T细胞接种对NOD鼠糖尿病的预防作用
作者：阎彩凤 张志利 何国芬
单位：阎彩凤(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)；张志利(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)；何国芬(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)
关键词：T淋巴细胞；接种；糖尿病，胰岛素依赖型；小鼠
山西医科大学学报000408 摘要：目的 探讨T细胞接种(T CV)对I型糖尿病的预防作用。方法 4周龄未发病的雌性NO D鼠用18周龄新近发病的NOD鼠脾细胞制得的T细胞疫苗接种，检测TCV对NOD鼠糖尿病和胰岛 炎的影响。结果 TCV可以降低糖尿病发病率及血糖平均水平，减 轻胰岛单个核细胞的浸泡程度。结论 TCV可以诱导宿主产生 自身免疫低反应性。
中图分类号：R392.12 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1007-6611(2000)04-0308-02
NOD小鼠(nonobese diabetic mice)是人类I型糖尿病动物模型，一般情况 下，从 5周龄开始自身反应性淋巴细胞开始浸润胰岛，形成胰岛炎，胰岛炎出现6～10周后开始发 展成I型糖尿病。近十年来，T细胞接种技术(TCV)对人类多种以T细胞介导的自身免疫性 疾病如多发性硬化症(MS)，类风湿关节炎(RA)等的预防和治疗作用已有不少成功的报道 [1]。
本课题通过对人类I型糖尿病的动物模型NOD鼠[2]进行T细胞接种，探讨T细胞 接种对NOD鼠糖尿病的预防作用，以期对人类I型糖尿病高危人群进行一级预防提供科学的 实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雌性NOD小鼠，由澳大利亚WEHI医学研究中心馈赠，4周龄、18周龄，其 中18周龄NOD鼠为初发糖尿病鼠，用于T细胞疫苗的制备；4周龄NOD鼠16只，按每组8只随 机分组，用于糖尿病预防作用的研究。所有动物均在无病理条件下饲养，自由进食进水，每 周测定1次非空腹血糖(小鼠尾静脉剪尾取血，德国宝灵曼血糖仪测定血糖值)，连续2次 血糖浓度大于12 mmol/L，诊断为糖尿病。8个月时，自发性糖尿病的发生率雌鼠为50%～60 %，雄鼠为10%。
, 百拇医药
1.2 TCV制备及动物免疫 18周龄新近发病雌性NOD鼠，断颈处死，无菌取脾。 脾脏组织在无菌条件下制备单细胞悬液，用DMEM培养液(每
1 000 ml含 DM EM 10.00 g，L-谷氨酰胺0.30 g，青霉素、链霉素各10万U，用7%NaHCO3调pH至7.2)调 细胞浓度至(1～2)×106/ml,加ConA(Sigma公司产品)2.5 mg/L，IL-2( 上 海生化所生产)5U/ml，混匀后放入100 ml培养瓶中，10 ml/瓶，置体积分数为0.0 5的 CO2、37 ℃孵箱中培养48 h后收集细胞[3]。用0.4%台盼蓝测定细胞活力，细胞 活率>90%时证实为活细胞。以0.3%的戊二醛处理细胞15～20 min，沉淀细胞以 pH为7.2 PBS洗涤3次后调整细胞数到所需浓度。
处理组用18周龄新近发病的NOD鼠脾细胞制得的TCV免疫，以每只0.1 ml，含1.0×101 1个 T淋巴细胞的接种液腹腔注射免疫动物，每周免疫1次，共3次，同时对照组以PBS 0.2 ml腹腔 注射作为对照[1]。实验开始时，每日对实验动物进行尿糖检测，阳性者断尾取血 测血糖。
, 百拇医药
1.3 胰岛炎严重程度的判断 切下的胰腺组织立即用10%福尔马林液固定8～12 h，HE 染色观察胰岛炎，GAF染色观察胰岛β细胞，每只动物至少观察15个胰岛 ，胰岛炎的严重程度按以下标准判断：0分：胰岛完整，没有淋巴细胞浸润；1分： 单核细胞浸润胰岛的周边或<25%的胰岛面积受累；2分：25%～50%胰岛面积受 累；3分：>50%的胰岛面积受累。
1.4 统计方法 结果采用
±s表示，根据资料性质进行两个样本均数间t检 验及χ2检验。
2 结果
2.1 T细胞接种对NOD鼠血糖的影响 在首次T细胞接种后2，4，8，16，20， 24周分别检测两组血糖水平，结果见表1。除了首次T细胞接种2周外，其他各个时 间段，两组血糖水平比较均有明显差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 T细胞接种对NOD鼠糖尿病发病的影响 在首次T细胞接种后，第4周对 照组有1只血糖高于12 mmol/L为糖尿病，第8周、第12周时，对照组又各有2只发生糖尿病 ，第16周时对照组有1只、处理组有1只发生糖尿病，第24周观察结束时，对照组8只 鼠有7只发生糖尿病，其中2只血糖值为Hi(>33 mmol/L)，而处理组8只鼠只有2只发生糖 尿病。由表2可见，处理组与对照组相比，糖尿病发生率下降较明显(P<0.01)。
2.3 T细胞接种对NOD鼠胰岛炎的影响 第24周观察结束时，将实验动物断颈处 死，作胰腺病理切片，观察胰岛炎变化情况，如表3所示，对照组NOD鼠胰岛炎明 显，多数胰岛浸润面积在25%～50%之间，少数严重者有50%以上的胰岛面积受累， 胰岛细胞崩解，破坏。处理组小鼠胰岛大部分为完整的，没有单核细胞浸润或仅有 程度较轻的胰岛周围炎或少量胰岛内单核细胞浸润。
表1 T细胞接种对NOD鼠血糖的影响 (mmol/L)
, http://www.100md.com
2周
4周
8周
16周
20周
24周
对照组
7.0±1.2
6.2±1.0
5.8±0.8
7.6 ±1.2
8.0±1.0
8.8±0.8
, http://www.100md.com
处理组
7.6±1.1
10.0±0.9
10.6±1.1
11.1±1.3
11.3±1.2
11.7±1.0
t
1.403
10.627
12.349
, 百拇医药
9.432
6.182
5.346
单侧t检验：与对照组比较，P<0.05表2 2组糖尿病发病率比较 (例) 组别
发病鼠数
未 发病鼠数
合计
发病率(%)
处理组
2
6
8
, http://www.100md.com
25.0*
对照组
7
1
8
87.50
χ2=6.152，与对照组比较*P<0.01表3 2组胰岛炎积分比较
n
胰岛炎积分
处理组
8
12.12±1.02*
, http://www.100md.com
对照组
8
19.10±1.33
单侧t检验：t=13.132，与对照组比较*P<0.05
3 讨论
I型糖尿病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，活化的病理性自身反应性T细 胞对胰岛β细胞发生攻击，导致胰岛素分泌缺乏，发生糖尿病。已经发现的与其发 病有关的自身抗原有GAD65,HSP60，胰岛素(Ins)，羧基肽酶H及胰岛素分泌颗粒 蛋白等，但迄今为止，I型糖尿病的始动抗原(initiate antigen)还未阐明，因 而制备一种抗原特异性的自身反应性T细胞系或克隆作为T细胞疫苗接种还不成熟。 在本次实验中我们采用了Mor等在1990年提出的不用特异性抗原获取抗原特异性T细 胞的方法，及用低剂量ConA短期活化扩增具有自发性糖尿病倾向的NOD鼠脾细胞制 得T细胞疫苗免疫，这样既可以有效地活化已致敏的T细胞，同时又避免了对正常T细 胞的活化[3]。其机制可能是体内已被致敏的自身反应性T细胞在ConA刺 激下，可较快表达IL-2R，因而优先增生。活化的T细胞接种前经物理或化学方法使 其灭活。
, 百拇医药
T细胞接种的概念是基于克隆型调节网络而提出的[4]，疫苗T细胞通 过克隆型表位触发克隆型调节网络，诱导机体产生特异性的识别耙细胞克隆型表位 的抗克隆型T细胞[5]和非特异性的识别耙细胞TCR以外的细胞活化标记的 抗活化型T细胞[6]，上调机体的克隆型调节网络，抵制和清除相应的自 身反应性T细胞[7]，从而特异性地预防和治疗自身免疫病。
在本实验中我们发现，T细胞接种可以降低NOD鼠糖尿病发病率及血糖平均水平 ，减轻胰岛单核细胞浸润程度。I型糖尿病发病的具体机制还未阐明，但是活化的 自身反应性T细胞对胰岛β细胞的攻击，是其发病的主要原因。T细胞接种，上调了机体的克 隆型调节网络，恢复了效应细胞和调节细胞间的平衡状态，诱导宿主产生免疫低反应性，从 而降低了抗原特异性T细胞的致病性，使NOD鼠糖尿病发病延迟，发病率下降，胰岛浸润淋巴 细胞降低。
作者简介：阎彩凤，女，1970年2月生，硕士，住院医师.
, 百拇医药
参考文献：
[1]Zhang JW, Raus J. T-cell vaccination in autoimmune dis ease: From laboratory to clinic[J]. Human Immunol, 1993, 38 (2): 87～92.
[2]Su Sumu M,Kikuko K, Yoshihiro M,et al. Breeding of a n on-obese, diabetic strain of mice[J]. Exp Anim, 1980, 29 (1): 1～5.
[3]陈永良，何球藻.T细胞疫苗诱导同种移植物存活期延长[J].中国免 疫学杂志，1997, 13 (1): 40￣43.
[4]Ben Nun A, Wekerle H,Cohen IR.Vaccination against auto immune encephalomyelitis with T lymphocyte line cells reactive against myelin basic protein[J]. Nature, 1981, 292 (1): 60￣64.
, 百拇医药
[5]Cohen IR. Natural Id-anti-ID network and the immunolol gical homunculus. In:Atlan H, Cohen IR. Theories of immune networks[M] .Berlin:Springer Verlag, 1989. 6.
[6]Lohose AW, Mor F,Karin N,et al.Control of experimental autoimmune encephalomyelitis by T cells responding to activated T cell s[J]. Science, 1989, 244 (8): 820～826.
[7]Lider O,Rerhef T,Baraud E,et al.Anti-idiotypic network indu ced b y T cell vaccination against experimental auto immune encephalomyelitis[J]. Sc ience, 1988, 239 (2): 181～185.
收稿日期：2000-05-10, http://www.100md.com
单位：阎彩凤(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)；张志利(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)；何国芬(山西医科大学第一临床医学院 内分泌科，太原 030001)
关键词：T淋巴细胞；接种；糖尿病，胰岛素依赖型；小鼠
山西医科大学学报000408 摘要：目的 探讨T细胞接种(T CV)对I型糖尿病的预防作用。方法 4周龄未发病的雌性NO D鼠用18周龄新近发病的NOD鼠脾细胞制得的T细胞疫苗接种，检测TCV对NOD鼠糖尿病和胰岛 炎的影响。结果 TCV可以降低糖尿病发病率及血糖平均水平，减 轻胰岛单个核细胞的浸泡程度。结论 TCV可以诱导宿主产生 自身免疫低反应性。
中图分类号：R392.12 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1007-6611(2000)04-0308-02
NOD小鼠(nonobese diabetic mice)是人类I型糖尿病动物模型，一般情况 下，从 5周龄开始自身反应性淋巴细胞开始浸润胰岛，形成胰岛炎，胰岛炎出现6～10周后开始发 展成I型糖尿病。近十年来，T细胞接种技术(TCV)对人类多种以T细胞介导的自身免疫性 疾病如多发性硬化症(MS)，类风湿关节炎(RA)等的预防和治疗作用已有不少成功的报道 [1]。
本课题通过对人类I型糖尿病的动物模型NOD鼠[2]进行T细胞接种，探讨T细胞 接种对NOD鼠糖尿病的预防作用，以期对人类I型糖尿病高危人群进行一级预防提供科学的 实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雌性NOD小鼠，由澳大利亚WEHI医学研究中心馈赠，4周龄、18周龄，其 中18周龄NOD鼠为初发糖尿病鼠，用于T细胞疫苗的制备；4周龄NOD鼠16只，按每组8只随 机分组，用于糖尿病预防作用的研究。所有动物均在无病理条件下饲养，自由进食进水，每 周测定1次非空腹血糖(小鼠尾静脉剪尾取血，德国宝灵曼血糖仪测定血糖值)，连续2次 血糖浓度大于12 mmol/L，诊断为糖尿病。8个月时，自发性糖尿病的发生率雌鼠为50%～60 %，雄鼠为10%。
, 百拇医药
1.2 TCV制备及动物免疫 18周龄新近发病雌性NOD鼠，断颈处死，无菌取脾。 脾脏组织在无菌条件下制备单细胞悬液，用DMEM培养液(每
1 000 ml含 DM EM 10.00 g，L-谷氨酰胺0.30 g，青霉素、链霉素各10万U，用7%NaHCO3调pH至7.2)调 细胞浓度至(1～2)×106/ml,加ConA(Sigma公司产品)2.5 mg/L，IL-2( 上 海生化所生产)5U/ml，混匀后放入100 ml培养瓶中，10 ml/瓶，置体积分数为0.0 5的 CO2、37 ℃孵箱中培养48 h后收集细胞[3]。用0.4%台盼蓝测定细胞活力，细胞 活率>90%时证实为活细胞。以0.3%的戊二醛处理细胞15～20 min，沉淀细胞以 pH为7.2 PBS洗涤3次后调整细胞数到所需浓度。
处理组用18周龄新近发病的NOD鼠脾细胞制得的TCV免疫，以每只0.1 ml，含1.0×101 1个 T淋巴细胞的接种液腹腔注射免疫动物，每周免疫1次，共3次，同时对照组以PBS 0.2 ml腹腔 注射作为对照[1]。实验开始时，每日对实验动物进行尿糖检测，阳性者断尾取血 测血糖。
, 百拇医药
1.3 胰岛炎严重程度的判断 切下的胰腺组织立即用10%福尔马林液固定8～12 h，HE 染色观察胰岛炎，GAF染色观察胰岛β细胞，每只动物至少观察15个胰岛 ，胰岛炎的严重程度按以下标准判断：0分：胰岛完整，没有淋巴细胞浸润；1分： 单核细胞浸润胰岛的周边或<25%的胰岛面积受累；2分：25%～50%胰岛面积受 累；3分：>50%的胰岛面积受累。
1.4 统计方法 结果采用
±s表示，根据资料性质进行两个样本均数间t检 验及χ2检验。2 结果
2.1 T细胞接种对NOD鼠血糖的影响 在首次T细胞接种后2，4，8，16，20， 24周分别检测两组血糖水平，结果见表1。除了首次T细胞接种2周外，其他各个时 间段，两组血糖水平比较均有明显差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 T细胞接种对NOD鼠糖尿病发病的影响 在首次T细胞接种后，第4周对 照组有1只血糖高于12 mmol/L为糖尿病，第8周、第12周时，对照组又各有2只发生糖尿病 ，第16周时对照组有1只、处理组有1只发生糖尿病，第24周观察结束时，对照组8只 鼠有7只发生糖尿病，其中2只血糖值为Hi(>33 mmol/L)，而处理组8只鼠只有2只发生糖 尿病。由表2可见，处理组与对照组相比，糖尿病发生率下降较明显(P<0.01)。
2.3 T细胞接种对NOD鼠胰岛炎的影响 第24周观察结束时，将实验动物断颈处 死，作胰腺病理切片，观察胰岛炎变化情况，如表3所示，对照组NOD鼠胰岛炎明 显，多数胰岛浸润面积在25%～50%之间，少数严重者有50%以上的胰岛面积受累， 胰岛细胞崩解，破坏。处理组小鼠胰岛大部分为完整的，没有单核细胞浸润或仅有 程度较轻的胰岛周围炎或少量胰岛内单核细胞浸润。
表1 T细胞接种对NOD鼠血糖的影响 (mmol/L)
, http://www.100md.com
2周
4周
8周
16周
20周
24周
对照组
7.0±1.2
6.2±1.0
5.8±0.8
7.6 ±1.2
8.0±1.0
8.8±0.8
, http://www.100md.com
处理组
7.6±1.1
10.0±0.9
10.6±1.1
11.1±1.3
11.3±1.2
11.7±1.0
t
1.403
10.627
12.349
, 百拇医药
9.432
6.182
5.346
单侧t检验：与对照组比较，P<0.05表2 2组糖尿病发病率比较 (例) 组别
发病鼠数
未 发病鼠数
合计
发病率(%)
处理组
2
6
8
, http://www.100md.com
25.0*
对照组
7
1
8
87.50
χ2=6.152，与对照组比较*P<0.01表3 2组胰岛炎积分比较
n
胰岛炎积分
处理组
8
12.12±1.02*
, http://www.100md.com
对照组
8
19.10±1.33
单侧t检验：t=13.132，与对照组比较*P<0.05
3 讨论
I型糖尿病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，活化的病理性自身反应性T细 胞对胰岛β细胞发生攻击，导致胰岛素分泌缺乏，发生糖尿病。已经发现的与其发 病有关的自身抗原有GAD65,HSP60，胰岛素(Ins)，羧基肽酶H及胰岛素分泌颗粒 蛋白等，但迄今为止，I型糖尿病的始动抗原(initiate antigen)还未阐明，因 而制备一种抗原特异性的自身反应性T细胞系或克隆作为T细胞疫苗接种还不成熟。 在本次实验中我们采用了Mor等在1990年提出的不用特异性抗原获取抗原特异性T细 胞的方法，及用低剂量ConA短期活化扩增具有自发性糖尿病倾向的NOD鼠脾细胞制 得T细胞疫苗免疫，这样既可以有效地活化已致敏的T细胞，同时又避免了对正常T细 胞的活化[3]。其机制可能是体内已被致敏的自身反应性T细胞在ConA刺 激下，可较快表达IL-2R，因而优先增生。活化的T细胞接种前经物理或化学方法使 其灭活。
, 百拇医药
T细胞接种的概念是基于克隆型调节网络而提出的[4]，疫苗T细胞通 过克隆型表位触发克隆型调节网络，诱导机体产生特异性的识别耙细胞克隆型表位 的抗克隆型T细胞[5]和非特异性的识别耙细胞TCR以外的细胞活化标记的 抗活化型T细胞[6]，上调机体的克隆型调节网络，抵制和清除相应的自 身反应性T细胞[7]，从而特异性地预防和治疗自身免疫病。
在本实验中我们发现，T细胞接种可以降低NOD鼠糖尿病发病率及血糖平均水平 ，减轻胰岛单核细胞浸润程度。I型糖尿病发病的具体机制还未阐明，但是活化的 自身反应性T细胞对胰岛β细胞的攻击，是其发病的主要原因。T细胞接种，上调了机体的克 隆型调节网络，恢复了效应细胞和调节细胞间的平衡状态，诱导宿主产生免疫低反应性，从 而降低了抗原特异性T细胞的致病性，使NOD鼠糖尿病发病延迟，发病率下降，胰岛浸润淋巴 细胞降低。
作者简介：阎彩凤，女，1970年2月生，硕士，住院医师.
, 百拇医药
参考文献：
[1]Zhang JW, Raus J. T-cell vaccination in autoimmune dis ease: From laboratory to clinic[J]. Human Immunol, 1993, 38 (2): 87～92.
[2]Su Sumu M,Kikuko K, Yoshihiro M,et al. Breeding of a n on-obese, diabetic strain of mice[J]. Exp Anim, 1980, 29 (1): 1～5.
[3]陈永良，何球藻.T细胞疫苗诱导同种移植物存活期延长[J].中国免 疫学杂志，1997, 13 (1): 40￣43.
[4]Ben Nun A, Wekerle H,Cohen IR.Vaccination against auto immune encephalomyelitis with T lymphocyte line cells reactive against myelin basic protein[J]. Nature, 1981, 292 (1): 60￣64.
, 百拇医药
[5]Cohen IR. Natural Id-anti-ID network and the immunolol gical homunculus. In:Atlan H, Cohen IR. Theories of immune networks[M] .Berlin:Springer Verlag, 1989. 6.
[6]Lohose AW, Mor F,Karin N,et al.Control of experimental autoimmune encephalomyelitis by T cells responding to activated T cell s[J]. Science, 1989, 244 (8): 820～826.
[7]Lider O,Rerhef T,Baraud E,et al.Anti-idiotypic network indu ced b y T cell vaccination against experimental auto immune encephalomyelitis[J]. Sc ience, 1988, 239 (2): 181～185.
收稿日期：2000-05-10, http://www.100md.com