酮替芬对新生大鼠脑细胞内游离钙浓度的影响
作者：张朝霞 汤允昭
单位：张朝霞(山西医科大学口腔系，太原 030001)；汤允昭(山西医科大学药理学教研室)
关键词：酮替芬；氯化钾；谷氨酸盐类；Fura-2；钙；大鼠
山西医科大学学报000404 摘要：目的 观察在不同外钙条件和激动剂作 用下新生大鼠脑细胞内游离钙浓度的变化及酮替芬(ketotifen，Ket)的影响。方 法 通过荧光指示剂Fura-2/AM负载细胞，测定[Ca2+]i值。结果 胞外正常钙1.3 mmol/L时，胞内静息[Ca2+]i为(136.49±7.36) nmol/L(n=10)。Ket(500 μmol/L)对不同外钙条件下胞内静息Ca2 + 浓度无显著影响(P>0.05)，Ket(50～500 μmol/L)可以剂量依赖性抑制KCl和L-谷氨 酸引 起的[Ca2+]升高。结论 Ket对电压依赖性钙通道和受体 依赖性钙通道均可能有抑制作用。
, 百拇医药
中图分类号：R362 R972+.9 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0297-03
Effects of ketotifen on intracellular Ca2+ level in isolated brain cells of neonatal rats
ZHANG Zhao-xia TANG Yun-zhao
(Dept.of Stomatology,Shan xi Medical University,Taiyuan 030001,China)
Abstract:Objective To observe the effects of Ket on free intracellular Ca2+,the level of isolated newborn rat brain cells in pr esence and absence of extracellular KCl and L-Glu [Ca2+]i was measured with a RF-5000 sp ectrofluorophotometer by preloading the cells with calcium sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM. Result Resting [Ca2+]iwas (136.49±7.36) nm ol/ L(n=10) in the presense of Ca2+ 1.3 mmol/L in Hank's solution. No sign ificant effects of Ket (500 μmol/L) on resting brain [Ca2+]i level were obser v ed. When extracellular Ca2+was 1.3 mmol/L,Ket(10～500 μmol/L concentratio n- dependently inhibited KCl and L-Glu-induceded [Ca2+]i elevation. Con clusion Ketotifen can inhibit the voltage dependence calcium channel and rece ptor co perated calcium channel.
, 百拇医药
Key words:ketotifen;potassium chloride;glu tamates;Fura-2;calcium;rats
酮替芬(ketotifen,Ket)是一种新型抗过敏药，我室新近研究表明Ket对心、脑缺血再灌注损 伤有保护作 用，为进一步探讨其作用机制，本实验观察了Ket对不同激动剂引起的神经细胞[Ca2+ ]i升高的影响。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 酮替芬(上海衡山药业有限公司)，用去离子水配成所需浓度；Fura-2/A M(中国医学科学院药物研究所)，用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解；L-谷氨酸(L-Glu)和乙二醇四乙酸(EGTA)，Fluka产品；HEPES，德国E.Merck产品；牛血清白蛋白( BS A)，上海东风生物制品公司；Triton X-100，Sigma产品；胰蛋白酶(trypsin)，Sigma产品 ；DMEM培养基，美国GIBC实验室提供。
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1.2 细胞悬液制备[1～3] 取新生1～3 d 的Wistar大鼠乳鼠(本校实验动物中 心提供 )，剥离全脑，立即用冰无钙镁Hank液(NaCl 137,KCl 5.0,Na2HPO4 0.6，KH2PO 4 0.4，NaHCO3 3.0,glucose 5.6,HEPES 20 mmol/L,pH=7.2～7.4,用去离子水配制)冲 洗 2～3次，仔细剥离、剔除软脑膜及血管，剪碎置于一定量的0.25%胰蛋白酶中于37 ℃消化1 0 min 。用含0.2%牛血清白蛋白的冰DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打分散细胞，过200目(9 5 μm)筛网，滤液以1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用Hank液洗2次。最后用含0. 2% BSA的DMEM培养基制成细胞悬液。0.4%台盼蓝排斥试验检查细胞存活率在90%～95%以上。
1.3 Fura-2/AM负载[1～3] 细胞悬液在37 ℃水浴中预温5 min后，加Fura-2/ A M(终浓度为5 μmol/L(为负载组，另加等量DMSO为对照组。37 ℃
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水浴 中恒温振荡(35次/mi n)40 min后，离心，弃上清，用含0.2%BSA的Hank液洗涤以脱去卡负载的Fura-2/AM，最后用 温无钙镁Hank液调细胞悬液为2×109个/L，加入不同激动剂进行荧光测定。观察Ket影响 时，预先把细胞悬液与Ket孵育5 min，再加激动剂测定。
1.4 荧光测定[3，4] 采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计(λex :340 nm,380 nm;λem:485 nm)，按公式计算Ca2+浓度值(nmol/L)：
式中：Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数224 nmol/L，R、Rmax 、R min分别为测得的λ 340 nm和λ 380 nm 的荧光比值、最大荧光比值、最小荧光比值 ；Sf 2、Sb2分别为零Ca2+和饱和Ca2+λ 380 nm激发光产生的荧光强度 。
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1.5 统计学处理 结果均以
±s表示，两样本均数比较用t检验，多样 本均数比较用方差分析。
2 结果
2.1 Ket对静息[Ca2+]i的影响 胞外正常钙1.3 mmol/L时，胞内[Ca2+ ]i为136.49±7.36(n=10)。在胞外钙浓度为0，0.01，0.1，10，1.3 mmol/L 条件 下，胞内[Ca2+]i分别为(nmol/L)：(54.39±6.85)、(78.54±8.91)、(97. 62±10.28 )、(113.37±7.6)、(136.49±7.36) nmol/L，应用Ket(500 μmol/L)后分别为(nmol/L )：(51.21±8.04)、(76.19±9.83)、(100.03±7.23)、(117.58±10.28)、(135. 62±10.35)(n=8,P>0.05)。
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2.2 Ket对KCl引起的[Ca2+]i变化的影响 胞外正常钙时，加入不同浓度KCl使 其终浓度分别为25，50，75 nmol/L,可使[Ca2+]i由(136.49±7.36)分别增加 到(234.59±9.05)、(341.77±14.51)、(408.56±13.17) nmol/L，应用Ket终浓度分 别为 50，100，200，300，500 μmol/L可剂量依赖性抑制[Ca2+]i的增高(P<0.01 )，见表1。
表1 Ket对KCl引起的[Ca2+]变化的影响 (nmol/L，±s,n=8) 组别
KCl(mmol/L)
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25
50
75
Ket 0 μmol/L
234.59±9.05
341.77±14.51
408.16±13.17
Ket 10 μmol/L
205.36±10.78*
295.60±14.70*
367.68±12.76*
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Ket 50 μmol/L
186.32±11.68*
257.04±12.27*
339.12±11.78*
Ket 100 μmol/L
175.44±12.15*
240.72±11.65*
297.44±10.67*
Ket 200 μmol/L
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160.48±11.16*
229.84±8.13*
272.52±13.88*
Ket 500 μmol/L
152.32±15.49*
199.90±13.41*
248.48±13.40*
与无Ket组相比*P<0.01
2.3 Ket对L-Glu引起的[Ca2+]i变化的影响 胞外正常钙时，加入 不同浓度L-G lu使其终浓度分别为100、200、300 μmol/L可使[Ca2+]i由(136.49±7.36)分 别增加 到(320.28±14.68)、(427.73±10.90)、(502.56±15.07) nmol/L，应用Ket终浓度 分 别为50，100，200，300，500 μmol/L可剂量依赖性抑制[Ca2+]i的增高(P <0.01)，见表2。表2 Ket对L-Glu引起的[Ca2+] 变化的影响 (nmol/L，±s,n =8) 组别
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L-Glu(μmol/L)
100
200
300
Ket 0 μmol/L
320.28±14.68
427.73±10.90
502.56±15.07
Ket 10 μmol/L
277.44±9.99*
376.96±12.48*
, 百拇医药
4 52.52±10.62*
Ket 50 μmol/L
257.04±10.95*
348.64±11.99*
412 .16±14.87*
Ket 100 μmol/L
231.20±13.34*
312.80±12.24*
3 77.68±11.55*
, 百拇医药
Ket 200 μmol/L
208.08±9.28*
281.52±14.37*
3 36.44±17.77*
Ket 500 μmol/L
193.12±12.39*
247.52±15.84*
3 04.72±11.16*
与无Ket组相比，*P<0.01
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3 讨论
谷氨酸作为中枢神经系统一种兴奋性神经递质，在脑缺血再灌中起重要作用。脑缺血再灌中 ，缺氧造成神经细胞膜去极化和能量代谢障碍，使突触前膜兴奋释放Glu递质，而且依赖于A TP的突触前膜对Glu重吸收过程受到抑制，从而神经元外Glu浓度明显增高。Glu能激活NMDA 亚型Glu受体，直接引起Ca2+沿浓度梯度跨膜内流。同时，Glu也能激活Quisquate 亚型和K ainate亚型受体，包括NMDA亚型Glu受体，引起Na+内流和膜去极化，启动电压依赖性钙通 道，Na+/Ca2+交换，Ca2+泄露等途径引起神经元Ca2+稳态失调，而且Glu 能激活Quisqulate亚型Glu受体，产生第二信使：三磷酸肌醇(IP3)，造成细胞内IP3 敏感性钙池的释放。通过多种因素使胞内Ca2+积聚，而胞内钙超载是缺血性神经元死 亡的最后共同通路[5]。
, 百拇医药
本实验结果表明：Ket对静息钙无显著影响，提示Ket不影响Ca2+的被动扩散。Ket对 高钾去极化引起的胞内[Ca2+]i增加有显著的抑制效应，对谷氨酸兴奋引起的胞 内[Ca2+]i增加，也有显著的抑制作用。提示Ket对电压依赖性钙通道和受体操纵 型钙通道均可能有抑制作用，这与其对脑缺血再灌注损伤的保护作用有关。
作者简介：张朝霞，女，1974年8月生，硕士，助教.
参考文献：
[1]Dildy JE,Leslies W.Ethanol inhibits NMDA-induced increases in f ree intracellular in dissociated brain cell[J]. Brain Res,1989, 499(2): 383.[ ZK)〗
, 百拇医药
[2]李明，王峻峰，韩济生，等. 应用Fura-2/AM检测分离的神经细胞内游离 钙及其变化[J].药学学报，1991， 26(11)： 890.
[3]张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方 法[J].中国药学杂志，1991， 26(11)： 655.
[4]高红，冯亦璞. 用Fura-2/AM测定突触体内游离Ca2+浓度及Ca 2+通过激动剂和阻断剂的影响[J]，药学学报，1993,28(6):404.
[5]Tonic D, Frontoni M,Argentino C,et al.Update on calcium ant a gonists in cerebrovascular diseases[J].J Cardiovasc Pharmacol,1991,18(Suppl.8) :S10.
收稿日期：2000-02-22, 百拇医药
单位：张朝霞(山西医科大学口腔系，太原 030001)；汤允昭(山西医科大学药理学教研室)
关键词：酮替芬；氯化钾；谷氨酸盐类；Fura-2；钙；大鼠
山西医科大学学报000404 摘要：目的 观察在不同外钙条件和激动剂作 用下新生大鼠脑细胞内游离钙浓度的变化及酮替芬(ketotifen，Ket)的影响。方 法 通过荧光指示剂Fura-2/AM负载细胞，测定[Ca2+]i值。结果 胞外正常钙1.3 mmol/L时，胞内静息[Ca2+]i为(136.49±7.36) nmol/L(n=10)。Ket(500 μmol/L)对不同外钙条件下胞内静息Ca2 + 浓度无显著影响(P>0.05)，Ket(50～500 μmol/L)可以剂量依赖性抑制KCl和L-谷氨 酸引 起的[Ca2+]升高。结论 Ket对电压依赖性钙通道和受体 依赖性钙通道均可能有抑制作用。
, 百拇医药
中图分类号：R362 R972+.9 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0297-03
Effects of ketotifen on intracellular Ca2+ level in isolated brain cells of neonatal rats
ZHANG Zhao-xia TANG Yun-zhao
(Dept.of Stomatology,Shan xi Medical University,Taiyuan 030001,China)
Abstract:Objective To observe the effects of Ket on free intracellular Ca2+,the level of isolated newborn rat brain cells in pr esence and absence of extracellular KCl and L-Glu [Ca2+]i was measured with a RF-5000 sp ectrofluorophotometer by preloading the cells with calcium sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM. Result Resting [Ca2+]iwas (136.49±7.36) nm ol/ L(n=10) in the presense of Ca2+ 1.3 mmol/L in Hank's solution. No sign ificant effects of Ket (500 μmol/L) on resting brain [Ca2+]i level were obser v ed. When extracellular Ca2+was 1.3 mmol/L,Ket(10～500 μmol/L concentratio n- dependently inhibited KCl and L-Glu-induceded [Ca2+]i elevation. Con clusion Ketotifen can inhibit the voltage dependence calcium channel and rece ptor co perated calcium channel.
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Key words:ketotifen;potassium chloride;glu tamates;Fura-2;calcium;rats
酮替芬(ketotifen,Ket)是一种新型抗过敏药，我室新近研究表明Ket对心、脑缺血再灌注损 伤有保护作 用，为进一步探讨其作用机制，本实验观察了Ket对不同激动剂引起的神经细胞[Ca2+ ]i升高的影响。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 酮替芬(上海衡山药业有限公司)，用去离子水配成所需浓度；Fura-2/A M(中国医学科学院药物研究所)，用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解；L-谷氨酸(L-Glu)和乙二醇四乙酸(EGTA)，Fluka产品；HEPES，德国E.Merck产品；牛血清白蛋白( BS A)，上海东风生物制品公司；Triton X-100，Sigma产品；胰蛋白酶(trypsin)，Sigma产品 ；DMEM培养基，美国GIBC实验室提供。
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1.2 细胞悬液制备[1～3] 取新生1～3 d 的Wistar大鼠乳鼠(本校实验动物中 心提供 )，剥离全脑，立即用冰无钙镁Hank液(NaCl 137,KCl 5.0,Na2HPO4 0.6，KH2PO 4 0.4，NaHCO3 3.0,glucose 5.6,HEPES 20 mmol/L,pH=7.2～7.4,用去离子水配制)冲 洗 2～3次，仔细剥离、剔除软脑膜及血管，剪碎置于一定量的0.25%胰蛋白酶中于37 ℃消化1 0 min 。用含0.2%牛血清白蛋白的冰DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打分散细胞，过200目(9 5 μm)筛网，滤液以1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用Hank液洗2次。最后用含0. 2% BSA的DMEM培养基制成细胞悬液。0.4%台盼蓝排斥试验检查细胞存活率在90%～95%以上。
1.3 Fura-2/AM负载[1～3] 细胞悬液在37 ℃水浴中预温5 min后，加Fura-2/ A M(终浓度为5 μmol/L(为负载组，另加等量DMSO为对照组。37 ℃
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水浴 中恒温振荡(35次/mi n)40 min后，离心，弃上清，用含0.2%BSA的Hank液洗涤以脱去卡负载的Fura-2/AM，最后用 温无钙镁Hank液调细胞悬液为2×109个/L，加入不同激动剂进行荧光测定。观察Ket影响 时，预先把细胞悬液与Ket孵育5 min，再加激动剂测定。
1.4 荧光测定[3，4] 采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计(λex :340 nm,380 nm;λem:485 nm)，按公式计算Ca2+浓度值(nmol/L)：
式中：Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数224 nmol/L，R、Rmax 、R min分别为测得的λ 340 nm和λ 380 nm 的荧光比值、最大荧光比值、最小荧光比值 ；Sf 2、Sb2分别为零Ca2+和饱和Ca2+λ 380 nm激发光产生的荧光强度 。
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1.5 统计学处理 结果均以
±s表示，两样本均数比较用t检验，多样 本均数比较用方差分析。2 结果
2.1 Ket对静息[Ca2+]i的影响 胞外正常钙1.3 mmol/L时，胞内[Ca2+ ]i为136.49±7.36(n=10)。在胞外钙浓度为0，0.01，0.1，10，1.3 mmol/L 条件 下，胞内[Ca2+]i分别为(nmol/L)：(54.39±6.85)、(78.54±8.91)、(97. 62±10.28 )、(113.37±7.6)、(136.49±7.36) nmol/L，应用Ket(500 μmol/L)后分别为(nmol/L )：(51.21±8.04)、(76.19±9.83)、(100.03±7.23)、(117.58±10.28)、(135. 62±10.35)(n=8,P>0.05)。
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2.2 Ket对KCl引起的[Ca2+]i变化的影响 胞外正常钙时，加入不同浓度KCl使 其终浓度分别为25，50，75 nmol/L,可使[Ca2+]i由(136.49±7.36)分别增加 到(234.59±9.05)、(341.77±14.51)、(408.56±13.17) nmol/L，应用Ket终浓度分 别为 50，100，200，300，500 μmol/L可剂量依赖性抑制[Ca2+]i的增高(P<0.01 )，见表1。
表1 Ket对KCl引起的[Ca2+]变化的影响 (nmol/L，
±s,n=8) 组别KCl(mmol/L)
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25
50
75
Ket 0 μmol/L
234.59±9.05
341.77±14.51
408.16±13.17
Ket 10 μmol/L
205.36±10.78*
295.60±14.70*
367.68±12.76*
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Ket 50 μmol/L
186.32±11.68*
257.04±12.27*
339.12±11.78*
Ket 100 μmol/L
175.44±12.15*
240.72±11.65*
297.44±10.67*
Ket 200 μmol/L
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160.48±11.16*
229.84±8.13*
272.52±13.88*
Ket 500 μmol/L
152.32±15.49*
199.90±13.41*
248.48±13.40*
与无Ket组相比*P<0.01
2.3 Ket对L-Glu引起的[Ca2+]i变化的影响 胞外正常钙时，加入 不同浓度L-G lu使其终浓度分别为100、200、300 μmol/L可使[Ca2+]i由(136.49±7.36)分 别增加 到(320.28±14.68)、(427.73±10.90)、(502.56±15.07) nmol/L，应用Ket终浓度 分 别为50，100，200，300，500 μmol/L可剂量依赖性抑制[Ca2+]i的增高(P <0.01)，见表2。表2 Ket对L-Glu引起的[Ca2+] 变化的影响 (nmol/L，
±s,n =8) 组别, http://www.100md.com
L-Glu(μmol/L)
100
200
300
Ket 0 μmol/L
320.28±14.68
427.73±10.90
502.56±15.07
Ket 10 μmol/L
277.44±9.99*
376.96±12.48*
, 百拇医药
4 52.52±10.62*
Ket 50 μmol/L
257.04±10.95*
348.64±11.99*
412 .16±14.87*
Ket 100 μmol/L
231.20±13.34*
312.80±12.24*
3 77.68±11.55*
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Ket 200 μmol/L
208.08±9.28*
281.52±14.37*
3 36.44±17.77*
Ket 500 μmol/L
193.12±12.39*
247.52±15.84*
3 04.72±11.16*
与无Ket组相比，*P<0.01
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3 讨论
谷氨酸作为中枢神经系统一种兴奋性神经递质，在脑缺血再灌中起重要作用。脑缺血再灌中 ，缺氧造成神经细胞膜去极化和能量代谢障碍，使突触前膜兴奋释放Glu递质，而且依赖于A TP的突触前膜对Glu重吸收过程受到抑制，从而神经元外Glu浓度明显增高。Glu能激活NMDA 亚型Glu受体，直接引起Ca2+沿浓度梯度跨膜内流。同时，Glu也能激活Quisquate 亚型和K ainate亚型受体，包括NMDA亚型Glu受体，引起Na+内流和膜去极化，启动电压依赖性钙通 道，Na+/Ca2+交换，Ca2+泄露等途径引起神经元Ca2+稳态失调，而且Glu 能激活Quisqulate亚型Glu受体，产生第二信使：三磷酸肌醇(IP3)，造成细胞内IP3 敏感性钙池的释放。通过多种因素使胞内Ca2+积聚，而胞内钙超载是缺血性神经元死 亡的最后共同通路[5]。
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本实验结果表明：Ket对静息钙无显著影响，提示Ket不影响Ca2+的被动扩散。Ket对 高钾去极化引起的胞内[Ca2+]i增加有显著的抑制效应，对谷氨酸兴奋引起的胞 内[Ca2+]i增加，也有显著的抑制作用。提示Ket对电压依赖性钙通道和受体操纵 型钙通道均可能有抑制作用，这与其对脑缺血再灌注损伤的保护作用有关。
作者简介：张朝霞，女，1974年8月生，硕士，助教.
参考文献：
[1]Dildy JE,Leslies W.Ethanol inhibits NMDA-induced increases in f ree intracellular in dissociated brain cell[J]. Brain Res,1989, 499(2): 383.[ ZK)〗
, 百拇医药
[2]李明，王峻峰，韩济生，等. 应用Fura-2/AM检测分离的神经细胞内游离 钙及其变化[J].药学学报，1991， 26(11)： 890.
[3]张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方 法[J].中国药学杂志，1991， 26(11)： 655.
[4]高红，冯亦璞. 用Fura-2/AM测定突触体内游离Ca2+浓度及Ca 2+通过激动剂和阻断剂的影响[J]，药学学报，1993,28(6):404.
[5]Tonic D, Frontoni M,Argentino C,et al.Update on calcium ant a gonists in cerebrovascular diseases[J].J Cardiovasc Pharmacol,1991,18(Suppl.8) :S10.
收稿日期：2000-02-22, 百拇医药