胎兔骨髓基质前成骨细胞的培养及鉴定
作者：张银刚 杨述华 罗怀灿 李进
单位：同济医科大学附属协和医院骨科，武汉 430022
关键词：胎兔；骨髓基质细胞；细胞，培养的
同济医科大学学报000418 摘要 为了证实体外培养的胎兔骨髓基质骨祖细胞具 有成骨细胞系特征。采用胎兔长管骨骨髓细胞，加入DMEM培养，传代四代后，用活体 相差显微镜、透射电镜、组织化学染色、免疫组化等方法进行观测。结果显示体外培养的基 质细胞具有成骨细胞系特征。提示胎兔骨髓基质骨祖细胞，可以作为修复骨缺损的种子细 胞。
中图法分类号 R329.2
Culture and Indentification of Osteogeni c Cells in Fetal Rabbit Bone Marrow
, 百拇医药
Zhang Yingang ang Shuhua Luo Huaican
(Department of Orthopaedics, Xiehe Hospital, Tongji Med ical University, Wuhan 430022)
Abstract In order to confirm the in vitro cultured fetal bone m arrow osteogenic cells having osteogenic features, fetal rabbit long bone marrow cells were cultured in DMEM medium. After four generations for passage, the ce lls were observed under transmission electron microscopy, stereoscopic microsco py, and by using histochemical and histoimmunogical methods. The results showed that the cultured stromal cells in vitro possessed the features of the osteogeni c cells, suggesting fetal rabbit bone marrow cells could be used to repair the b one defect.
, 百拇医药
Key words fetal rabbit; bone marrow stromal cell; culture
骨髓基质细胞的成骨作用已被更多的实验和临床证实[1,2]，在体外，对骨髓基质 细胞的成骨作用也得到了肯定[3]。目前，骨髓基质细胞已被作为组织工程化骨组 织中成骨细胞来源的选择。但骨髓基质细胞具有多分化潜能，且有多种成分[4]， 因此骨髓基质的前成骨细胞的纯度、数量还有待于进一步提高。胎儿在3个月前骨髓含有大 量成 骨系细胞，无造血系统细胞。随月份增大，成骨系细胞成分越来越少，造血细胞成份增多 [5]。本试验对胎兔骨髓基质细胞进行体外培养，并对成骨系特征进行鉴定。
1 材料和方法
1.1 骨髓单细胞悬液的获得
, 百拇医药 a.取同窝胎兔两只，由同济医科大学实验动物学部提供，放入150 ml/L酒精中消毒10 min 。
b.将胎兔放入超净工作台的培养器中，取弯剪刀及镊子各一把，剖开皮肤，取出四肢骨。
c.另取培养器一个，加入无血清培养基，将取出的四肢骨放入其中，取镊子及刀各一把， 刮除四肢骨中的软组织。
d.取培养器一个，加入血清培养基，用7号针头从中穿出，然后用DMEM反复冲洗，依次冲 完所有长管骨。
e.用4号针头反复冲洗，制成细胞悬液，吸入试管。
f.封闭试管口，放入台式离心机，1500 r/min，10 min。
g.弃上清，然后用带血清培养基溶解。
, 百拇医药
h.按1×105/ml分置培养瓶，内含3 ml DMEM培养液(Gibco公司提供，内含20%胎牛血清 ，Vit C 50 μg/ml，青霉素100 U/ml， 链霉素100 μg/ml)
1.2 细胞培养
将上述含细胞悬液的培养瓶，置37 ℃，5% CO2及饱和湿度下培养。3 d后首次换液，后隔 日换液，至7～14 d贴壁细胞融合成单层，用2.5 g/L胰酶消化后传代4次。
1.3 培养细胞鉴定
1.3.1活体相差显微镜观察：用倒置相差显微镜(Olympus Iiu7-2型)逐日观察细胞的 生长情况和形态学特征。
1.3.2 瑞氏-吉姆氏染色：将爬满细胞的玻片取出，4℃生理盐水冲洗，滴入瑞氏-吉姆 氏染液，观察细胞形态及细胞核情况。
, 百拇医药
1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色：将爬满细胞的盖玻片取出，4℃ 生理盐水冲洗，800 ml/L冷丙酮固定，采用钙钴法测定细胞碱性磷酸酶活性。
1.3.4 超薄切片透射电镜观察：将传代4次后的骨髓基质细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化脱 壁，制成细胞悬液，低速离心收集细胞，用20 ml/L戊二醛液固定后，按常规电镜方法制成 超薄切片，在日本产EM-100 CX型电镜下观察其超微结构。
1.3.5 成骨系细胞的免疫组化检测：采用SABC法检测Ⅰ型胶原，纤维连接素表达。Ⅰ抗 为鼠抗兔IgG单克隆抗体，按1∶30加在培养片上，37℃反应20 min后，加入SABC，37℃反应 1 h后，分别按1∶100，1∶160加入Ⅱ抗(生物素化羊抗鼠IgG)，37 ℃反应20 min，PBS洗 两次，DAB染色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察并拍照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 骨髓基质细胞体外培养的形态学特点
倒置相差显微镜下，骨髓基质细胞接种后4 h开始贴壁，24 h大量细胞贴壁并伸展开 ，24～72 h见贴壁细胞明显增大并且分裂增殖，部分区域形成小细胞集落，数个至数十个 细胞不等，短或长梭形外观，部分细胞呈三角形或多角形。3 d后首次换液，可见大小不等 的集落(图1)，隔日换液，贴壁细胞体积增大，梭形或多角形，粗大突起，核居中，1 ～3个核仁。5～8 d细胞融合成单层。将细胞传代，4代后细胞多呈多角形，1～3个核仁。
瑞氏-吉姆氏染色显示细胞梭形、多角形、呈同心圆状排列。胞浆呈淡红色，核深染( 图2)。
透射电镜显示，传代4次后细胞表面有微绒毛，轻度扩展的粗面内质网，胞质内有大量 核糖体和较多的线粒体，胞内无大量溶酶体，细胞间无连接，呈成骨系细胞特征[6] (图3)。
, 百拇医药
2.2 碱性磷酸酶染色结果
传代4次后，钙钴法染色显示细胞呈多角形或梭形，胞浆内有大量黑色沉淀(图4)。
2.3 免疫组化检测结果
细胞传代4次后，Ⅰ型胶原，纤维连接素在细胞内有表达，表现为胞浆呈棕褐色。
3 讨论
组织工程方法应用于临床已成为骨缺损修复的趋势所在。组织工程中的种子细胞来源于 骨、骨外膜、骨髓、骨髓组织[7]，其中，骨髓有取材方便，损伤小，植入机体后 能适应受区的环境并保持成骨活性等优点。临床上用骨髓治疗骨缺损，骨不连已取得良好效 果。但骨髓基质有多种成分，多种潜能。体外培养的骨髓基质的前成骨细胞纯度，数量还需 提高。
传统的方法在培养基中加入地塞米松、生长因子等刺激因素[6]，但地塞米松 可以诱导向成骨系转化，但抑制细胞的分裂，增殖[8]，因而限制提供大量的种子 细胞。本试验所用培养基中没有加入地塞米松，生长因子。细胞分裂的速度较快，形态学和 免疫组化结果显示细胞具成骨系特征。特别在细胞培养过程中，逐渐为多角形细胞，而多角 形细胞 可产生钙化基质[9]。
, 百拇医药
胎体的免疫性甚低，临床上常用胎儿的骨髓干细胞治疗再生障碍性贫血。胎体的骨髓基 质细胞生长繁殖快，传代久，对生长因子反应能力强等优点，克服了其他种子细胞体外传代 几次后，生长繁殖减慢等缺点，是组织工程中较好的种子细胞的选择
图1 3d首次换液情况.细胞呈梭形和多角形,呈大小不等集落×100
图2 瑞氏-吉姆氏染色.细胞呈多角形梭形,核深染×400
图3 透射电镜.细胞表面有微绒毛,胞质内有较多的核糖和线粒体×1600
, 百拇医药
图4 I型胎兔免疫组化(SABC法)显色.胞质呈棕褐色,表示有I型胶原表达×100
湖北省自然科学基金资助项目 (No. 99J230)
张银刚， 男，1971年生，硕士研究生
参 考 文 献
1，Friedenstein A J. Ostengenic stem cells in the bone marrow inheersch e. JWM & Kanis JA ed. Bone and mineral Reserch. Vol.7. Amsterdam: Elserier, 19 90. 243
2，Conolly J F, Cwse R, Tiedeman J et al. Autologous marrow ingecti on as a substitute for oprative grafting of tibial nonunions. Clin Orthop, 1991, 226 ：259
, http://www.100md.com
3，Lennon D P, Haynesworth S E,Young K G et al. A chemically define d me dium supports in vitro proliferation and matains the osteochondral potential of rat marrow derived mesenchymal stem cells. Exp Cell Res, 1995,219:211
4，Beresforal J N,Bennett J H, Devlin C et al. Evidence for an inve rse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures.Clin Orthop, 1989,240:270
, http://www.100md.com 5，王风计. 血液细胞学、附彩色图谱. 天津:天津科学技术出版社，1990.115～1 26
6，Maniatopoulous C, Sodek J, Melcher A H. Bone formation in vitro by s tromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 198 8，254:314
7，魏宽海. 组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择. 国外医学创伤与外科基 本问题分册,1998，19(3)：155
8，Herbertson A, Anbin J E. Dexamethasone alters the subpopulation make -up of rat bone marrow stromal cell cultures. J Bone Minr Res, 1995,10:255[ ZK)
9，Iwamoto M, shibano K, watanabe J. Culture of marrow stromal cells de rived from bone marrow specimens formed at frasture site of human long bone. Bon e, 1993,14:799
(1999-10-26 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院骨科，武汉 430022
关键词：胎兔；骨髓基质细胞；细胞，培养的
同济医科大学学报000418 摘要 为了证实体外培养的胎兔骨髓基质骨祖细胞具 有成骨细胞系特征。采用胎兔长管骨骨髓细胞，加入DMEM培养，传代四代后，用活体 相差显微镜、透射电镜、组织化学染色、免疫组化等方法进行观测。结果显示体外培养的基 质细胞具有成骨细胞系特征。提示胎兔骨髓基质骨祖细胞，可以作为修复骨缺损的种子细 胞。
中图法分类号 R329.2
Culture and Indentification of Osteogeni c Cells in Fetal Rabbit Bone Marrow
, 百拇医药
Zhang Yingang ang Shuhua Luo Huaican
(Department of Orthopaedics, Xiehe Hospital, Tongji Med ical University, Wuhan 430022)
Abstract In order to confirm the in vitro cultured fetal bone m arrow osteogenic cells having osteogenic features, fetal rabbit long bone marrow cells were cultured in DMEM medium. After four generations for passage, the ce lls were observed under transmission electron microscopy, stereoscopic microsco py, and by using histochemical and histoimmunogical methods. The results showed that the cultured stromal cells in vitro possessed the features of the osteogeni c cells, suggesting fetal rabbit bone marrow cells could be used to repair the b one defect.
, 百拇医药
Key words fetal rabbit; bone marrow stromal cell; culture
骨髓基质细胞的成骨作用已被更多的实验和临床证实[1,2]，在体外，对骨髓基质 细胞的成骨作用也得到了肯定[3]。目前，骨髓基质细胞已被作为组织工程化骨组 织中成骨细胞来源的选择。但骨髓基质细胞具有多分化潜能，且有多种成分[4]， 因此骨髓基质的前成骨细胞的纯度、数量还有待于进一步提高。胎儿在3个月前骨髓含有大 量成 骨系细胞，无造血系统细胞。随月份增大，成骨系细胞成分越来越少，造血细胞成份增多 [5]。本试验对胎兔骨髓基质细胞进行体外培养，并对成骨系特征进行鉴定。
1 材料和方法
1.1 骨髓单细胞悬液的获得
, 百拇医药 a.取同窝胎兔两只，由同济医科大学实验动物学部提供，放入150 ml/L酒精中消毒10 min 。
b.将胎兔放入超净工作台的培养器中，取弯剪刀及镊子各一把，剖开皮肤，取出四肢骨。
c.另取培养器一个，加入无血清培养基，将取出的四肢骨放入其中，取镊子及刀各一把， 刮除四肢骨中的软组织。
d.取培养器一个，加入血清培养基，用7号针头从中穿出，然后用DMEM反复冲洗，依次冲 完所有长管骨。
e.用4号针头反复冲洗，制成细胞悬液，吸入试管。
f.封闭试管口，放入台式离心机，1500 r/min，10 min。
g.弃上清，然后用带血清培养基溶解。
, 百拇医药
h.按1×105/ml分置培养瓶，内含3 ml DMEM培养液(Gibco公司提供，内含20%胎牛血清 ，Vit C 50 μg/ml，青霉素100 U/ml， 链霉素100 μg/ml)
1.2 细胞培养
将上述含细胞悬液的培养瓶，置37 ℃，5% CO2及饱和湿度下培养。3 d后首次换液，后隔 日换液，至7～14 d贴壁细胞融合成单层，用2.5 g/L胰酶消化后传代4次。
1.3 培养细胞鉴定
1.3.1活体相差显微镜观察：用倒置相差显微镜(Olympus Iiu7-2型)逐日观察细胞的 生长情况和形态学特征。
1.3.2 瑞氏-吉姆氏染色：将爬满细胞的玻片取出，4℃生理盐水冲洗，滴入瑞氏-吉姆 氏染液，观察细胞形态及细胞核情况。
, 百拇医药
1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色：将爬满细胞的盖玻片取出，4℃ 生理盐水冲洗，800 ml/L冷丙酮固定，采用钙钴法测定细胞碱性磷酸酶活性。
1.3.4 超薄切片透射电镜观察：将传代4次后的骨髓基质细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化脱 壁，制成细胞悬液，低速离心收集细胞，用20 ml/L戊二醛液固定后，按常规电镜方法制成 超薄切片，在日本产EM-100 CX型电镜下观察其超微结构。
1.3.5 成骨系细胞的免疫组化检测：采用SABC法检测Ⅰ型胶原，纤维连接素表达。Ⅰ抗 为鼠抗兔IgG单克隆抗体，按1∶30加在培养片上，37℃反应20 min后，加入SABC，37℃反应 1 h后，分别按1∶100，1∶160加入Ⅱ抗(生物素化羊抗鼠IgG)，37 ℃反应20 min，PBS洗 两次，DAB染色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察并拍照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 骨髓基质细胞体外培养的形态学特点
倒置相差显微镜下，骨髓基质细胞接种后4 h开始贴壁，24 h大量细胞贴壁并伸展开 ，24～72 h见贴壁细胞明显增大并且分裂增殖，部分区域形成小细胞集落，数个至数十个 细胞不等，短或长梭形外观，部分细胞呈三角形或多角形。3 d后首次换液，可见大小不等 的集落(图1)，隔日换液，贴壁细胞体积增大，梭形或多角形，粗大突起，核居中，1 ～3个核仁。5～8 d细胞融合成单层。将细胞传代，4代后细胞多呈多角形，1～3个核仁。
瑞氏-吉姆氏染色显示细胞梭形、多角形、呈同心圆状排列。胞浆呈淡红色，核深染( 图2)。
透射电镜显示，传代4次后细胞表面有微绒毛，轻度扩展的粗面内质网，胞质内有大量 核糖体和较多的线粒体，胞内无大量溶酶体，细胞间无连接，呈成骨系细胞特征[6] (图3)。
, 百拇医药
2.2 碱性磷酸酶染色结果
传代4次后，钙钴法染色显示细胞呈多角形或梭形，胞浆内有大量黑色沉淀(图4)。
2.3 免疫组化检测结果
细胞传代4次后，Ⅰ型胶原，纤维连接素在细胞内有表达，表现为胞浆呈棕褐色。
3 讨论
组织工程方法应用于临床已成为骨缺损修复的趋势所在。组织工程中的种子细胞来源于 骨、骨外膜、骨髓、骨髓组织[7]，其中，骨髓有取材方便，损伤小，植入机体后 能适应受区的环境并保持成骨活性等优点。临床上用骨髓治疗骨缺损，骨不连已取得良好效 果。但骨髓基质有多种成分，多种潜能。体外培养的骨髓基质的前成骨细胞纯度，数量还需 提高。
传统的方法在培养基中加入地塞米松、生长因子等刺激因素[6]，但地塞米松 可以诱导向成骨系转化，但抑制细胞的分裂，增殖[8]，因而限制提供大量的种子 细胞。本试验所用培养基中没有加入地塞米松，生长因子。细胞分裂的速度较快，形态学和 免疫组化结果显示细胞具成骨系特征。特别在细胞培养过程中，逐渐为多角形细胞，而多角 形细胞 可产生钙化基质[9]。
, 百拇医药
胎体的免疫性甚低，临床上常用胎儿的骨髓干细胞治疗再生障碍性贫血。胎体的骨髓基 质细胞生长繁殖快，传代久，对生长因子反应能力强等优点，克服了其他种子细胞体外传代 几次后，生长繁殖减慢等缺点，是组织工程中较好的种子细胞的选择
图1 3d首次换液情况.细胞呈梭形和多角形,呈大小不等集落×100
图2 瑞氏-吉姆氏染色.细胞呈多角形梭形,核深染×400
图3 透射电镜.细胞表面有微绒毛,胞质内有较多的核糖和线粒体×1600
, 百拇医药
图4 I型胎兔免疫组化(SABC法)显色.胞质呈棕褐色,表示有I型胶原表达×100
湖北省自然科学基金资助项目 (No. 99J230)
张银刚， 男，1971年生，硕士研究生
参 考 文 献
1，Friedenstein A J. Ostengenic stem cells in the bone marrow inheersch e. JWM & Kanis JA ed. Bone and mineral Reserch. Vol.7. Amsterdam: Elserier, 19 90. 243
2，Conolly J F, Cwse R, Tiedeman J et al. Autologous marrow ingecti on as a substitute for oprative grafting of tibial nonunions. Clin Orthop, 1991, 226 ：259
, http://www.100md.com
3，Lennon D P, Haynesworth S E,Young K G et al. A chemically define d me dium supports in vitro proliferation and matains the osteochondral potential of rat marrow derived mesenchymal stem cells. Exp Cell Res, 1995,219:211
4，Beresforal J N,Bennett J H, Devlin C et al. Evidence for an inve rse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures.Clin Orthop, 1989,240:270
, http://www.100md.com 5，王风计. 血液细胞学、附彩色图谱. 天津:天津科学技术出版社，1990.115～1 26
6，Maniatopoulous C, Sodek J, Melcher A H. Bone formation in vitro by s tromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 198 8，254:314
7，魏宽海. 组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择. 国外医学创伤与外科基 本问题分册,1998，19(3)：155
8，Herbertson A, Anbin J E. Dexamethasone alters the subpopulation make -up of rat bone marrow stromal cell cultures. J Bone Minr Res, 1995,10:255[ ZK)
9，Iwamoto M, shibano K, watanabe J. Culture of marrow stromal cells de rived from bone marrow specimens formed at frasture site of human long bone. Bon e, 1993,14:799
(1999-10-26 收稿), 百拇医药