Mauthner细胞轴丘定位方法
作者：童学红 张淑华 虞棻 张英才
单位：首都医科大学生理学教研室
关键词：
首都医科大学学报000421 利用Mauthner细胞进行任何类别的电生理学研究，首先要把记录电极准确放置在M细胞轴丘外的轴突帽中心[1]，即负电中心，否则下一步的实验将难以进行。本室根据多年实践经验，在分析了实验失败原因的基础上，制定了轴丘定位方法。实践证明，本方法有助于初学者尽快掌握轴丘定位技术，提高实验成功率。
1 材料和方法
体长10～12 cm的国产鲫鱼，以躯体扁瘦如柳叶形、头顶凸耸略呈尖峰状的品种最佳。
操作方法：①麻醉：将鱼置于2%乌拉坦溶液中，待鱼体倾倒时立即取出，经口循环灌流0.3%乌拉坦水溶液以维持呼吸并保持麻醉深度。②鱼体固定：常规取背-腹直立位固定，在鳃裂的顶点嘴侧1～3 mm处用钢锥由两侧相向牢固夹持头骨，然后在尽可能低头的姿势下在两侧眼眶上缘对称位置用另2个钢锥相向夹持头骨，使头部固定。在背鳍前缘脊背处夹持躯干。③手术和制动：开颅暴露小脑，将小脑向嘴侧翻转并尽量拉向嘴端，以充分暴露延髓，操作应轻柔，防止损伤脑膜血管。在背鳍尾端头侧约1 cm处沿脊柱走行向前做大约3 cm×1 cm的矩形切口，切口前缘大致与背鳍中点平齐，上缘在侧线腹侧约1 mm ，与侧线平齐。清除创口内的软组织，露出脊柱，充分止血。在暴露的脊柱处安置双极刺激电极，用适宜强度的单脉冲刺激脊髓以逆向激活M-轴突，逆向激活表现为甩尾、胸鳍内收、缩鳃和口部喷水。逆向激活反应确定无误后，肌肉注射三碘季胺酚1 μg/g 制动。④探查M细胞轴丘：以波宽30～50 μs，强度5～10 V，刺激间隔700～1 000 ms的单个脉冲间断刺激脊髓，逆向激活M-轴丘，同时以微电极在延髓深部探查M细胞逆向动作电位的胞外反应。以获得幅度为15～40 mV的胞外逆向动作电位的记录点作为M细胞轴丘所在位置，即轴突帽中心。
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M细胞胞体的解剖位置在延髓中线两侧，旁开500 μm，脑表面深度1 200～1 500 μm，与第Ⅷ脑神经入脑处平齐。据此，可将记录电极预先置于中线外侧500 μm，延髓嘴侧1/3与尾侧2/3交界处作为探查起点。由此起点主要沿头尾方向进行探查。
2 结果和讨论
探查胞外逆向动作电位之初，最常见的反应为潜伏期约0.3～0.5 ms，持续期约0.5～0.7 ms，幅度约0.5～1 mV的正负双相波或单相负波，其后跟随有幅度较高、时程较长的另一单向负波或负-正双相波(图1A)。改变脊髓刺激强度可以看出前者呈全或无式反应即逆向动作电位，后者为分级性反应。当记录电极逐渐趋近负电中心时即可发现全或无式反应与所要追踪的负向胞外逆向动作电位对应(图1B)。因此轴丘定位过程中始终都要以该全或无反应为追踪目标，尽管分级性反应有时在形状和幅度上酷似负向锋电位。
图1B是轴丘定位过程中记录电极逐渐趋近负电中心的记录，其中a为探查起始点，负向电位仅约1.5 mV；b的记录点在a的尾侧100 μm，尽管电极移动跨度较大，但负向电位变化不明显，幅度还略有降低，说明电极移动方向有误。c记录点在b的头侧200 μm，负向电位明显增大，表明电极向轴丘方向趋近。d、e、f和g各点依次向头侧移动了50、20、20、和10 μm，反应依次增大。g的负向动作电位幅度已超过20 mV，可确认记录电极已准确定位于轴丘外的轴突帽中心。从图1B所示的轴丘定位过程可以反映出M细胞逆向动作电位胞外电场的空间分布规律：电极距负电中心愈远，所记录的负向
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图1 M细胞激活时的电反应
A：M细胞逆向动作电位的胞外记录。记录点距轴突帽中心的矢向距离为210 μm；重叠的4次反应其刺激强度分别为4 V 2次(阈强度，其中1次出现动作电位，以实线表示)，5 V和6 V各1次，均引起动作电位；注意3次动作电位(用 * 表示)的幅度相同，其后继以不同幅度的分级性反应(用↑标示)；校准：2 mV，2 ms
B：记录电极逐渐趋近负电中心时逆向动作电位的胞外记录；“ * ”表示与负向胞外逆向动作电位相对应的全或无式反应；校准：10 mV，2 ms
C：M细胞激活时PHP神经元的胞内电反应；校准：10 mV，3 ms
电位幅值愈小，记录位置变动对幅值的影响愈小；记录点愈接近负电中心，负向电位幅值愈大且对记录位置的变动愈敏感。实验者可根据胞外电场空间分布规律，确定记录电极的探查方向，调整探查跨度。
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图1C是轴丘定位过程中偶见的记录，其特征是在-50～-70 mV静息电位的基础上出现10 mV左右的全或无性超极化电位，其形状、时程、潜伏期均与M细胞胞外逆向动作电位相同，超极化电位之后跟随有EPSP，并在其基础上有连续动作电位爆发，酷似胞外逆向动作电位之后的EHP(extrinsic hyperpolarizing potential)。记录电极位置稍有改变常使反应突然消失，这种特殊反应是被M细胞轴突侧支激活的PHP(passive hyperpolarizing potential)神经元的胞内记录[2，3]，往往是探查电极深入M细胞腹内侧的PHP神经元聚集区所致，应向背外侧调整电极位置。
参考文献
1，Furshpan E J,Furukawa T.Intracellular and extracellular responses of the several regions of the Mauthner cell of the goldfish.J Neurophysiol,1962,25:732
2，Korn H,Faber D S.Vertebrate central nervous system: Same neurons mediate both electrical and chemical inhibitions.Science,1976,194:1166
3，Korn H,Faber D S.An electrically mediated inhibition in goldfish medulla.J Neurophysiol,1975,38:452
收稿日期：1999-12-06, 百拇医药
单位：首都医科大学生理学教研室
关键词：
首都医科大学学报000421 利用Mauthner细胞进行任何类别的电生理学研究，首先要把记录电极准确放置在M细胞轴丘外的轴突帽中心[1]，即负电中心，否则下一步的实验将难以进行。本室根据多年实践经验，在分析了实验失败原因的基础上，制定了轴丘定位方法。实践证明，本方法有助于初学者尽快掌握轴丘定位技术，提高实验成功率。
1 材料和方法
体长10～12 cm的国产鲫鱼，以躯体扁瘦如柳叶形、头顶凸耸略呈尖峰状的品种最佳。
操作方法：①麻醉：将鱼置于2%乌拉坦溶液中，待鱼体倾倒时立即取出，经口循环灌流0.3%乌拉坦水溶液以维持呼吸并保持麻醉深度。②鱼体固定：常规取背-腹直立位固定，在鳃裂的顶点嘴侧1～3 mm处用钢锥由两侧相向牢固夹持头骨，然后在尽可能低头的姿势下在两侧眼眶上缘对称位置用另2个钢锥相向夹持头骨，使头部固定。在背鳍前缘脊背处夹持躯干。③手术和制动：开颅暴露小脑，将小脑向嘴侧翻转并尽量拉向嘴端，以充分暴露延髓，操作应轻柔，防止损伤脑膜血管。在背鳍尾端头侧约1 cm处沿脊柱走行向前做大约3 cm×1 cm的矩形切口，切口前缘大致与背鳍中点平齐，上缘在侧线腹侧约1 mm ，与侧线平齐。清除创口内的软组织，露出脊柱，充分止血。在暴露的脊柱处安置双极刺激电极，用适宜强度的单脉冲刺激脊髓以逆向激活M-轴突，逆向激活表现为甩尾、胸鳍内收、缩鳃和口部喷水。逆向激活反应确定无误后，肌肉注射三碘季胺酚1 μg/g 制动。④探查M细胞轴丘：以波宽30～50 μs，强度5～10 V，刺激间隔700～1 000 ms的单个脉冲间断刺激脊髓，逆向激活M-轴丘，同时以微电极在延髓深部探查M细胞逆向动作电位的胞外反应。以获得幅度为15～40 mV的胞外逆向动作电位的记录点作为M细胞轴丘所在位置，即轴突帽中心。
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M细胞胞体的解剖位置在延髓中线两侧，旁开500 μm，脑表面深度1 200～1 500 μm，与第Ⅷ脑神经入脑处平齐。据此，可将记录电极预先置于中线外侧500 μm，延髓嘴侧1/3与尾侧2/3交界处作为探查起点。由此起点主要沿头尾方向进行探查。
2 结果和讨论
探查胞外逆向动作电位之初，最常见的反应为潜伏期约0.3～0.5 ms，持续期约0.5～0.7 ms，幅度约0.5～1 mV的正负双相波或单相负波，其后跟随有幅度较高、时程较长的另一单向负波或负-正双相波(图1A)。改变脊髓刺激强度可以看出前者呈全或无式反应即逆向动作电位，后者为分级性反应。当记录电极逐渐趋近负电中心时即可发现全或无式反应与所要追踪的负向胞外逆向动作电位对应(图1B)。因此轴丘定位过程中始终都要以该全或无反应为追踪目标，尽管分级性反应有时在形状和幅度上酷似负向锋电位。
图1B是轴丘定位过程中记录电极逐渐趋近负电中心的记录，其中a为探查起始点，负向电位仅约1.5 mV；b的记录点在a的尾侧100 μm，尽管电极移动跨度较大，但负向电位变化不明显，幅度还略有降低，说明电极移动方向有误。c记录点在b的头侧200 μm，负向电位明显增大，表明电极向轴丘方向趋近。d、e、f和g各点依次向头侧移动了50、20、20、和10 μm，反应依次增大。g的负向动作电位幅度已超过20 mV，可确认记录电极已准确定位于轴丘外的轴突帽中心。从图1B所示的轴丘定位过程可以反映出M细胞逆向动作电位胞外电场的空间分布规律：电极距负电中心愈远，所记录的负向
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图1 M细胞激活时的电反应
A：M细胞逆向动作电位的胞外记录。记录点距轴突帽中心的矢向距离为210 μm；重叠的4次反应其刺激强度分别为4 V 2次(阈强度，其中1次出现动作电位，以实线表示)，5 V和6 V各1次，均引起动作电位；注意3次动作电位(用 * 表示)的幅度相同，其后继以不同幅度的分级性反应(用↑标示)；校准：2 mV，2 ms
B：记录电极逐渐趋近负电中心时逆向动作电位的胞外记录；“ * ”表示与负向胞外逆向动作电位相对应的全或无式反应；校准：10 mV，2 ms
C：M细胞激活时PHP神经元的胞内电反应；校准：10 mV，3 ms
电位幅值愈小，记录位置变动对幅值的影响愈小；记录点愈接近负电中心，负向电位幅值愈大且对记录位置的变动愈敏感。实验者可根据胞外电场空间分布规律，确定记录电极的探查方向，调整探查跨度。
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图1C是轴丘定位过程中偶见的记录，其特征是在-50～-70 mV静息电位的基础上出现10 mV左右的全或无性超极化电位，其形状、时程、潜伏期均与M细胞胞外逆向动作电位相同，超极化电位之后跟随有EPSP，并在其基础上有连续动作电位爆发，酷似胞外逆向动作电位之后的EHP(extrinsic hyperpolarizing potential)。记录电极位置稍有改变常使反应突然消失，这种特殊反应是被M细胞轴突侧支激活的PHP(passive hyperpolarizing potential)神经元的胞内记录[2，3]，往往是探查电极深入M细胞腹内侧的PHP神经元聚集区所致，应向背外侧调整电极位置。
参考文献
1，Furshpan E J,Furukawa T.Intracellular and extracellular responses of the several regions of the Mauthner cell of the goldfish.J Neurophysiol,1962,25:732
2，Korn H,Faber D S.Vertebrate central nervous system: Same neurons mediate both electrical and chemical inhibitions.Science,1976,194:1166
3，Korn H,Faber D S.An electrically mediated inhibition in goldfish medulla.J Neurophysiol,1975,38:452
收稿日期：1999-12-06, 百拇医药