胆盐对枯否细胞功能的影响
作者：蔡伟 李非 孙家邦 孙海晨
单位：首都医科大学宣武医院普外科
关键词：枯否细胞；胆盐；功能抑制
首都医科大学学报000417 提要：为了证实梗阻性黄疸时高浓度的胆盐对肝枯否(Kupffer)细胞功能的抑制作用，在分离培养的大鼠高纯度的枯否细胞中加入不同终浓度的胆盐(GCDC)，并分别进行MTT(噻唑蓝)、中性红吞噬及TNF(肿瘤坏死因子)释放的检测。结果表明：当GCDC<25 μmol/L时，对枯否细胞的活性及功能无明显影响；而当GCDC>50 μmol/L时，对枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能均显示出浓度依赖性的抑制作用。提示，胆盐对枯否细胞功能具有抑制作用，可能在梗阻性黄疸的发展过程中起重要作用。
中图分类号：R364.1+7
, http://www.100md.com
Effect of Bile Salt on Function of Kupffer Cells
Cai Wei,Li Fei,Sun Jiabang,Sun Haichen
(Department of General Surgery,Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract:To prove that increased bile salts cause the hepatic resticuloendothelial cell dysfunction,collagenase perfusion of the liver and isopycnic sedimentation in a two-step Percoll gradient were used to isolate Kupffer cells of wistar rats.After a period of culturing,glycochenodeoxycholate(GCDC) of different terminal concentrations was added respectively.Measuring of MTT,neural red phagocytosis and concentrations of TNF in supernatants was examined to determine how GCDC affect the activity,phagocytic function and TNF release of Kupffer cells.When the concentration of GCDC was less than 25 μmol/L,GCDC had little effect on cultured Kupffer cell.But if GCDC concentration was beyond 50 μmol/L，functions of Kupffer cells were inhibited significantly by GCDC in a concentration-dependent manner.Therefore,the inhibiting function of the bile salts to Kupffer cells probably plays an important role in development of obstructive jaundice.
, 百拇医药
Key words:Kupffer cell;bile salt;function inhibition
梗阻性黄疸时，患者易发生内毒素血症和感染性并发症，其原因可能与胆汁淤滞时肝枯否(Kupffer)细胞功能下降有关。 梗阻性黄疸时，血中及肝组织内胆盐(GCDC)浓度增高[1]，因此胆盐可能在枯否细胞功能的下降中起重要的作用。
1998年1～8月，我们应用不同终浓度的胆盐作用于分离培养的大鼠枯否细胞，并进行MTT(噻唑蓝)、中性红吞噬及TNF(肿瘤坏死因子)的检测，对其功能变化进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 枯否细胞的分离培养
参考文献[2，3]方法并稍加改变。将11只雄性Wistar大鼠(体质量250～300 g，首都医科大学动物中心提供)麻醉后，经门静脉置管，应用胶原酶灌注法进行灌注消化，制成全肝细胞悬液。过滤后离心，去除肝细胞，留取沉淀用10 mL PBS重悬。
, 百拇医药
将细胞悬液10 mL加于预置好的25%硅石蚀态悬浮液20 mL及50%硅石蚀态悬浮液15 mL之上，离心后，自上而下可见4条较明显的区带，依次为：细胞碎片、内皮细胞、枯否细胞、少量红细胞及肝细胞沉淀。取富含枯否细胞层，离心沉淀后重悬，台盼蓝染色，细胞存活率>90%，细胞计数并调整细胞数为2×106 mL-1，接种培养。30 min后，洗去未贴壁细胞，继续培养。
1.2 指标测定
滴加GCDCNa到培养细胞的24孔板及96孔板中，对照孔加入 PBS，调整其终浓度分别为：0、25、50、100、200、300 μmol/L，继续培养18 h。
MTT检测：在96孔培养板中每孔加入5 g/L MTT 20 μL，培养4 h，可见孔底有甲瓒生成。加入甲瓒溶解剂二甲基亚砜100 μL， 全自动酶标仪测定其OD值。因MTT能被活细胞还原成蓝色的甲瓒，而死细胞及红细胞没有这种能力，并且活性高的细胞比活性低的细胞产生更多的甲瓒，因此测其OD值，可推测细胞活性的差别。
, 百拇医药
中性红吞噬试验：在96孔培养板每孔加入0.1%中性红生理盐水溶液50 μL，培养1 h后，弃去中性红，PBS洗3次，最后加细胞裂解液100 μL，待细胞全部溶解后，用全自动酶标仪测OD值。根据枯否细胞对中性红的吞噬作用，洗去细胞外的中性红，并将细胞内的中性红释放出来，检测OD值可作为枯否细胞吞噬功能的定量指标。
TNF(肿瘤坏死因子)测定：24孔板每孔加入不同浓度的GCDC及终质量浓度为100 μg/L的LPS(脂多糖)共同培养18 h后，收集上清，离心后再收集上清，应用TNF Elisa 试剂盒(北京邦定生物医学公司提供)进行检测。
1.3 统计学方法
实验数据采用SPSS软件的F检验进行统计分析。
2 结果
GCDC对枯否细胞活性、吞噬及分泌功能的影响见表1。
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由表1看出，当GCDC浓度<25 μmol/L时，对枯否细胞活性及功能无明显影响。而当GCDC的浓度>50 μmol/L时，对枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能均显示出浓度依赖性的抑制作用。综合MTT、中性红吞噬和TNF 3项结果，可以认为50 μmol/L可能是GCDC对枯否细胞有明显毒性作用的临界浓度。
表1 GCDC对枯否细胞活性、吞噬及分泌功能的影响 指标
c(GCDC)/(μmol*L-1)
0(对照)
25
50
100
200
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300
MTT/OD值
1.004±0.055
0.992±0.078
0.976±0.026
0.862±0.095*
0.680±0.078*
0.578±0.055*
中性红吞噬/OD值
0.738±0.021
0.716±0.015
, 百拇医药
0.672±0.030*
0.606±0.043*
0.541±0.077*
0.440±0.071*
ρ(TNF)/(ng*L-1)
464±99
425±86
253±48*
119±14*
70±17*
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57±13*
各组n=11；* 与对照组比较P<0.053 讨论
梗阻性黄疸时枯否细胞功能下降，易引发内毒素血症而增加术后并发症及病死率。其功能受影响的原因尚不完全明确，但近期对胆盐的细胞毒作用的研究日益受到重视。梗阻性黄疸时， 血中胆盐浓度可升高至100～300 μmol/L(通常不超过200 μmol/L)[4]，而肝组织内的浓度可能更高[1]。所以，胆汁淤滞时，浓度升高的胆盐可能在枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能等方面起抑制作用。本研究也证实了高浓度胆盐具有这一抑制作用。
实验中MTT的结果与细胞本身的活性及活细胞数目均有关系。对于梗阻性黄疸时枯否细胞数量变化的研究结果并不一致，但大多数学者的意见并不倾向于数量减少，而是倾向于机能受抑制。故枯否细胞受抑制的原因是因为其本身活性的下降，还是因为其数量减少，或者两者兼而有之，单凭本研究尚难判定。因为本研究只是反映了培养的枯否细胞的总体活性的变化。 枯否细胞是免疫反应中十分活跃的细胞，具有较强的吞噬功能。本实验结果显示：在GCDC浓度达到300 μmol/L后，其吞噬能力下降了约40%。同样在体外动物实验中也表明：梗阻性黄疸时，血清中胆盐浓度升高，枯否细胞的清除率(KCCC)明显下降[5]，从而表明：枯否细胞吞噬功能的下降，可能与胆盐的作用有关。
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TNF主要由肝枯否细胞产生，是内毒素毒性的主要“执行者”[6]。动物实验表明：给大鼠注入致死量的LPS后，应用抗TNF单克隆抗体可明显减低病死率[7]。另有实验表明：低浓度胆盐对内毒素并无明显作用，但可使内毒素刺激产生的TNF明显下降，从而表明胆盐抑制TNF的释放是对细胞直接产生作用而非通过灭活内毒素[8]。Bemelmans等测定了鼠外周血中TNF的水平，结果表明：梗阻性黄疸组血中TNF水平明显高于对照组[9]。这似乎与梗阻性黄疸时胆盐升高抑制TNF释放的结论相矛盾。但本实验只是体外实验，单独研究胆盐因素对TNF释放的抑制作用。而机体内的TNF释放，可能有许多其他因素的参与，如：垂体肾上腺轴、前列腺素、皮质类固醇以及IL-6的负反馈等。目前，对于梗阻性黄疸时细胞因子的产生机制及其作用的研究仍无十分明确的结论，鉴于各种矛盾的结果，还不能对梗阻性黄疸时细胞因子的产生作一个完整的结论。
总之，胆盐对枯否细胞功能的抑制作用，可能在梗阻性黄疸的发展过程中起重要作用。但对胆盐抑制枯否细胞的具体机制尚需进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Greim H,Trulzsch D,Czygan P,et al.Mechanisms of cholestasis.6.Bile acids in human livers with or without biliary obstruction.Gastroenterology,1972,63:837～845
2，Seglen P O.Preparation of liver cells.I.Effects of ions and chelators on tissue dispersion.Exp Cell Res,1973,76:25～30
3，Braet F,Zanger R D,Sasaoki T,et al.Methods in laboratory investigation.Assessment of a method of isolation,purification and cultivation of rat liver sinusoidal endothelial cells.Lab Invest,1994,70(6):944～952
, 百拇医药
4，Raedsch R,Lauterburg G H,Hoffmann A F.Altered bile acid metabolism in primary biliary cirrhosis.Dig Dis Sci,1981,26:395～400
5，Van Bossuyt H,Desmaretz C,Gaeta G B,et al.The role of bile acids in the development of endotoxemia durg obstructive jaundice in the rat.J Hepatol,1990,10(3):274～279
6，Beutler B,Podevin P,Robert A,et al.The endogenous mediator of endotoxin shock.Clin Res,1987,35:192～197
, 百拇医药 7，Beutler B,Milsark I W,Gerami A.Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethel efect of endo toxin.Science,1985,229:869～871
8，Greve J W,Gouma D J,Buurman W A.Bile acids inhibit endotoxin-induced release of tumor necrosis factor by monocytes.Hepatology,1989,10:454～458
9，Bemelmans M H A,Gouma D J,Greve J W,et al.Cytokines tumor necrosis factor and interleukin-6 in experimental biliary obstruction in mice.Hepatology,1992,15:1132～1136
收稿日期：1999-12-29, http://www.100md.com
单位：首都医科大学宣武医院普外科
关键词：枯否细胞；胆盐；功能抑制
首都医科大学学报000417 提要：为了证实梗阻性黄疸时高浓度的胆盐对肝枯否(Kupffer)细胞功能的抑制作用，在分离培养的大鼠高纯度的枯否细胞中加入不同终浓度的胆盐(GCDC)，并分别进行MTT(噻唑蓝)、中性红吞噬及TNF(肿瘤坏死因子)释放的检测。结果表明：当GCDC<25 μmol/L时，对枯否细胞的活性及功能无明显影响；而当GCDC>50 μmol/L时，对枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能均显示出浓度依赖性的抑制作用。提示，胆盐对枯否细胞功能具有抑制作用，可能在梗阻性黄疸的发展过程中起重要作用。
中图分类号：R364.1+7
, http://www.100md.com
Effect of Bile Salt on Function of Kupffer Cells
Cai Wei,Li Fei,Sun Jiabang,Sun Haichen
(Department of General Surgery,Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract:To prove that increased bile salts cause the hepatic resticuloendothelial cell dysfunction,collagenase perfusion of the liver and isopycnic sedimentation in a two-step Percoll gradient were used to isolate Kupffer cells of wistar rats.After a period of culturing,glycochenodeoxycholate(GCDC) of different terminal concentrations was added respectively.Measuring of MTT,neural red phagocytosis and concentrations of TNF in supernatants was examined to determine how GCDC affect the activity,phagocytic function and TNF release of Kupffer cells.When the concentration of GCDC was less than 25 μmol/L,GCDC had little effect on cultured Kupffer cell.But if GCDC concentration was beyond 50 μmol/L，functions of Kupffer cells were inhibited significantly by GCDC in a concentration-dependent manner.Therefore,the inhibiting function of the bile salts to Kupffer cells probably plays an important role in development of obstructive jaundice.
, 百拇医药
Key words:Kupffer cell;bile salt;function inhibition
梗阻性黄疸时，患者易发生内毒素血症和感染性并发症，其原因可能与胆汁淤滞时肝枯否(Kupffer)细胞功能下降有关。 梗阻性黄疸时，血中及肝组织内胆盐(GCDC)浓度增高[1]，因此胆盐可能在枯否细胞功能的下降中起重要的作用。
1998年1～8月，我们应用不同终浓度的胆盐作用于分离培养的大鼠枯否细胞，并进行MTT(噻唑蓝)、中性红吞噬及TNF(肿瘤坏死因子)的检测，对其功能变化进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 枯否细胞的分离培养
参考文献[2，3]方法并稍加改变。将11只雄性Wistar大鼠(体质量250～300 g，首都医科大学动物中心提供)麻醉后，经门静脉置管，应用胶原酶灌注法进行灌注消化，制成全肝细胞悬液。过滤后离心，去除肝细胞，留取沉淀用10 mL PBS重悬。
, 百拇医药
将细胞悬液10 mL加于预置好的25%硅石蚀态悬浮液20 mL及50%硅石蚀态悬浮液15 mL之上，离心后，自上而下可见4条较明显的区带，依次为：细胞碎片、内皮细胞、枯否细胞、少量红细胞及肝细胞沉淀。取富含枯否细胞层，离心沉淀后重悬，台盼蓝染色，细胞存活率>90%，细胞计数并调整细胞数为2×106 mL-1，接种培养。30 min后，洗去未贴壁细胞，继续培养。
1.2 指标测定
滴加GCDCNa到培养细胞的24孔板及96孔板中，对照孔加入 PBS，调整其终浓度分别为：0、25、50、100、200、300 μmol/L，继续培养18 h。
MTT检测：在96孔培养板中每孔加入5 g/L MTT 20 μL，培养4 h，可见孔底有甲瓒生成。加入甲瓒溶解剂二甲基亚砜100 μL， 全自动酶标仪测定其OD值。因MTT能被活细胞还原成蓝色的甲瓒，而死细胞及红细胞没有这种能力，并且活性高的细胞比活性低的细胞产生更多的甲瓒，因此测其OD值，可推测细胞活性的差别。
, 百拇医药
中性红吞噬试验：在96孔培养板每孔加入0.1%中性红生理盐水溶液50 μL，培养1 h后，弃去中性红，PBS洗3次，最后加细胞裂解液100 μL，待细胞全部溶解后，用全自动酶标仪测OD值。根据枯否细胞对中性红的吞噬作用，洗去细胞外的中性红，并将细胞内的中性红释放出来，检测OD值可作为枯否细胞吞噬功能的定量指标。
TNF(肿瘤坏死因子)测定：24孔板每孔加入不同浓度的GCDC及终质量浓度为100 μg/L的LPS(脂多糖)共同培养18 h后，收集上清，离心后再收集上清，应用TNF Elisa 试剂盒(北京邦定生物医学公司提供)进行检测。
1.3 统计学方法
实验数据采用SPSS软件的F检验进行统计分析。
2 结果
GCDC对枯否细胞活性、吞噬及分泌功能的影响见表1。
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由表1看出，当GCDC浓度<25 μmol/L时，对枯否细胞活性及功能无明显影响。而当GCDC的浓度>50 μmol/L时，对枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能均显示出浓度依赖性的抑制作用。综合MTT、中性红吞噬和TNF 3项结果，可以认为50 μmol/L可能是GCDC对枯否细胞有明显毒性作用的临界浓度。
表1 GCDC对枯否细胞活性、吞噬及分泌功能的影响 指标
c(GCDC)/(μmol*L-1)
0(对照)
25
50
100
200
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300
MTT/OD值
1.004±0.055
0.992±0.078
0.976±0.026
0.862±0.095*
0.680±0.078*
0.578±0.055*
中性红吞噬/OD值
0.738±0.021
0.716±0.015
, 百拇医药
0.672±0.030*
0.606±0.043*
0.541±0.077*
0.440±0.071*
ρ(TNF)/(ng*L-1)
464±99
425±86
253±48*
119±14*
70±17*
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57±13*
各组n=11；* 与对照组比较P<0.053 讨论
梗阻性黄疸时枯否细胞功能下降，易引发内毒素血症而增加术后并发症及病死率。其功能受影响的原因尚不完全明确，但近期对胆盐的细胞毒作用的研究日益受到重视。梗阻性黄疸时， 血中胆盐浓度可升高至100～300 μmol/L(通常不超过200 μmol/L)[4]，而肝组织内的浓度可能更高[1]。所以，胆汁淤滞时，浓度升高的胆盐可能在枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能等方面起抑制作用。本研究也证实了高浓度胆盐具有这一抑制作用。
实验中MTT的结果与细胞本身的活性及活细胞数目均有关系。对于梗阻性黄疸时枯否细胞数量变化的研究结果并不一致，但大多数学者的意见并不倾向于数量减少，而是倾向于机能受抑制。故枯否细胞受抑制的原因是因为其本身活性的下降，还是因为其数量减少，或者两者兼而有之，单凭本研究尚难判定。因为本研究只是反映了培养的枯否细胞的总体活性的变化。 枯否细胞是免疫反应中十分活跃的细胞，具有较强的吞噬功能。本实验结果显示：在GCDC浓度达到300 μmol/L后，其吞噬能力下降了约40%。同样在体外动物实验中也表明：梗阻性黄疸时，血清中胆盐浓度升高，枯否细胞的清除率(KCCC)明显下降[5]，从而表明：枯否细胞吞噬功能的下降，可能与胆盐的作用有关。
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TNF主要由肝枯否细胞产生，是内毒素毒性的主要“执行者”[6]。动物实验表明：给大鼠注入致死量的LPS后，应用抗TNF单克隆抗体可明显减低病死率[7]。另有实验表明：低浓度胆盐对内毒素并无明显作用，但可使内毒素刺激产生的TNF明显下降，从而表明胆盐抑制TNF的释放是对细胞直接产生作用而非通过灭活内毒素[8]。Bemelmans等测定了鼠外周血中TNF的水平，结果表明：梗阻性黄疸组血中TNF水平明显高于对照组[9]。这似乎与梗阻性黄疸时胆盐升高抑制TNF释放的结论相矛盾。但本实验只是体外实验，单独研究胆盐因素对TNF释放的抑制作用。而机体内的TNF释放，可能有许多其他因素的参与，如：垂体肾上腺轴、前列腺素、皮质类固醇以及IL-6的负反馈等。目前，对于梗阻性黄疸时细胞因子的产生机制及其作用的研究仍无十分明确的结论，鉴于各种矛盾的结果，还不能对梗阻性黄疸时细胞因子的产生作一个完整的结论。
总之，胆盐对枯否细胞功能的抑制作用，可能在梗阻性黄疸的发展过程中起重要作用。但对胆盐抑制枯否细胞的具体机制尚需进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Greim H,Trulzsch D,Czygan P,et al.Mechanisms of cholestasis.6.Bile acids in human livers with or without biliary obstruction.Gastroenterology,1972,63:837～845
2，Seglen P O.Preparation of liver cells.I.Effects of ions and chelators on tissue dispersion.Exp Cell Res,1973,76:25～30
3，Braet F,Zanger R D,Sasaoki T,et al.Methods in laboratory investigation.Assessment of a method of isolation,purification and cultivation of rat liver sinusoidal endothelial cells.Lab Invest,1994,70(6):944～952
, 百拇医药
4，Raedsch R,Lauterburg G H,Hoffmann A F.Altered bile acid metabolism in primary biliary cirrhosis.Dig Dis Sci,1981,26:395～400
5，Van Bossuyt H,Desmaretz C,Gaeta G B,et al.The role of bile acids in the development of endotoxemia durg obstructive jaundice in the rat.J Hepatol,1990,10(3):274～279
6，Beutler B,Podevin P,Robert A,et al.The endogenous mediator of endotoxin shock.Clin Res,1987,35:192～197
, 百拇医药 7，Beutler B,Milsark I W,Gerami A.Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethel efect of endo toxin.Science,1985,229:869～871
8，Greve J W,Gouma D J,Buurman W A.Bile acids inhibit endotoxin-induced release of tumor necrosis factor by monocytes.Hepatology,1989,10:454～458
9，Bemelmans M H A,Gouma D J,Greve J W,et al.Cytokines tumor necrosis factor and interleukin-6 in experimental biliary obstruction in mice.Hepatology,1992,15:1132～1136
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