得较好的线性检测结果，相关系数r=0.9872。与用酶标仪直接 测定比较，本法虽略显繁琐，但它具有细胞数范围广，灵敏度高、数据准确等优点，值得推 广应用。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No. 39270295)
廖国宁，男，1962年生，博士研究生
参 考 文 献
1，Mosmaan T. Colorimetric assay cellular growth and survival：Applicat ion to proliferation and cytotoxity assays. J Immunol Methods，1983，65：55
2，薛 彬，Edeman A，Thorbecke G J.介绍一种用颜色显示法测细胞的生长及增 殖.北京医科大学学报，1987，19(2)：125
(1999-04-20 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：MTT比色法；细胞增殖
同济医科大学学报000408 摘要 为使MTT比色法得到更广泛的应用，对紫外与可 见光分光分析仪测定细胞增殖MTT比色法的实验条件进行了探索。结果发现：以5 mg/ml MTT 在0.1×104～2.4×104细胞范围内进行检测，可获得较好的线性检测结果(γ=0.987 2)。与酶标仪直接测定比较，具有灵敏度高、数据准确、检测范围广，值得推广应用。
中图法分类号 R446.61， R361.3
PASMC Proliferation Detected by MTT Co lorimetric Assay
, http://www.100md.com
with Ultraviolet and Visible Spectrophotometers
Liao Guoning Lei Jingmai He Shanshu
(Department of Biochemistry，School of Basic Medical Sc iences, Tongji Medical University，Wuhan 430030)
Abstract In order to apply MTT colorimetric assay widely，the e xperimental conditions detecting cellular proliferation by MTT colorimetric assa y with ultraviolet and visible spectrophotometers were explored. The results sho wed that good linearity results could be obtained at the range of 0.1×104 to 2.4×104 of cell number with 5 mg/ml MTT. This method is characterized by hig h sensitivity, data accuracy and wide range of cell number.
, http://www.100md.com
Key words MTT colorimetric assay； cellular proliferation
在细胞水平研究中，检测细胞增殖的常规方法有两种，即细胞计数法和同位素掺入法，这两 种方法或因操作繁琐，不够准确或因使用放射性同位素，易污染环境，因而在实际工作 中都有其局限性。1983年Mosmann首创用[3-(4，5-dimethylthiazolzyl)2，5-diphen yl tetrazolium bromide四甲基偶氮唑盐，MTT]经活细胞线粒体内脱氢酶催化还原产生甲
(formazan)的颜色反应检测细胞增殖[1] 。因 此法操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，现已用于生物医学的许多研究中 。为了使MTT比色法得到更广泛的应用，我们对原方法做了一些改进，并用U-2000型紫外与 可见光分光分析仪测定了肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖。, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
MTT购自Fluka公司；二甲基亚砜(dimethyle sulfoxide，DMSO)、无血清培养基(serum- free medium，SFM)等购自Sigma公司；紫外与可见光分光分析仪(HITACHI U-2000型，日 本)。
1.2 方法
将第三代PASMC稀释至不同密度，种于96孔板(150 μl /孔)培养24 h，弃去培养液，用PB S洗两次，每孔加入110 μl MTT反应液[含100 μl SFM +10 μl MTT(5 mg/ml)]37 ℃ 、5% CO2培养箱培养4 h，每孔吸取80 μl培养液，加入100 μl DMSO，转入EP管，用DMS O稀释至310 μl，立即在U-2000型紫外与可见光分光分析仪(570 nm下读取A值。
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2 结果
2.1 MTT甲
溶 液可见光区扫描吸收光谱甲
吸收峰位于570 nm附近，而MTT的吸收峰在380 nm。并且残留的SFM、 MTT及DMSO对测定均无影响。故选择测定波长为570 nm。2.2 检测范围
MTT甲
是细胞能量代谢的反映，其生成量随细胞数的 增多而增加，由图1可见，细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与A值呈正相关，线性 良好，其相关系数r=0.9872 ，MTT10 μl (5 mg/ml)基本能准确灵敏地反映对数生长期细胞增殖的情况。 , 百拇医药
图1 MTT比色法吸光度(A)与细胞数(104)的关系
2.3 温育时间对甲月 替生成的影响
A 值随温育时间增加而增高，实际测定时选取4 h，见图2。
图2 保温时间对甲
生成的影 响A. 1.5×104细胞 B. 0.5×104细胞
2.4 测定时间对稳定性的影响
由图3可见，2 h内测定对结果没有影响，2 h后测定结果偏高，提示测定最好在2 h内完成。
, 百拇医药
图3 测定时间对稳定性的影响
A. 1.5×104 细胞 B. 0.5×104细胞
3 讨论
MTT是一种淡黄色唑氮盐，是活细胞线粒体脱氢酶的底物，经酶催化还原为不溶于水的蓝紫 色甲
(formazan)结晶，该物质溶解后，在560～610 nm中有一个较宽的最大吸收峰，用分 光分析仪可对其进行测量，其值与活细胞之间有良好的线性关系[2]。有关MTT比色 法的文 献报道很多，但实验方法各有差异，一般可用酶标仪直接检测，若无酶标仪，也可用可见光 分析仪进行检测。本实验对使用U-2000型紫外与可见光分光分析仪测定PASMC增殖的MTT比 色 法进行了探索，并得到如下实验条件：(1)测定时换成含MTT的SFM以排除杂蛋白的干扰； (2)测定波长为570 nm；(3)37℃、5% CO2条件，MTT温育4 h；(4)当温度较低时 (<20℃)，溶剂选用DMSO较好；(5)以5 mg/ml的MTT浓度在0.1×104 ～ 2.4×104 的细胞数范围内，可获得较好的线性检测结果，相关系数r=0.9872。与用酶标仪直接 测定比较，本法虽略显繁琐，但它具有细胞数范围广，灵敏度高、数据准确等优点，值得推 广应用。, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No. 39270295)
廖国宁，男，1962年生，博士研究生
参 考 文 献
1，Mosmaan T. Colorimetric assay cellular growth and survival：Applicat ion to proliferation and cytotoxity assays. J Immunol Methods，1983，65：55
2，薛 彬，Edeman A，Thorbecke G J.介绍一种用颜色显示法测细胞的生长及增 殖.北京医科大学学报，1987，19(2)：125
(1999-04-20 收稿), 百拇医药