分析电镜对实验性肝癌微量元素的定量研究
作者：郑美蓉 刘冰 张春明 周泽斌 阮幼冰 武忠弼
单位：同济医科大学实验中心超微病理学研究室， 武汉 430030
关键词：肝癌；微量元素；分析电镜
同济医科大学学报000406 摘要 探讨实验性肝癌中微量元素的变化及其与肝癌的关系。应用分析型电镜对实验性肝癌 组织进行微量元素Cu、 Zn、Fe原位定性和定量分析。结果表明：实验组肝癌组织微量元素C u、Zn、 Fe含量分别为(3.38±4.63)、 (2.11±2.76)和0，对照组为(6.86±15.08) 、(4.88±10.91)和(2.26±1.46), 两组相比差异有显著性意义。提示：微量元素的 变化与实验性肝癌的发生发展密切相关，分析电镜的应用为微量元素的分析测定及探讨微量 元素与肿瘤关系的研究开辟了一条新的途径。
中图法分类号 R735.7， Q581
, 百拇医药
Quantitative Analysis of Trace Elements in Experimental Hepatocarcinoma
by Electron Probe Microanalysis
Zheng Meirong， Liu Bing，Zhang Chunming et al
(Department of Ultrastructural Pathology，Research Cent er of Experimental Medicine，Tongji Medical University，Wuhan 430030)
Abstract To investigate the relationship between the change in trace elements and hepatocarcinoma in experimental hepatocarcinoma induced by di ethylnitrosamine, quantitation and quality of trace elements including Cu, Zn, F e were analyzed by electron probe microanalysis in murine experimental hepatocar cinoma. The results showed that the contents of trace elements Cu Zn and Fe in e xperimental hepatocarcinoma was significantly lower than that in the control gro up and normal liver tissue. It was suggested that trace elements were associat ed with genesis and development of hepatocarcinoma and electron probe microanaly sis might provide a new way to analyze trace elements and to study the relation ship between trace elements and tumor.
, 百拇医药
Key words hepatocarcinoma; trace elements; electron probe mic roanalysis
微量元素与恶性肿瘤的关系是当今引人注目的一个研究领域。研究表明：微量元素与肿瘤发 生、发展密切相关，微量元素既有致癌作用也有抗癌效应，同时微量元素的缺乏是恶性肿瘤 发生的条件因素，如肝癌发病与硒水平呈负相关[1]。为探讨实验性肝癌组织中微 量元素的变化规律，我们应用分析电镜对二乙基亚硝胺诱发大鼠实验性肝癌组织中微量元素 进行原位定性定量研究。
1 材料和方法
1.1 实验性肝癌动物模型建立
健康雄性SD大鼠55只，体重250～300 g，由同济医科大学实验动物学部提供。随机分为两组 ：实验组50只，对照组5只。实验组S D大鼠以70 mg/kg剂量的二乙基亚硝胺灌胃，每周1次，连续15周后停药，同时喂以正常饲 料，对照组SD大鼠仅以正常饲料喂养，20周处死动物。
, 百拇医药
1.2 组织处理
取新鲜的实验组肝癌组织及对照组正常肝组织分别用40 ml/L中性多聚甲醛及25 ml/L戊二 醛固定，分别作常规石蜡包埋，HE 染色和分析电镜测定。
1.3 分析电镜的主要仪器及基本过程
1.3.1 主要仪器：真空喷镀仪(HITACHIHUS-5GB);分析电镜：扫描电镜(HITACHIX-650);X射线能量分散谱仪(PHILIPSEDAX9100)。
1.3.2 基本过程:(1)实验性肝癌组织和对照组正常肝组织入25ml/L戊二醛固定2～4h;(2)0.1mol/LPB洗2～3次;(3)500、700、900ml/L酒精脱水各10min;(4)900、1000ml/L丙酮脱水各10min;(5)真空喷镀仪喷碳;(6)分析电镜测定。
, 百拇医药
1.3.3 统计学处理：所有测量参数用
±s表示，两组间的数据比较采用F检验。
2 结果
2.1 病理组织学观察
实验组雄性SD大鼠50只，10只发展成肝癌，大部分SD大鼠于诱癌中期死亡。
2.2 大体观察和光镜观察
石蜡包埋组织切成5mm厚的切片，苏木素伊红染色，光镜下观察，见表1。
2.3 微量元素Cu、Zn、Fe的含量
含量及原子百分比见表2。
, http://www.100md.com
表1 癌诱发不同时期肝脏的病理变化 癌诱发时期
大体观察
光镜观察
早 期(1～10 w)
表面光滑，红褐色，质软，表面及切面见粟米大小均匀一致的灰白色结节，稀散分布
脂肪变性，点状坏死轻度肝纤维化
中 期(11～17 w)
表面不光滑，红褐色，质中，表面及切面见米粒至直径1 cm大小灰白色结节，密集分布
肝硬化
晚 期(18～23 w)
, 百拇医药
表面不光滑，红褐及灰白色，表面及切面见米粒至3 .5 cm大小灰白色结节，密集分布，有 出血，坏死
肝癌，腺癌
表2 微量元素Cu、Zn、Fe的重量百分比(WT %)和原子百分比(AT %) 组别
例数
重量百分比(WT %)
原子百分比(AT %)
Cu
Zn
Fe
Cu
Zn
, 百拇医药
Fe
实验组
7
5.66±7.62*
4.33±5.87*
0
3.38±4.63*
2.11±2.76*
0
对照组
5
8.69±18.94
, 百拇医药
6.32±14.63
3.64±2.45
6.86± 15.08
4.88±10.91
2.26±1.46
与对照组比较 * P<0.053 讨论
人体内微量元素含量虽少，但它是机体正常生命活动必不可少的成分，反之，微量元素 缺乏或过量元素原位测定，结果显示：实验组微量元素Cu、Zn、Fe含量分别为(3.384.63) 、(2.112.76) 和0，对照组为(6.8615.08)、(4.8810.91) 和(2.261.46)， 两组相 比，实验组Cu、Zn含量明显下降，经统计学处理，差异有显著性意义。而微量元素Fe的测定 值为零，是 由于局部组织内含量少于分析电镜所能检测元素的最低浓度(0.1%)所致。微量元素Cu、Z n、Fe在实验性肝癌原位测定结果，体现了微量元素Cu、Zn与肝癌的发生及发展有关。
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微量元素Cu、Zn均是人体必需微量元素，分别储存于肝、网状内皮系统及细胞内部，对机体 代谢，酶的激活等方面发挥重要作用。许多研究表明：超氧化物歧化酶(Superoxide dismu tase，SOD)是一种金属酶，其活性表达依赖于微量元素Cu、Zn的存在，肝癌组织中Cu、Zn含 量及SOD活性表达均低于癌周“正常”肝组织或肝硬化组织，提示肝癌中SOD酶活性受到损伤 ，而低浓度的微量元素Cu、Zn导致了SOD活性表达差异[2] ，金属巯基组氨酸三甲 内盐是一 种低分子量蛋白质，其中富含金属和半胱氨酸，也是重金属离子如Cu、Zn的转运蛋白，电子 探针微区分析和免疫组织化学显示：微量元素Cu、Zn含量及金属巯基组氨酸三甲内盐在肝细 胞癌中均减少，且减少程度与肝癌组织学分化程度密切相关[3]：低浓度铜引起巯 基代谢改 变是通过减少巯基还原成分和增加同型半胱氨酸向间质释放而实现的[4]；肝癌细 胞的凋亡和瘤细胞的再分化与微量元素缺乏密切相关[5]。
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导致微量元素Cu、Zn含量降低的原因可能与二乙基亚硝胺的代谢及肿瘤本身基因改变有关。 由于DENA是一种前致癌物，进入机体后须经代谢活化后形成终致癌物，这种终致癌物为有活 性的亲电碳正离子，与靶细胞内生物大分子中富有电子的亲核基团如DNA、RNA或蛋白质结合 ，造成细胞遗传信息改变而致癌[6]；而肝脏又含有丰富的微粒体混合功能氧化酶 体系，在 进行DENA代谢活化过程中干扰正常Cu、Zn的代谢过程或由于致癌剂的作用导致肝癌基因改变 而影响微量元素Cu、Zn的含量，微量元素Cu、Zn 含量下降究系是肝癌发生、发展的原因还 是肝癌发生、发展中的具体体现则有待进一步探讨。
分析电镜对实验性肝癌微量元素Cu、Zn、Fe的原位定性定量测定结果，体现了微量元素Cu、 Zn变化与肝癌的发生、发展存在相关性；分析电镜的应用为微量元素的分析测定及微量元素 与肿瘤关系的研究开辟了一条新的途径。
郑美容，女，1962年生，医学硕士 ，现址：九江医学专科学校病理学教研室，九江332000
, 百拇医药
参考文献
1，顾公望, 张宏伟编著 微量元素与恶性肿瘤 上海:上海科学技术文献出版 社， 1993 1.3
2，Liao K Y, Lee P H, Wu F C et al. Zinc, copper and superoxide di smutase in hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol,1997,92:2260
3，TashiroItoh T, Ichida T, Matsuda Y et al. Metallothionein ex pression and concentrations of copper and zinc are associated with tumor differ entiation in hepatocellular carcinoma. Liver,1997,17:300
, 百拇医药
4，Hultberg B, Andersson A, Isaksson A. Alterations of thiol metabolis m in human cell lines induced by low amounts of copper, mercury of cadmium ions . Toxicology, 1998,126:203
5，Renault E, Sarrazin S, Deschatrette J. Evidence for interactions be tween rat hepatoma cell apoptosis and differentiation. Biochem Genet, 1998,36:1
6，毛文永编著. 环境污染与致癌. 北京：科学技术出版社，1981176～180
(1998-12-25收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学实验中心超微病理学研究室， 武汉 430030
关键词：肝癌；微量元素；分析电镜
同济医科大学学报000406 摘要 探讨实验性肝癌中微量元素的变化及其与肝癌的关系。应用分析型电镜对实验性肝癌 组织进行微量元素Cu、 Zn、Fe原位定性和定量分析。结果表明：实验组肝癌组织微量元素C u、Zn、 Fe含量分别为(3.38±4.63)、 (2.11±2.76)和0，对照组为(6.86±15.08) 、(4.88±10.91)和(2.26±1.46), 两组相比差异有显著性意义。提示：微量元素的 变化与实验性肝癌的发生发展密切相关，分析电镜的应用为微量元素的分析测定及探讨微量 元素与肿瘤关系的研究开辟了一条新的途径。
中图法分类号 R735.7， Q581
, 百拇医药
Quantitative Analysis of Trace Elements in Experimental Hepatocarcinoma
by Electron Probe Microanalysis
Zheng Meirong， Liu Bing，Zhang Chunming et al
(Department of Ultrastructural Pathology，Research Cent er of Experimental Medicine，Tongji Medical University，Wuhan 430030)
Abstract To investigate the relationship between the change in trace elements and hepatocarcinoma in experimental hepatocarcinoma induced by di ethylnitrosamine, quantitation and quality of trace elements including Cu, Zn, F e were analyzed by electron probe microanalysis in murine experimental hepatocar cinoma. The results showed that the contents of trace elements Cu Zn and Fe in e xperimental hepatocarcinoma was significantly lower than that in the control gro up and normal liver tissue. It was suggested that trace elements were associat ed with genesis and development of hepatocarcinoma and electron probe microanaly sis might provide a new way to analyze trace elements and to study the relation ship between trace elements and tumor.
, 百拇医药
Key words hepatocarcinoma; trace elements; electron probe mic roanalysis
微量元素与恶性肿瘤的关系是当今引人注目的一个研究领域。研究表明：微量元素与肿瘤发 生、发展密切相关，微量元素既有致癌作用也有抗癌效应，同时微量元素的缺乏是恶性肿瘤 发生的条件因素，如肝癌发病与硒水平呈负相关[1]。为探讨实验性肝癌组织中微 量元素的变化规律，我们应用分析电镜对二乙基亚硝胺诱发大鼠实验性肝癌组织中微量元素 进行原位定性定量研究。
1 材料和方法
1.1 实验性肝癌动物模型建立
健康雄性SD大鼠55只，体重250～300 g，由同济医科大学实验动物学部提供。随机分为两组 ：实验组50只，对照组5只。实验组S D大鼠以70 mg/kg剂量的二乙基亚硝胺灌胃，每周1次，连续15周后停药，同时喂以正常饲 料，对照组SD大鼠仅以正常饲料喂养，20周处死动物。
, 百拇医药
1.2 组织处理
取新鲜的实验组肝癌组织及对照组正常肝组织分别用40 ml/L中性多聚甲醛及25 ml/L戊二 醛固定，分别作常规石蜡包埋，HE 染色和分析电镜测定。
1.3 分析电镜的主要仪器及基本过程
1.3.1 主要仪器：真空喷镀仪(HITACHIHUS-5GB);分析电镜：扫描电镜(HITACHIX-650);X射线能量分散谱仪(PHILIPSEDAX9100)。
1.3.2 基本过程:(1)实验性肝癌组织和对照组正常肝组织入25ml/L戊二醛固定2～4h;(2)0.1mol/LPB洗2～3次;(3)500、700、900ml/L酒精脱水各10min;(4)900、1000ml/L丙酮脱水各10min;(5)真空喷镀仪喷碳;(6)分析电镜测定。
, 百拇医药
1.3.3 统计学处理：所有测量参数用
±s表示，两组间的数据比较采用F检验。2 结果
2.1 病理组织学观察
实验组雄性SD大鼠50只，10只发展成肝癌，大部分SD大鼠于诱癌中期死亡。
2.2 大体观察和光镜观察
石蜡包埋组织切成5mm厚的切片，苏木素伊红染色，光镜下观察，见表1。
2.3 微量元素Cu、Zn、Fe的含量
含量及原子百分比见表2。
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表1 癌诱发不同时期肝脏的病理变化 癌诱发时期
大体观察
光镜观察
早 期(1～10 w)
表面光滑，红褐色，质软，表面及切面见粟米大小均匀一致的灰白色结节，稀散分布
脂肪变性，点状坏死轻度肝纤维化
中 期(11～17 w)
表面不光滑，红褐色，质中，表面及切面见米粒至直径1 cm大小灰白色结节，密集分布
肝硬化
晚 期(18～23 w)
, 百拇医药
表面不光滑，红褐及灰白色，表面及切面见米粒至3 .5 cm大小灰白色结节，密集分布，有 出血，坏死
肝癌，腺癌
表2 微量元素Cu、Zn、Fe的重量百分比(WT %)和原子百分比(AT %) 组别
例数
重量百分比(WT %)
原子百分比(AT %)
Cu
Zn
Fe
Cu
Zn
, 百拇医药
Fe
实验组
7
5.66±7.62*
4.33±5.87*
0
3.38±4.63*
2.11±2.76*
0
对照组
5
8.69±18.94
, 百拇医药
6.32±14.63
3.64±2.45
6.86± 15.08
4.88±10.91
2.26±1.46
与对照组比较 * P<0.053 讨论
人体内微量元素含量虽少，但它是机体正常生命活动必不可少的成分，反之，微量元素 缺乏或过量元素原位测定，结果显示：实验组微量元素Cu、Zn、Fe含量分别为(3.384.63) 、(2.112.76) 和0，对照组为(6.8615.08)、(4.8810.91) 和(2.261.46)， 两组相 比，实验组Cu、Zn含量明显下降，经统计学处理，差异有显著性意义。而微量元素Fe的测定 值为零，是 由于局部组织内含量少于分析电镜所能检测元素的最低浓度(0.1%)所致。微量元素Cu、Z n、Fe在实验性肝癌原位测定结果，体现了微量元素Cu、Zn与肝癌的发生及发展有关。
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微量元素Cu、Zn均是人体必需微量元素，分别储存于肝、网状内皮系统及细胞内部，对机体 代谢，酶的激活等方面发挥重要作用。许多研究表明：超氧化物歧化酶(Superoxide dismu tase，SOD)是一种金属酶，其活性表达依赖于微量元素Cu、Zn的存在，肝癌组织中Cu、Zn含 量及SOD活性表达均低于癌周“正常”肝组织或肝硬化组织，提示肝癌中SOD酶活性受到损伤 ，而低浓度的微量元素Cu、Zn导致了SOD活性表达差异[2] ，金属巯基组氨酸三甲 内盐是一 种低分子量蛋白质，其中富含金属和半胱氨酸，也是重金属离子如Cu、Zn的转运蛋白，电子 探针微区分析和免疫组织化学显示：微量元素Cu、Zn含量及金属巯基组氨酸三甲内盐在肝细 胞癌中均减少，且减少程度与肝癌组织学分化程度密切相关[3]：低浓度铜引起巯 基代谢改 变是通过减少巯基还原成分和增加同型半胱氨酸向间质释放而实现的[4]；肝癌细 胞的凋亡和瘤细胞的再分化与微量元素缺乏密切相关[5]。
, http://www.100md.com
导致微量元素Cu、Zn含量降低的原因可能与二乙基亚硝胺的代谢及肿瘤本身基因改变有关。 由于DENA是一种前致癌物，进入机体后须经代谢活化后形成终致癌物，这种终致癌物为有活 性的亲电碳正离子，与靶细胞内生物大分子中富有电子的亲核基团如DNA、RNA或蛋白质结合 ，造成细胞遗传信息改变而致癌[6]；而肝脏又含有丰富的微粒体混合功能氧化酶 体系，在 进行DENA代谢活化过程中干扰正常Cu、Zn的代谢过程或由于致癌剂的作用导致肝癌基因改变 而影响微量元素Cu、Zn的含量，微量元素Cu、Zn 含量下降究系是肝癌发生、发展的原因还 是肝癌发生、发展中的具体体现则有待进一步探讨。
分析电镜对实验性肝癌微量元素Cu、Zn、Fe的原位定性定量测定结果，体现了微量元素Cu、 Zn变化与肝癌的发生、发展存在相关性；分析电镜的应用为微量元素的分析测定及微量元素 与肿瘤关系的研究开辟了一条新的途径。
郑美容，女，1962年生，医学硕士 ，现址：九江医学专科学校病理学教研室，九江332000
, 百拇医药
参考文献
1，顾公望, 张宏伟编著 微量元素与恶性肿瘤 上海:上海科学技术文献出版 社， 1993 1.3
2，Liao K Y, Lee P H, Wu F C et al. Zinc, copper and superoxide di smutase in hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol,1997,92:2260
3，TashiroItoh T, Ichida T, Matsuda Y et al. Metallothionein ex pression and concentrations of copper and zinc are associated with tumor differ entiation in hepatocellular carcinoma. Liver,1997,17:300
, 百拇医药
4，Hultberg B, Andersson A, Isaksson A. Alterations of thiol metabolis m in human cell lines induced by low amounts of copper, mercury of cadmium ions . Toxicology, 1998,126:203
5，Renault E, Sarrazin S, Deschatrette J. Evidence for interactions be tween rat hepatoma cell apoptosis and differentiation. Biochem Genet, 1998,36:1
6，毛文永编著. 环境污染与致癌. 北京：科学技术出版社，1981176～180
(1998-12-25收稿), 百拇医药