酮替芬对新生大鼠心肌细胞内游离钙的影响
作者：丁强 汤允昭
单位：丁强(山西医科大学研究生部，太原 030001)；汤允昭(山西医科大学药理教研室)
关键词：酮替芬；心肌；钙通道阻滞药；大鼠
山西医科大学学报000405 摘要：观察了酮替芬(Ket)对新生鼠心肌细胞内游离钙的影 响，以酶法制备新生大鼠心肌细胞悬液，用荧光探针Fura-2/AM检测心肌细胞内游离钙浓度 的变化。结果表明：Ket对静息状态下[Ca2+]i无影响，Ket(10～500 μmol/L)剂 量依赖性抑制高钾去极化及NE所致的[Ca2+]i升高。提示：Ket对心肌细胞膜上电 压依赖性钙通道有抑制作用，也可能抑制受体操纵型钙通道。
中图分类号：R362 R972+.9 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1007-6611(2000)04-0300-04
Effect of ketotifen on the free calcium in neonatal rat myocard ial cells
DING Qiang TANG Yun-zhao
(Dept.of Postgraduate,Shanxi Medical U niversity Taiyuan, 030001,China)
Abstract:The effect of ketotifen (Ket) on in tr acellular free calcium concentration([Ca2+]i) was examined in freshly isolated myocardial cells prepared from neonatal rats using the [Ca2+] i-sensitive fluorescence indicator Fura-2/AM. Ket had no effect on resting [Ca 2+]i whereas Ket(10～500 μmol/L) concentration-dependently inhibited[ C a2+]i elevation induced by high extracellular potassium and NE. These r esults suggest that Ket inhibits [Ca2+]i influx through voltage-depend e nt calcium channels and maybe through receptor-operated calcium channels in myoc ardial cells.
, 百拇医药
Key words:ketotifen;myocardium;calcium cha nnel blockers;rats
酮替芬(Ket)为一抗变态反应药物[1] ，有很强的组胺H1-受体拮抗作用和抑制过敏介质释放的作用，有研究显示[2] ：Ket能抑制中性粒细胞的活化，抑制中性粒细胞内游离钙的升高，本实验目的在于观察Ket 对新生鼠心肌细胞游离钙的影响。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 Fure-2/AM为中国医学科学院药物研究所产品，用二甲基亚砜(DMSO)溶解为 1 mmol/L贮备液，酮替芬(Ket)，上海医科大学制药厂产品，批号950502；维拉帕米(Ver)， 德国Knoll产品；乙二醇双四乙酸(EGTA)，Fluka产品；HEPES，德国E.Merck产品，批号为61 8 k1711910;Triton X-100,Serva公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，上海丽珠东风生物技术有限 公司产品；胰蛋白酶，Sigma产品；DMEM培养基，美国GIBC实验室提供；其余试剂均为市售 分析纯。
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1.2 溶液配制 Hank液(μmol/L)：NaCl 137，CaCl2 1.3，KCl 5.0,MgSO4.7H2O 0.8，Na2HPO4 0.6，KH2PO4 0.4，NaHCO3 3.0，glucose 5.6，HEPES 20，用 去离子水配 制，用前调pH到7.4。无Ca2+Mg2+Hank液：去除CaCl2及MgSO4的Hank液 。 DMEM培养基配制：取小包装一袋，用1 L去离子水将其溶解后，加入0.2%BSA，调pH=7.2 。 0.25%胰蛋白酶液：用无Ca2+Mg2+Hank液配制，调pH到7.0。其余试剂均用去 离子水配成所需浓度。
1.3 细胞悬液制备[3，4] 取新生1～3 d Wistar大鼠，取出心脏，立即用冰冷 的Hank液洗去心内残血，去除心房及大血管，剪碎后置于一定量的0.25%的胰蛋白酶中，于 37 ℃恒温摇床中消化4～5次，将第2～5次的上清中的细胞收集在一起，过200目(95 μm)筛 网 ， 滤液再以Hank液洗涤2次；最后用DMEM培养基(含0.2%BSA)制成细胞悬液，0.4%台盼蓝排 斥试验检查，细胞成活率达95%以上，即可进行Fura-2负载。
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1.4 Fura-2负载 细胞悬液37 ℃预温5 min，加Fura-2/AM(终浓度4 μmol/L)为负载组。 37 ℃恒温振荡(35 r/min)30 min后，用含0.2%BSA的温Hank液洗涤，调细胞悬液浓度为1× 10 6～2×106个/ml,冰浴避光放置，在30 min内测定。
1.5 荧光测定[5] 荧光测定采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计。测 定条件：激发光(Ex)光栅为5.0 nm，发射光(Em)光栅为10 nm，固定Em波长为λ 500 n m，峰值在340 nm；然后固定Ex为峰值，从400～600 nm扫描发射光谱，找到峰值，固定E m在峰值。设定Ex的两个波长分别为340 nm，380 nm，作交替波长时间扫描，观察 不同条件下细胞内钙 离子浓 度的改变。机器按照下列公式自动由电脑输出[Ca2+]i浓度值(单位：nmol/L)。
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式中：Kd 为Fura-2与Ca2+反应的解离常数224 nmol/L，R、Rmax、R min分 别为测得的340 nm与380 nm的荧光比值，最大荧光比值和最小荧光比值，Sf2, Sb2分别为零Ca2+和饱和Ca2+时λ 380 nm激发光所产生的荧光强度。
1.6 实验分组设计
1.6.1 静息状态下脑细胞内[Ca2+]i测定 在细胞外1.3 mmol/L条件下测定。
1.6.2 不同外钙条件下[Ca2+]i变化 在细胞外钙浓度为0，0.01，0.1，1 .0(mmol/L)条件下测定，在细胞悬液制备及Fura-2负载过程中均用无Ca2+Hank液代 替Hank液，测定前加入不同浓度的CaCl2于细胞悬液中，使终浓度为0，0.01，0.1，1.0(mmol/L)。
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1.6.3 观察药物对不同外钙条件下[Ca2+]i变化的影响 预先以一定浓度的Ke t(500 μmol/L)与细胞悬液温孵5 min后测定。
1.6.4 观察不同激动剂对静息[Ca2+]i的影响 在细胞外钙1.3 mmol/L条件下 ，向细胞悬液中加入不同浓度的KCl溶液和NE使KCl终浓度分别为25，50，75 mmol/L;NE浓 度为5，10，15 μmol/L，观察[Ca2+]i的变化。
1.6.5 观察药物对不同激动剂所引起的[Ca2+]i变化的影响 预先以Ket(10～ 500 μmol/L)或对照药维拉帕米(Ver，10 μmol/L)与细胞悬液孵育5 min后，分别加入KCl 和NE观察[Ca2+]i变化。
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1.7 统计方法 结果以均数±标准差(
±s)表示，两样本均数比较用组间t 检验(方差 不齐者用t′检验)；多组样本均数比较用方差分析；用直线回归分析法计算IC50(药物 剂量作对数变换，百分数作概率单位交换)。
2 结果
2.1 Ket对心肌细胞内游离钙浓度影响
2.1.1 Ket对心肌细胞静息[Ca2+]i的影响( 见表1) 当Hank液中Ca2+浓度为 0时，心肌细胞内静息[Ca2+]i为(32.5±7.1) nmol/L，当细胞外Ca2+浓 度为0.01，0.1，1.0，1.3 mmol/L时，细胞内静息Ca2+浓度随着胞外Ca2+ 浓度呈依赖性升高，分别为(41.6±7.7)、(54.0±8.6)、(83.2±8.4)、(98.5±8. 5) nmol/L (n=5)，加入Ket 500 μmol/L温孵5 min，对上述变化无明显影响〔(40. 1±6.9),(52.8±7.4),(96.4±9.0) mmol/L,n=5)〕。
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表1 Ket对心肌静息[Ca2+]i的影响(nmol/L,±s，n=5)
细胞外[Ca2+](mmol/L)
0
0.01
0.1
1.0
1.3
未加Ket组
32.5±7.1
41.6±7.7
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54. 0±8.6
76.3±8.4
98.5±8.5
Ket组
33.4±6.8
40.1±6.9
52.8±7.4
81.1±7.9
96.5±9 .0
Ket组与未加Ket组比较，均P>0.05
2.1.2 Ket对去甲肾上腺素引起的心肌细胞[Ca2+]i增 高的影响 在细胞外Ca2+为1.3 mmol/L时，心肌细胞静息[Ca2+]i为(98.5±8.5) nmo l/L,NE 5 μmol/ L,10 μmol/L,15 μmol/L可使细胞内[Ca2+]i分别增高140.8%，175.2%，211. 7%。预先给予Ket 10，50，100，200，500 μmol/L温孵5 min可见Ket对NE引起的[Ca 2+ ]i增高有剂量依赖性的抑制作用，预先给予Ver 10 μmol/L对10 μmol/L NE引起的 [Ca 2+]i增高的抑制率为26.16%(见表2，图1)。
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2.1.3 Ket对高钾去极化引起的心肌细胞[Ca2+]i增高的影响 细 胞外 钙为1.3 mmol/L时，心肌细胞静息[Ca2+]i为(98.5±8.5) nmol/L，加入KCl 25 ,50，75 mmol/L时，心肌细胞[Ca2+]i分别增高200.6%，275%，275%，368.9% 。预先给予Ket 10，50，100，200，500 μmol/L温孵5 min，可见Ket对KCl引起的[Ca 2+]i有剂量依赖性的抑制作用(见表3，图2)。
表2 NE引起的心肌内[Ca2+]i的增高 (nmol/L,±s，n=5)
NE浓度(μmol/L)
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5
10
15
未加Ket组
138.70±27.20
172.57±25.16
208.80±20.51
Ket 10 μmol/L
147.70±23.60
172.86±20.50
18 7.15±22.86
Ket 50 μmol/L
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130.00±16.18
170.08±23.33
182. 92±25.64
Ket 100 μmol/L
119.87±11.04△
125.49±18.32△
137.11±17.49△
Ket 200 μmol/L
111.30±17.38△
119.58±22.35△
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130.54±19.98△
Ket 500 μmol/L
110.02±9.41△
119.18±17.03△
129.03±16.65△
Ver 10 μmol/L
110.32±10.11△
124.11±9.33△
129.23±19.54△
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与未加Ket组比较，△P<0.01
图1 Ket对NE引起的心肌细胞内[Ca2+]i
升高的抑制率与 其剂量的回归直线
图2 Ket对KCl引起的心肌细胞内[Ca2+]i
升高的抑 制率与其剂量的回归直线
表3 Ket对KCl引起的心肌内[Ca2+]i增高 的影响 (nmol/L,±s，n=5)
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KCl浓度(mmol/L)
25
50
75
未加 Ket组
197.60±12.47
270.80±26.31
363.40±55.40
Ket 10 μmol/L
132.78±14.90△
152.84±16.12△
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220.60±28.38△
Ket 50 μmol/L
126.11±18.01△
148.60±26.28△
171.70±18.62△
Ket 100 μmol/L
117.60±18.19△
137.20±17.46△
160.00±20.48△
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Ket 200 μmol/L
116.20±12.89△
127.72±17.10△
146.70±17.90△
Ket 500 μmol/L
115.24±20.29△
123.32±19.87△
143.71±18.78△
与未加Ket组比较△P<0.01
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3 讨论
Ket是一肥大细胞膜稳定剂，其组胺H1受体阻断作用明显强于扑尔敏，临床主要用于预防 哮喘发作[1]。
有研究显示，中性粒细胞的活化引起的呼吸爆发及溶酶体酶的释放与中性粒细胞[Ca2+ ]剧增有关。在中性粒细胞上存在受体控制的钙通道，钙通道阻断剂维拉帕米抑制FMLP引 起 的脱颗粒和超氧阴离子的生成，此通道的激活与磷脂酶的激活相耦联，即IP3(三磷酸肌 醇)-DAG(二酰基甘油)系统，促使钙内流。这一点与心肌细胞上α受体激活的钙通道极其相 似[6]，当激动剂与α受体结合后，经G-调节蛋白转导，激活磷酯酶C而催化膜内侧 磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)水解，产生甘油二酯(DG)及三磷酸肌醇(IP3)，IP3 可进入胞液，作用于内质网迅速使内质网储存的Ca2+大量释放到胞液中，同时IP3 促进细胞膜对Ca2+的转运，使细胞外液中Ca2+进入胞液增多。据此推测有一共 同的机制促进中性粒细胞及心肌细胞内Ca2+增高。
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在本实验中，我们利用新生Wistar大鼠心肌细胞悬液及荧光探针Fura-2研究了Ket对细胞内 游离Ca2+的影响。生理情况下，细胞外游离钙浓度是细胞内的104倍，这一浓度梯 度的维持依赖于细胞膜对Ca2+极低的通透性，线粒体膜和内质网膜上的Ca2+- Mg2+-ATP酶及Na+-Ca2+交换。本实验表明，细胞内静息[Ca2+] i与胞外Ca2+呈浓度依赖性，Ket 对细胞外不同浓度钙变化时的细胞内静息[Ca2 +]改变无明显影响，提示Ket对于Ca2+的被动扩散无明显影响。我们在实验中观察 到高钾去极化 状态下VDCC开放，心肌细胞内[Ca2+]i由静息状态的(98.5±8.58)mmol/L升高 至(270.86±26.31)mmol/L，升高近3倍，与文献报道接近。而使用Ket后，细胞内[Ca 2+ ]i升高不明显，IC为25 μmol/L，说明Ket能抑制高钾去极化引起的[Ca2+] i增高，但其是否通过VDCC而起作用尚需进一步实验。NE可以通过兴奋α-受体，激活受体调 控的Ca2+通道(ROCC)使外Ca2+内流，引起[Ca2+]i增高，在NE 10 μm ol/L时升高到(172.57±25.16)μmol/L，加入Ket 10～500 μmol/L可抑制NE引起的[ Ca2+]i的升高，推测Ket对α受体有抑制作用。有报道显示K et通过抑制Ca2+信号系统途径和DAG信号系统抑制中性粒细胞的激活[2]，结 合本实 验结果及α受体激活的信号系统，可推测Ket亦可通过IP3-DAG信号系统来阻断心肌α -R引起的[Ca2+]i升高并抑制Na+-Ca2+交换避免钙超载的发生，但其详 细机制还需进一步的实验证实。
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作者简介：丁强，女，1969年3月生，硕士，助教.
参考文献：
[1]陈新谦，金有豫.新编药物学.第13版[M]，北京：人民卫生出版社 ，1992. 358.
[2]辛小华，卞如濂.酮替芬对人血中性粒细胞呼吸爆发和细胞内游离钙离 子的影响[J].中国药理学报， 1992， 13 (4)： 367～370.
[3]吴俊芳， 刘天培.小檗碱对培养的新生大鼠心肌细胞内游离钙含量的影 响[J].中国药理学与毒理学杂志， 1995， 9 (3)： 216～219.
[4]李新天，王幼林.荧光指示剂法测定单个细胞内游离钙：如何准备贴壁 细胞样本[J].中国药理学通报， 1995， 11 (4)： 433～436.
[5]Poenie M,Alderton J.Tsion RY.Changes of free calcium levels wit h stages of the cell division cycle[J].Nature， 1985, 315 (6015): 147～148.[ ZK)〗
[6]鲁友明，刘国卿.细胞内钙转运及钙通道研究进展[J].中国药理学 通报， 1988， 4 (5)： 317～319.
收稿日期：2000-03-24, 百拇医药
单位：丁强(山西医科大学研究生部，太原 030001)；汤允昭(山西医科大学药理教研室)
关键词：酮替芬；心肌；钙通道阻滞药；大鼠
山西医科大学学报000405 摘要：观察了酮替芬(Ket)对新生鼠心肌细胞内游离钙的影 响，以酶法制备新生大鼠心肌细胞悬液，用荧光探针Fura-2/AM检测心肌细胞内游离钙浓度 的变化。结果表明：Ket对静息状态下[Ca2+]i无影响，Ket(10～500 μmol/L)剂 量依赖性抑制高钾去极化及NE所致的[Ca2+]i升高。提示：Ket对心肌细胞膜上电 压依赖性钙通道有抑制作用，也可能抑制受体操纵型钙通道。
中图分类号：R362 R972+.9 文献标识码：A
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文章编号：1007-6611(2000)04-0300-04
Effect of ketotifen on the free calcium in neonatal rat myocard ial cells
DING Qiang TANG Yun-zhao
(Dept.of Postgraduate,Shanxi Medical U niversity Taiyuan, 030001,China)
Abstract:The effect of ketotifen (Ket) on in tr acellular free calcium concentration([Ca2+]i) was examined in freshly isolated myocardial cells prepared from neonatal rats using the [Ca2+] i-sensitive fluorescence indicator Fura-2/AM. Ket had no effect on resting [Ca 2+]i whereas Ket(10～500 μmol/L) concentration-dependently inhibited[ C a2+]i elevation induced by high extracellular potassium and NE. These r esults suggest that Ket inhibits [Ca2+]i influx through voltage-depend e nt calcium channels and maybe through receptor-operated calcium channels in myoc ardial cells.
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Key words:ketotifen;myocardium;calcium cha nnel blockers;rats
酮替芬(Ket)为一抗变态反应药物[1] ，有很强的组胺H1-受体拮抗作用和抑制过敏介质释放的作用，有研究显示[2] ：Ket能抑制中性粒细胞的活化，抑制中性粒细胞内游离钙的升高，本实验目的在于观察Ket 对新生鼠心肌细胞游离钙的影响。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 Fure-2/AM为中国医学科学院药物研究所产品，用二甲基亚砜(DMSO)溶解为 1 mmol/L贮备液，酮替芬(Ket)，上海医科大学制药厂产品，批号950502；维拉帕米(Ver)， 德国Knoll产品；乙二醇双四乙酸(EGTA)，Fluka产品；HEPES，德国E.Merck产品，批号为61 8 k1711910;Triton X-100,Serva公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，上海丽珠东风生物技术有限 公司产品；胰蛋白酶，Sigma产品；DMEM培养基，美国GIBC实验室提供；其余试剂均为市售 分析纯。
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1.2 溶液配制 Hank液(μmol/L)：NaCl 137，CaCl2 1.3，KCl 5.0,MgSO4.7H2O 0.8，Na2HPO4 0.6，KH2PO4 0.4，NaHCO3 3.0，glucose 5.6，HEPES 20，用 去离子水配 制，用前调pH到7.4。无Ca2+Mg2+Hank液：去除CaCl2及MgSO4的Hank液 。 DMEM培养基配制：取小包装一袋，用1 L去离子水将其溶解后，加入0.2%BSA，调pH=7.2 。 0.25%胰蛋白酶液：用无Ca2+Mg2+Hank液配制，调pH到7.0。其余试剂均用去 离子水配成所需浓度。
1.3 细胞悬液制备[3，4] 取新生1～3 d Wistar大鼠，取出心脏，立即用冰冷 的Hank液洗去心内残血，去除心房及大血管，剪碎后置于一定量的0.25%的胰蛋白酶中，于 37 ℃恒温摇床中消化4～5次，将第2～5次的上清中的细胞收集在一起，过200目(95 μm)筛 网 ， 滤液再以Hank液洗涤2次；最后用DMEM培养基(含0.2%BSA)制成细胞悬液，0.4%台盼蓝排 斥试验检查，细胞成活率达95%以上，即可进行Fura-2负载。
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1.4 Fura-2负载 细胞悬液37 ℃预温5 min，加Fura-2/AM(终浓度4 μmol/L)为负载组。 37 ℃恒温振荡(35 r/min)30 min后，用含0.2%BSA的温Hank液洗涤，调细胞悬液浓度为1× 10 6～2×106个/ml,冰浴避光放置，在30 min内测定。
1.5 荧光测定[5] 荧光测定采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计。测 定条件：激发光(Ex)光栅为5.0 nm，发射光(Em)光栅为10 nm，固定Em波长为λ 500 n m，峰值在340 nm；然后固定Ex为峰值，从400～600 nm扫描发射光谱，找到峰值，固定E m在峰值。设定Ex的两个波长分别为340 nm，380 nm，作交替波长时间扫描，观察 不同条件下细胞内钙 离子浓 度的改变。机器按照下列公式自动由电脑输出[Ca2+]i浓度值(单位：nmol/L)。
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式中：Kd 为Fura-2与Ca2+反应的解离常数224 nmol/L，R、Rmax、R min分 别为测得的340 nm与380 nm的荧光比值，最大荧光比值和最小荧光比值，Sf2, Sb2分别为零Ca2+和饱和Ca2+时λ 380 nm激发光所产生的荧光强度。
1.6 实验分组设计
1.6.1 静息状态下脑细胞内[Ca2+]i测定 在细胞外1.3 mmol/L条件下测定。
1.6.2 不同外钙条件下[Ca2+]i变化 在细胞外钙浓度为0，0.01，0.1，1 .0(mmol/L)条件下测定，在细胞悬液制备及Fura-2负载过程中均用无Ca2+Hank液代 替Hank液，测定前加入不同浓度的CaCl2于细胞悬液中，使终浓度为0，0.01，0.1，1.0(mmol/L)。
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1.6.3 观察药物对不同外钙条件下[Ca2+]i变化的影响 预先以一定浓度的Ke t(500 μmol/L)与细胞悬液温孵5 min后测定。
1.6.4 观察不同激动剂对静息[Ca2+]i的影响 在细胞外钙1.3 mmol/L条件下 ，向细胞悬液中加入不同浓度的KCl溶液和NE使KCl终浓度分别为25，50，75 mmol/L;NE浓 度为5，10，15 μmol/L，观察[Ca2+]i的变化。
1.6.5 观察药物对不同激动剂所引起的[Ca2+]i变化的影响 预先以Ket(10～ 500 μmol/L)或对照药维拉帕米(Ver，10 μmol/L)与细胞悬液孵育5 min后，分别加入KCl 和NE观察[Ca2+]i变化。
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1.7 统计方法 结果以均数±标准差(
±s)表示，两样本均数比较用组间t 检验(方差 不齐者用t′检验)；多组样本均数比较用方差分析；用直线回归分析法计算IC50(药物 剂量作对数变换，百分数作概率单位交换)。2 结果
2.1 Ket对心肌细胞内游离钙浓度影响
2.1.1 Ket对心肌细胞静息[Ca2+]i的影响( 见表1) 当Hank液中Ca2+浓度为 0时，心肌细胞内静息[Ca2+]i为(32.5±7.1) nmol/L，当细胞外Ca2+浓 度为0.01，0.1，1.0，1.3 mmol/L时，细胞内静息Ca2+浓度随着胞外Ca2+ 浓度呈依赖性升高，分别为(41.6±7.7)、(54.0±8.6)、(83.2±8.4)、(98.5±8. 5) nmol/L (n=5)，加入Ket 500 μmol/L温孵5 min，对上述变化无明显影响〔(40. 1±6.9),(52.8±7.4),(96.4±9.0) mmol/L,n=5)〕。
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表1 Ket对心肌静息[Ca2+]i的影响(nmol/L,
±s，n=5)细胞外[Ca2+](mmol/L)
0
0.01
0.1
1.0
1.3
未加Ket组
32.5±7.1
41.6±7.7
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54. 0±8.6
76.3±8.4
98.5±8.5
Ket组
33.4±6.8
40.1±6.9
52.8±7.4
81.1±7.9
96.5±9 .0
Ket组与未加Ket组比较，均P>0.05
2.1.2 Ket对去甲肾上腺素引起的心肌细胞[Ca2+]i增 高的影响 在细胞外Ca2+为1.3 mmol/L时，心肌细胞静息[Ca2+]i为(98.5±8.5) nmo l/L,NE 5 μmol/ L,10 μmol/L,15 μmol/L可使细胞内[Ca2+]i分别增高140.8%，175.2%，211. 7%。预先给予Ket 10，50，100，200，500 μmol/L温孵5 min可见Ket对NE引起的[Ca 2+ ]i增高有剂量依赖性的抑制作用，预先给予Ver 10 μmol/L对10 μmol/L NE引起的 [Ca 2+]i增高的抑制率为26.16%(见表2，图1)。
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2.1.3 Ket对高钾去极化引起的心肌细胞[Ca2+]i增高的影响 细 胞外 钙为1.3 mmol/L时，心肌细胞静息[Ca2+]i为(98.5±8.5) nmol/L，加入KCl 25 ,50，75 mmol/L时，心肌细胞[Ca2+]i分别增高200.6%，275%，275%，368.9% 。预先给予Ket 10，50，100，200，500 μmol/L温孵5 min，可见Ket对KCl引起的[Ca 2+]i有剂量依赖性的抑制作用(见表3，图2)。
表2 NE引起的心肌内[Ca2+]i的增高 (nmol/L,
±s，n=5)NE浓度(μmol/L)
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5
10
15
未加Ket组
138.70±27.20
172.57±25.16
208.80±20.51
Ket 10 μmol/L
147.70±23.60
172.86±20.50
18 7.15±22.86
Ket 50 μmol/L
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130.00±16.18
170.08±23.33
182. 92±25.64
Ket 100 μmol/L
119.87±11.04△
125.49±18.32△
137.11±17.49△
Ket 200 μmol/L
111.30±17.38△
119.58±22.35△
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130.54±19.98△
Ket 500 μmol/L
110.02±9.41△
119.18±17.03△
129.03±16.65△
Ver 10 μmol/L
110.32±10.11△
124.11±9.33△
129.23±19.54△
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与未加Ket组比较，△P<0.01
图1 Ket对NE引起的心肌细胞内[Ca2+]i
升高的抑制率与 其剂量的回归直线
图2 Ket对KCl引起的心肌细胞内[Ca2+]i
升高的抑 制率与其剂量的回归直线
表3 Ket对KCl引起的心肌内[Ca2+]i增高 的影响 (nmol/L,
±s，n=5), 百拇医药
KCl浓度(mmol/L)
25
50
75
未加 Ket组
197.60±12.47
270.80±26.31
363.40±55.40
Ket 10 μmol/L
132.78±14.90△
152.84±16.12△
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220.60±28.38△
Ket 50 μmol/L
126.11±18.01△
148.60±26.28△
171.70±18.62△
Ket 100 μmol/L
117.60±18.19△
137.20±17.46△
160.00±20.48△
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Ket 200 μmol/L
116.20±12.89△
127.72±17.10△
146.70±17.90△
Ket 500 μmol/L
115.24±20.29△
123.32±19.87△
143.71±18.78△
与未加Ket组比较△P<0.01
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3 讨论
Ket是一肥大细胞膜稳定剂，其组胺H1受体阻断作用明显强于扑尔敏，临床主要用于预防 哮喘发作[1]。
有研究显示，中性粒细胞的活化引起的呼吸爆发及溶酶体酶的释放与中性粒细胞[Ca2+ ]剧增有关。在中性粒细胞上存在受体控制的钙通道，钙通道阻断剂维拉帕米抑制FMLP引 起 的脱颗粒和超氧阴离子的生成，此通道的激活与磷脂酶的激活相耦联，即IP3(三磷酸肌 醇)-DAG(二酰基甘油)系统，促使钙内流。这一点与心肌细胞上α受体激活的钙通道极其相 似[6]，当激动剂与α受体结合后，经G-调节蛋白转导，激活磷酯酶C而催化膜内侧 磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)水解，产生甘油二酯(DG)及三磷酸肌醇(IP3)，IP3 可进入胞液，作用于内质网迅速使内质网储存的Ca2+大量释放到胞液中，同时IP3 促进细胞膜对Ca2+的转运，使细胞外液中Ca2+进入胞液增多。据此推测有一共 同的机制促进中性粒细胞及心肌细胞内Ca2+增高。
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在本实验中，我们利用新生Wistar大鼠心肌细胞悬液及荧光探针Fura-2研究了Ket对细胞内 游离Ca2+的影响。生理情况下，细胞外游离钙浓度是细胞内的104倍，这一浓度梯 度的维持依赖于细胞膜对Ca2+极低的通透性，线粒体膜和内质网膜上的Ca2+- Mg2+-ATP酶及Na+-Ca2+交换。本实验表明，细胞内静息[Ca2+] i与胞外Ca2+呈浓度依赖性，Ket 对细胞外不同浓度钙变化时的细胞内静息[Ca2 +]改变无明显影响，提示Ket对于Ca2+的被动扩散无明显影响。我们在实验中观察 到高钾去极化 状态下VDCC开放，心肌细胞内[Ca2+]i由静息状态的(98.5±8.58)mmol/L升高 至(270.86±26.31)mmol/L，升高近3倍，与文献报道接近。而使用Ket后，细胞内[Ca 2+ ]i升高不明显，IC为25 μmol/L，说明Ket能抑制高钾去极化引起的[Ca2+] i增高，但其是否通过VDCC而起作用尚需进一步实验。NE可以通过兴奋α-受体，激活受体调 控的Ca2+通道(ROCC)使外Ca2+内流，引起[Ca2+]i增高，在NE 10 μm ol/L时升高到(172.57±25.16)μmol/L，加入Ket 10～500 μmol/L可抑制NE引起的[ Ca2+]i的升高，推测Ket对α受体有抑制作用。有报道显示K et通过抑制Ca2+信号系统途径和DAG信号系统抑制中性粒细胞的激活[2]，结 合本实 验结果及α受体激活的信号系统，可推测Ket亦可通过IP3-DAG信号系统来阻断心肌α -R引起的[Ca2+]i升高并抑制Na+-Ca2+交换避免钙超载的发生，但其详 细机制还需进一步的实验证实。
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作者简介：丁强，女，1969年3月生，硕士，助教.
参考文献：
[1]陈新谦，金有豫.新编药物学.第13版[M]，北京：人民卫生出版社 ，1992. 358.
[2]辛小华，卞如濂.酮替芬对人血中性粒细胞呼吸爆发和细胞内游离钙离 子的影响[J].中国药理学报， 1992， 13 (4)： 367～370.
[3]吴俊芳， 刘天培.小檗碱对培养的新生大鼠心肌细胞内游离钙含量的影 响[J].中国药理学与毒理学杂志， 1995， 9 (3)： 216～219.
[4]李新天，王幼林.荧光指示剂法测定单个细胞内游离钙：如何准备贴壁 细胞样本[J].中国药理学通报， 1995， 11 (4)： 433～436.
[5]Poenie M,Alderton J.Tsion RY.Changes of free calcium levels wit h stages of the cell division cycle[J].Nature， 1985, 315 (6015): 147～148.[ ZK)〗
[6]鲁友明，刘国卿.细胞内钙转运及钙通道研究进展[J].中国药理学 通报， 1988， 4 (5)： 317～319.
收稿日期：2000-03-24, 百拇医药