重组γ干扰素的表达与纯化
作者：吴玲 牛勃 解军 赵建滨
单位：吴玲(太原市 卫生防疫站查科，太原 030012)；牛勃(山西医科大学生化与分子生物学教研室)；解军(山西医科大学生化与分子生物学教研室)；赵建滨(山西医科大学生化与分子生物学教研室)
关键词：γ干扰素，重组；DNA，重组；克隆，分子
山西医科大学学报000401 摘要：目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达 及 纯化方法，为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用DNA重组 技术把中国人淋巴细胞mRNA反转录产物IFN-γ cDNA克隆到原核表达质粒 pBV220上，构建出 pBVIFN高效表达载体，转化大肠杆菌plyss。通过温度诱导，高效表达IFN-γ cDNA。然后， 经过包涵体溶解、复性、浓缩及DEAE离子交换层析，使γ干扰素纯化。结果 IFN-γ cDNA表达水平占菌体可溶性蛋白的40.4%，包涵体纯度为70%，总生物活 性为1.27×109 U,比活性达1.31×109 U/L蛋白，活性回收率为77.7%。 结论 本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。
, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0289-03
Expression and purification of recombinant interferon-gamma
WU Ling NIU Bo XIE Jun et al
(Taiyuan Hygiene and Antiepidemic S tation,Taiyuan 030012, China)
Abstract:Objective To research interferon -gamma expression and purification methods in E.coli and provide experimenta l ba sis for further lots of production. Methods Using DNA recombinant technolo gy,I FN-γ cDNA,which reversed transcription from Chinese lymphocyte mRAN, was cloned to the prokaryotic expression plasmid pBV220 and was constructed pBVIFN of effic ient expressi on vector, then transferred into E.coli plyass.IFN-γ can be expressed effi cien tly by termoinduction. By the inclusion bodies dissolution, renaturation,concent ration and DEAE ion exchange chromatography IFN-γ was purified. Results Th e IFN-γ expression yield was 40.4% of bacterial soluble proteins. The purifica tion of the inclusion bodise was 70%. The total biological activity was 1.27×1 09 U.The specific activity was 1.31×109 U/L.The activity recovery rate w as 77.7%.Conclusion The experimen t method will lay a foundation for lots of production of the interferon-gamma.
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Key words：interferon-gamma,recombinant; DNA,recombinan t; cloning,molecular
干扰素(interferon)是淋巴细胞分泌的一类功能调节蛋白，具有 抑制病毒复制、抑制细胞增殖及调节机体免疫机能等作用。人，鼠等动物干扰素可分为α、β、γ三 个型别，其中γ干扰素的免疫调节活性及抑制细胞分裂活性远比α、β干扰素为高[1 ] 。利用基因工程技术生产的γ-干扰素在临床治疗中已显示出一定的疗效[2]。
本课题应用RT-PCR技术克隆了中国人IFN-γ cDNA。构建中国人的IFN-γ基因工程菌株，开 展中国人重组IFN-γ的基因工程生产，实现中国人IFN-γ cDNA的高效表达，为替代进口产 品应用于临床具有重要的现实意义。本文就γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化进行了研究 ，现报告如下。
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1 材料与来源
1.1 菌株与质粒 pUC19-IFNγ以pUC19为载体，携带IFN-γ cDNA全序列基因片段。该 序 列由中国人淋巴细胞 mRNA反转录cDNA获得；pBV220为原核表达载体，多克隆位点上游有P RPL启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄抗性；大肠杆菌plyss，适于质粒 pBV220 表达的宿主菌。以上菌种及质粒均由山西医科大学生化与分子生物学教研室保存。
1.2 DNA限制性内切酶EcoRI、PstI、NcoI、BglⅡ等，T4连接酶及其他 试剂购自美国Promega公司。小牛血清白蛋白购于华美生物公司。
2 实验方法
2.1 重组表达质粒pBVIFN的构建及其诱导表达 从克隆载体pUC19上以EcoRI,Pst I双酶切下501碱基片段，经低融点琼脂糖法回收，与表达载体pBV220经EcoRI,PstI 酶切回收，然后用T4连接 酶连接，转化感受态大肠杆菌plyss,小量快速抽提质粒DNA[3]，鉴定阳性重组质粒 。阳性克隆细菌在M9-AMPr 培养液中30 ℃培养到A600=0.45，迅速提 高培养 温度到42 ℃，诱导表达5 h，收集表达菌体，进行基因表达产物测定与生物学活性鉴定。
, 百拇医药
2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 取0.5 ml表达菌体沉淀，经超声破碎后溶于2 × 样品缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.6, 0.4 mol/L 巯基乙醇，40 g/L SDS，体积分数均为0.2的甘油和2 g/L溴酚蓝， 100 ℃煮沸4 min，适量上样电泳，考司亮蓝R-250染色，表达产物在菌体总蛋白中所占比 例由595 nm光密度扫描确定。
2.3 表达产物生物学活性测定 收集表达菌体，经超声破菌后1 200 r/min,15 min离心， 收集包涵体，加入8 mol/L尿素裂解包涵体，用透析法初步复性处理后，采用细胞病变抑制 法[4，5]，在WISH细胞上测定IFN-γ抗病毒活性。
2.4 裂解菌体和包涵体的制备 采用菌体冻融
(-70 ℃)，冰浴超声破碎的方法。每次超声 2 s，间隔2 s，250次，功率350 W，然后10 000 r/min离心20 min，经上述处理的包涵体粗 品用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含100 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA, 3 mol/L尿素及2 g/L Triton X-100的缓冲液洗涤2次，再加脱氧胆酸钠洗涤，制备出所需的包涵体。
, 百拇医药
2.5 包涵体的溶解 溶解包涵体常用的方法是高浓度的尿素或盐酸胍。我们选用8 mol/L 尿素和10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶解变性包涵体。见表1。
2.6 蛋白质的复性 稀释复性是经常采用方法，本实验建立了尿素浓度由8 mol /L4 mol /L1 mol/L
的蛋白质稀释复性程序，并在复性I溶液中加入一定比例的氧化还原 对(谷胱甘肽)。
2.7 复性后蛋白质溶液的浓缩 蛋白质纯化中，采用Sartocon II-Modul膜相对分 子质量为10 000，一般浓缩20倍左右，然后进行SDS-PAGE分析。
表1 包涵体在不同浓度的尿素及DTT下的溶 解情况 序号
尿素浓度
, 百拇医药
(mol/L)
DTT(mmol/L)
包涵体溶解效果
1
6
0
浑浊
2
6
10
浑浊
3
6
, 百拇医药
20
浑浊
4
8
0
浑浊
5
8
10
澄清
6
8
20
澄清
, 百拇医药
7
10
0
浑浊
8
10
10
澄清
9
10
20
澄清
2.8 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析 用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)含有1 mo l/L尿素的缓冲液平衡DEAE柱，上样后用梯度离子缓冲液洗脱，收集各洗脱成分。
, 百拇医药
3 结果
3.1 重组IFN-γ表达质粒的构建与高效诱导表达 从γpUC19-IFN上切下 IFN-γ cDNA 片 段与pBV220接连，构建pBVIFN表达载体，见图1。转化大肠杆菌plyss，快速抽提质粒DNA， 再经EcoRI、PstI及NcoI限制性内切酶酶切图谱鉴定分析，见图2。筛选出含有 正确插入方向IFN-γ cDNA片段的重组体。
图1 重组质粒pBVIFN构建图
A.BglⅡ/NcoI B.EcoR I/PstI C.PstI/NcoI
D.EcoR I E.PstI F.Marker
, 百拇医药
图2 pBVIFNγ重组质粒酶切鉴定图
将阳性菌落接种于LB培养液中，37 ℃培养12 h，次日以2%比例扩种于M9-Am pr培养液中， 待细菌生长至对数期，提高培养温度至42 ℃，诱导表达5 h。经SDS-PAGE结果表明，有特 异表 达产物带，其相对分子量为17 500左右。光密度扫描检测证实该体系可高效表达IFN-γ蛋白 ，其表达量占菌体可溶性蛋白的40.4%，见图3。
3.2 表达产物生物学活性测定 收集表达菌体，经超声破菌、离心、收集包涵 体，用浓度 8mol/L尿素溶液裂解包涵体，通过透析处理后，在96孔板上接入WISH细胞，测定其抗病毒 活性。其结果表明活性滴度为4.7×109 U/L，且呈浓度梯度依赖性。
A markers B.C pBVIFN-γ
, 百拇医药
图3 pBVIFN-γ 大肠杆菌诱导表达后
SDS-PAGE及光密度扫描
3.3 包涵体的纯化 本实验对收集的菌体进行
-20 ℃冻融后超声、离心，采用含Tris-HCl 、NaCl、EDTA、尿素、Triton X-100及脱氧胆酸钠缓冲液洗涤，可得到纯度达70%的包涵体 。
3.4 包涵体溶解与蛋白质复性 包涵体的溶解采用强的蛋白变性剂，如表1，选用8 m ol/L尿素和10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)使包涵体溶解变性。
3.5 复性蛋白质的浓缩与纯化 在蛋白质纯化过程中我们采用Sartocon Ⅱ-Modul膜的相 对分子质量为10 000，一般浓缩20倍。
DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析是一种比较有效的分离纯化手段。重组pIFN-γ质 粒的大肠杆菌产生的γ干扰素经纯化后 ，蛋白质的回收率为15%，但包涵体的纯度达70%，总生物活性1.27×109 U，比活性可 达1.31×109 U/L蛋白，活性回收率为77.7%。
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4 讨论
4.1 本文将pUC19-IFN-γ中的IFN-γ cDNA片段重组到原核表达载体pBV220中，构建了原 核表达载体pIFNγ。我们选用pBV220作为表达载体，其Cits 857抑制子基因与PRPL启动 子同在一个载体上，可以转化任何菌株，使表达产物不易降解。另外，它有最佳的SD序列和 多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白PRPL启动子串联有增 强作用，其受控于温度敏感阻抑物Cits 857的抑制作用，当温度升到42 ℃时，CI蛋白被 破坏，解除对启动子的封闭，使PRPL驱动外源基因转录。这种诱导型表达既有利于产物 高效表达和纯化，又可使细菌免受高浓度异源蛋白的危害。
4.2 在构建表达质粒时，必须鉴定外源基因在重组子中的连接方向，以保证外源基因插入 方向的正确性。通常使用联合酶切的方案，用限制性内切酶一次或分步消化重组子。由于正 、反两个方面的插入将产生不同大小的DNA片段，这些片段可通过凝胶电泳分析即可鉴定， 最后挑选出含有正确插入方向的重组体进行高效表达。
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4.3 包涵体的纯化可用溶菌酶、匀浆、超声等酶学或物理学的方法，使细胞裂解。但是所 得到的包涵体含有较多的杂质，常用去污剂和盐溶液洗涤，使污染的膜蛋白等杂质溶解，得 到含杂质较少的包涵体。本实验用含Triton X-100和脱氧胆酸钠缓冲液洗涤包涵体后，达到 了提纯70%包涵体的目的。
通过逐步降低变性剂的浓度，可使包涵体内的变性蛋白质逐步恢复其天然构型，具有生 物学活性。降低变性剂浓度常采用稀释法、透析法和凝胶过滤法。我们用逐步降低尿素浓 度蛋白质稀释复性程序，同时，为了最大限度促进二硫键的正确配对，在复性溶液中加入 一定配比的谷胱甘肽氧化还原对。
4.4 采用DEAE离子交换时，将所需分离的蛋白质根据其所带电荷量不同，有些被固定相靠 静电引力所吸附，未被吸附的可被洗脱液首先洗脱出来。被吸附的蛋白质由于所带电荷多少 不同，对固定相的亲和力大小也不同，可被梯度离子洗脱液先后洗脱下来。我们利用这一原 理，使同一溶液中的不同物质被分离。
, 百拇医药
4.5 IFN-γ主要来源于T淋巴细胞，因其具有较 强的免疫调节和抗肿瘤的功能而受到人们高度的重视。由于人种间IFN-γ的氨基酸序列的差 异[6]，采用西方人IFN-γ cDNA构建的工程菌株生产的重组产品长期应用于中国病 人可能会引起免疫学反应从而降低药效，因此，实现中国人IFN-γ cDNA的高效表达，进行 重组中国人IFN-γ的基因工程生产具有重要意义。
基金项目：山西省科技攻关项目(94081)
作者简介：吴玲，女，1957年7月生，本科，教授
参考文献:
[1]Rubin BY,Sohan L,Gupta SL. Differential efficacies of human ty pe I and type Ⅱ interferons as antiviral and antiproliferative agents[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77 (10): 5928.
, 百拇医药
[2]Tamura K, Makino S, Araki.Recombinant interferon beta and gamma in the treatment of adult T-cell leukemia[J]. Cancer, 1987, 59 (6): 1059.
[3]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M].北京: 高等教育出版社， 199 3. 107.
[4]张德震，吴淑华，侯云德,等.重组人γ干扰素的纯化[J].病毒学报 ， 1989， 5 (1)： 38.
[5]张德震，金冬雁，吴淑华，等.重组人γ干扰素的纯化及其N端氨基酸序 列分析[J].生物化学杂志， 1991， 7 (1)： 107.
[6]瞿成奎，魏汉东，鱼咏涛，等，中国人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌中的 高 效表达[J].生物化学与生物物理进展， 1995， 22 (5)： 433～435.
收稿日期：2000-03-27, 百拇医药
单位：吴玲(太原市 卫生防疫站查科，太原 030012)；牛勃(山西医科大学生化与分子生物学教研室)；解军(山西医科大学生化与分子生物学教研室)；赵建滨(山西医科大学生化与分子生物学教研室)
关键词：γ干扰素，重组；DNA，重组；克隆，分子
山西医科大学学报000401 摘要：目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达 及 纯化方法，为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用DNA重组 技术把中国人淋巴细胞mRNA反转录产物IFN-γ cDNA克隆到原核表达质粒 pBV220上，构建出 pBVIFN高效表达载体，转化大肠杆菌plyss。通过温度诱导，高效表达IFN-γ cDNA。然后， 经过包涵体溶解、复性、浓缩及DEAE离子交换层析，使γ干扰素纯化。结果 IFN-γ cDNA表达水平占菌体可溶性蛋白的40.4%，包涵体纯度为70%，总生物活 性为1.27×109 U,比活性达1.31×109 U/L蛋白，活性回收率为77.7%。 结论 本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。
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中图分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0289-03
Expression and purification of recombinant interferon-gamma
WU Ling NIU Bo XIE Jun et al
(Taiyuan Hygiene and Antiepidemic S tation,Taiyuan 030012, China)
Abstract:Objective To research interferon -gamma expression and purification methods in E.coli and provide experimenta l ba sis for further lots of production. Methods Using DNA recombinant technolo gy,I FN-γ cDNA,which reversed transcription from Chinese lymphocyte mRAN, was cloned to the prokaryotic expression plasmid pBV220 and was constructed pBVIFN of effic ient expressi on vector, then transferred into E.coli plyass.IFN-γ can be expressed effi cien tly by termoinduction. By the inclusion bodies dissolution, renaturation,concent ration and DEAE ion exchange chromatography IFN-γ was purified. Results Th e IFN-γ expression yield was 40.4% of bacterial soluble proteins. The purifica tion of the inclusion bodise was 70%. The total biological activity was 1.27×1 09 U.The specific activity was 1.31×109 U/L.The activity recovery rate w as 77.7%.Conclusion The experimen t method will lay a foundation for lots of production of the interferon-gamma.
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Key words：interferon-gamma,recombinant; DNA,recombinan t; cloning,molecular
干扰素(interferon)是淋巴细胞分泌的一类功能调节蛋白，具有 抑制病毒复制、抑制细胞增殖及调节机体免疫机能等作用。人，鼠等动物干扰素可分为α、β、γ三 个型别，其中γ干扰素的免疫调节活性及抑制细胞分裂活性远比α、β干扰素为高[1 ] 。利用基因工程技术生产的γ-干扰素在临床治疗中已显示出一定的疗效[2]。
本课题应用RT-PCR技术克隆了中国人IFN-γ cDNA。构建中国人的IFN-γ基因工程菌株，开 展中国人重组IFN-γ的基因工程生产，实现中国人IFN-γ cDNA的高效表达，为替代进口产 品应用于临床具有重要的现实意义。本文就γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化进行了研究 ，现报告如下。
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1 材料与来源
1.1 菌株与质粒 pUC19-IFNγ以pUC19为载体，携带IFN-γ cDNA全序列基因片段。该 序 列由中国人淋巴细胞 mRNA反转录cDNA获得；pBV220为原核表达载体，多克隆位点上游有P RPL启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄抗性；大肠杆菌plyss，适于质粒 pBV220 表达的宿主菌。以上菌种及质粒均由山西医科大学生化与分子生物学教研室保存。
1.2 DNA限制性内切酶EcoRI、PstI、NcoI、BglⅡ等，T4连接酶及其他 试剂购自美国Promega公司。小牛血清白蛋白购于华美生物公司。
2 实验方法
2.1 重组表达质粒pBVIFN的构建及其诱导表达 从克隆载体pUC19上以EcoRI,Pst I双酶切下501碱基片段，经低融点琼脂糖法回收，与表达载体pBV220经EcoRI,PstI 酶切回收，然后用T4连接 酶连接，转化感受态大肠杆菌plyss,小量快速抽提质粒DNA[3]，鉴定阳性重组质粒 。阳性克隆细菌在M9-AMPr 培养液中30 ℃培养到A600=0.45，迅速提 高培养 温度到42 ℃，诱导表达5 h，收集表达菌体，进行基因表达产物测定与生物学活性鉴定。
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2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 取0.5 ml表达菌体沉淀，经超声破碎后溶于2 × 样品缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.6, 0.4 mol/L 巯基乙醇，40 g/L SDS，体积分数均为0.2的甘油和2 g/L溴酚蓝， 100 ℃煮沸4 min，适量上样电泳，考司亮蓝R-250染色，表达产物在菌体总蛋白中所占比 例由595 nm光密度扫描确定。
2.3 表达产物生物学活性测定 收集表达菌体，经超声破菌后1 200 r/min,15 min离心， 收集包涵体，加入8 mol/L尿素裂解包涵体，用透析法初步复性处理后，采用细胞病变抑制 法[4，5]，在WISH细胞上测定IFN-γ抗病毒活性。
2.4 裂解菌体和包涵体的制备 采用菌体冻融
(-70 ℃)，冰浴超声破碎的方法。每次超声 2 s，间隔2 s，250次，功率350 W，然后10 000 r/min离心20 min，经上述处理的包涵体粗 品用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含100 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA, 3 mol/L尿素及2 g/L Triton X-100的缓冲液洗涤2次，再加脱氧胆酸钠洗涤，制备出所需的包涵体。
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2.5 包涵体的溶解 溶解包涵体常用的方法是高浓度的尿素或盐酸胍。我们选用8 mol/L 尿素和10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶解变性包涵体。见表1。
2.6 蛋白质的复性 稀释复性是经常采用方法，本实验建立了尿素浓度由8 mol /L4 mol /L1 mol/L
的蛋白质稀释复性程序，并在复性I溶液中加入一定比例的氧化还原 对(谷胱甘肽)。
2.7 复性后蛋白质溶液的浓缩 蛋白质纯化中，采用Sartocon II-Modul膜相对分 子质量为10 000，一般浓缩20倍左右，然后进行SDS-PAGE分析。
表1 包涵体在不同浓度的尿素及DTT下的溶 解情况 序号
尿素浓度
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(mol/L)
DTT(mmol/L)
包涵体溶解效果
1
6
0
浑浊
2
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10
浑浊
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浑浊
4
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0
浑浊
5
8
10
澄清
6
8
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澄清
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7
10
0
浑浊
8
10
10
澄清
9
10
20
澄清
2.8 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析 用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)含有1 mo l/L尿素的缓冲液平衡DEAE柱，上样后用梯度离子缓冲液洗脱，收集各洗脱成分。
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3 结果
3.1 重组IFN-γ表达质粒的构建与高效诱导表达 从γpUC19-IFN上切下 IFN-γ cDNA 片 段与pBV220接连，构建pBVIFN表达载体，见图1。转化大肠杆菌plyss，快速抽提质粒DNA， 再经EcoRI、PstI及NcoI限制性内切酶酶切图谱鉴定分析，见图2。筛选出含有 正确插入方向IFN-γ cDNA片段的重组体。
图1 重组质粒pBVIFN构建图
A.BglⅡ/NcoI B.EcoR I/PstI C.PstI/NcoI
D.EcoR I E.PstI F.Marker
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图2 pBVIFNγ重组质粒酶切鉴定图
将阳性菌落接种于LB培养液中，37 ℃培养12 h，次日以2%比例扩种于M9-Am pr培养液中， 待细菌生长至对数期，提高培养温度至42 ℃，诱导表达5 h。经SDS-PAGE结果表明，有特 异表 达产物带，其相对分子量为17 500左右。光密度扫描检测证实该体系可高效表达IFN-γ蛋白 ，其表达量占菌体可溶性蛋白的40.4%，见图3。
3.2 表达产物生物学活性测定 收集表达菌体，经超声破菌、离心、收集包涵 体，用浓度 8mol/L尿素溶液裂解包涵体，通过透析处理后，在96孔板上接入WISH细胞，测定其抗病毒 活性。其结果表明活性滴度为4.7×109 U/L，且呈浓度梯度依赖性。
A markers B.C pBVIFN-γ
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图3 pBVIFN-γ 大肠杆菌诱导表达后
SDS-PAGE及光密度扫描
3.3 包涵体的纯化 本实验对收集的菌体进行
-20 ℃冻融后超声、离心，采用含Tris-HCl 、NaCl、EDTA、尿素、Triton X-100及脱氧胆酸钠缓冲液洗涤，可得到纯度达70%的包涵体 。
3.4 包涵体溶解与蛋白质复性 包涵体的溶解采用强的蛋白变性剂，如表1，选用8 m ol/L尿素和10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)使包涵体溶解变性。
3.5 复性蛋白质的浓缩与纯化 在蛋白质纯化过程中我们采用Sartocon Ⅱ-Modul膜的相 对分子质量为10 000，一般浓缩20倍。
DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析是一种比较有效的分离纯化手段。重组pIFN-γ质 粒的大肠杆菌产生的γ干扰素经纯化后 ，蛋白质的回收率为15%，但包涵体的纯度达70%，总生物活性1.27×109 U，比活性可 达1.31×109 U/L蛋白，活性回收率为77.7%。
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4 讨论
4.1 本文将pUC19-IFN-γ中的IFN-γ cDNA片段重组到原核表达载体pBV220中，构建了原 核表达载体pIFNγ。我们选用pBV220作为表达载体，其Cits 857抑制子基因与PRPL启动 子同在一个载体上，可以转化任何菌株，使表达产物不易降解。另外，它有最佳的SD序列和 多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白PRPL启动子串联有增 强作用，其受控于温度敏感阻抑物Cits 857的抑制作用，当温度升到42 ℃时，CI蛋白被 破坏，解除对启动子的封闭，使PRPL驱动外源基因转录。这种诱导型表达既有利于产物 高效表达和纯化，又可使细菌免受高浓度异源蛋白的危害。
4.2 在构建表达质粒时，必须鉴定外源基因在重组子中的连接方向，以保证外源基因插入 方向的正确性。通常使用联合酶切的方案，用限制性内切酶一次或分步消化重组子。由于正 、反两个方面的插入将产生不同大小的DNA片段，这些片段可通过凝胶电泳分析即可鉴定， 最后挑选出含有正确插入方向的重组体进行高效表达。
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4.3 包涵体的纯化可用溶菌酶、匀浆、超声等酶学或物理学的方法，使细胞裂解。但是所 得到的包涵体含有较多的杂质，常用去污剂和盐溶液洗涤，使污染的膜蛋白等杂质溶解，得 到含杂质较少的包涵体。本实验用含Triton X-100和脱氧胆酸钠缓冲液洗涤包涵体后，达到 了提纯70%包涵体的目的。
通过逐步降低变性剂的浓度，可使包涵体内的变性蛋白质逐步恢复其天然构型，具有生 物学活性。降低变性剂浓度常采用稀释法、透析法和凝胶过滤法。我们用逐步降低尿素浓 度蛋白质稀释复性程序，同时，为了最大限度促进二硫键的正确配对，在复性溶液中加入 一定配比的谷胱甘肽氧化还原对。
4.4 采用DEAE离子交换时，将所需分离的蛋白质根据其所带电荷量不同，有些被固定相靠 静电引力所吸附，未被吸附的可被洗脱液首先洗脱出来。被吸附的蛋白质由于所带电荷多少 不同，对固定相的亲和力大小也不同，可被梯度离子洗脱液先后洗脱下来。我们利用这一原 理，使同一溶液中的不同物质被分离。
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4.5 IFN-γ主要来源于T淋巴细胞，因其具有较 强的免疫调节和抗肿瘤的功能而受到人们高度的重视。由于人种间IFN-γ的氨基酸序列的差 异[6]，采用西方人IFN-γ cDNA构建的工程菌株生产的重组产品长期应用于中国病 人可能会引起免疫学反应从而降低药效，因此，实现中国人IFN-γ cDNA的高效表达，进行 重组中国人IFN-γ的基因工程生产具有重要意义。
基金项目：山西省科技攻关项目(94081)
作者简介：吴玲，女，1957年7月生，本科，教授
参考文献:
[1]Rubin BY,Sohan L,Gupta SL. Differential efficacies of human ty pe I and type Ⅱ interferons as antiviral and antiproliferative agents[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77 (10): 5928.
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收稿日期：2000-03-27, 百拇医药