转化生长因子β调节培养的人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌
作者：晏晓明 王晓飞 吴静安
单位：晏晓明 吴静安(100034 北京医科大学第一医院眼科)；王晓飞(博士研究生，现在首都医科大学附属北京同仁医院100730)
关键词：转化生长因子β；基质细胞；角膜成纤维细胞
眼科研究000402 摘要 目的观察转化生长因子β(TGF-β)对培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的调节作用，探讨TGF-β治疗非感染性角膜溃疡的潜在可能性。方法采用酶谱法检测人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌，并观察TGT-β对MMP-2和MMP-9分泌的调节作用。结果培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9，TGF-β抑制MMP-9的活性，且随TGF-β质量浓度增加而增强，随TGF-β作用时间延长而增强；对MMP-2的活性，TGF-β有较弱的促进作用。结论TGF-β作为一种MMP-9的抑制剂，在促进非感染性角膜溃疡愈合方面很有潜力。
, 百拇医药
分类号 R772
TGF-β modulates secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human
corneal keratocytes
Yan Xiaoming Wang Xiaofei Wu Jing’an
(Department of Ophthalmology，the First Hospital，Beijing MedicalUniversity，Beijing 100034)
Abstract ObjectiveTo observe modulation of TGF-β for secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes and investigate the possibility of treatment of non-infectious corneal ulcer with TGF-β.MethodsThe second～third passage cells were seeded at proper density，incubated with TGF-β of different concentration(0，0.1，1，5ng/ml)or for different time(24，48，72h).The supernatants were collected and checked.Zymography was applied to test secretion of MMP-2 and MMP-9 by human corneal keratocytes.To observe the TGF-β’s effect on the secretion，the zymography results were examined by densitometric analysis.ResultsCultured human corneal keratocytes secreted MMP-2 and MMP-9.TGF-β inhibited the activation of MMP-9 and the inhibition was dose-dependent and time-dependent.TGF-β mildly promoted the activation of MMP-2. ConclusionCultured human corneal keratocytes secrete MMP-2 and MMP-9.Being an inhibitor of MMP-9，TGF-β may be very potential in improving the healing of non-infectious corneal ulcer.
, 百拇医药
Key words transforming growth factor-β matrix metalloproteinases corneal fibroblast
在角膜溃疡发生发展过程中，能降解角膜基质细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)起着重要的作用。转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子，能调节多种细胞的生长、分化和移行，参与调节细胞外基质的合成，在伤口愈合中起重要作用。TGF-β可抑制兔角膜基质细胞中MMP-1，MMP-3的表达，对MMP-2表现为促进作用。然而，TGF-β对人角膜基质细胞MMPs表达如何调节尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 细胞来源：体外培养的传2～3代的人角膜基质细胞，处于指数增生期，60%～70%汇合。
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1.2 不同剂量TGF-β作用组样本制备
常规消化细胞，制备单细胞悬液。取24孔板，每孔接种1×105个细胞，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养1天，换用不含FBS的DMEM培养液，同样条件培养1天。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为4组，每组6孔，分别加入DMEM培养液及含0.1，1，5ng/mlTGF-β的DMEM培养液。置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养72h后，收集培养液。
1.3 不同时间TGF-β作用组样本制备
制备单细胞悬液及培养方法同上。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为6组，每组4孔，其中3组加入DMEM培养液为对照组，另3组加入含1ng/mlTGF-β的DMEM培养液为作用组，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。于24，48，72h分别收集1组对照组和1组作用组的培养液。
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1.4 酶谱法
取40μl各组样本培养液，加入10μl上样缓冲液，室温下孵育10min。按预定顺序加样于含明胶的丙烯酰胺凝胶孔中，每孔上样量相同，以80V电压电泳，进入分离胶后，改为100V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部，关闭电源。取下电泳后的丙烯酰胺凝胶，置于100ml 2.5%Triton X-100中，室温轻摇1h。换为显色缓冲液，37℃孵育过夜。固定液固定凝胶3h，考马斯亮蓝R250显色液显色至满意，脱色液脱色。拍摄凝胶照片，留作永久实验记录。取不同样本重复实验3次。取其中典型者进行光密度扫描。
1.5 抑制实验：显色缓冲液中加入10mmol/L EDTA，其他步骤同上。
2 结果
本实验的酶谱结果中可以看到3条带。分别位于相对分子质量为92×103，72×103，68×103处，相应的明胶酶是92×103-明胶酶(MMP-9)，72×103-明胶酶(MMP-2)和MMP-2的活性形式。
, 百拇医药
光密度扫描结果见表1和表2。
根据酶谱法结果和光密度扫描值可以发现(表1，2)：TGF-β可以抑制MMP-9的活性，但对MMP-2的活性则有刺激作用。0.1ng/ml的TGF-β即可明显地抑制MMP-9的活性(约65%)，1ng/ml的 TGF-β对MMP-9活性的抑制作用更为明显(约86%)，而在5ng/ml TGF-β作用的样本中，已经看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎已完全被抑制。TGF-β对MMP-9活性的抑制作用随时间的延长而增强，1ng/mlTGF-β作用1天后，MMP-9的活性约37%被抑制，两天后，87%的活性被抑制，3天后则看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎完全被抑制。
表1 不同质量浓度TGF-β作用后MMP-2，MMP-9的光密度分析
Tab.1 Densitometric analysis of MMP-2 and
, http://www.100md.com
MMP-9 after different dose TGF-β treatment Concentration of TGF-β
(ng/ml)
Densitometric value(Au.mm2)
92×103
72×103
68×103
0(control)
0.29
0.46
, http://www.100md.com 0.26
0.1
0.10
0.55
0.42
1
0.04
0.60
0.48
5
0.49
0.45
表2 TGF-β作用不同时间后MMP-2，MMP-9的光密度分析
, http://www.100md.com
Tab.2 Densitometric analysis of MMP-2 and MMP-9
after TGF-β treatment at different time Time
92×103 Densitometric
72×103 Densitometric
68×103 Densitometric
(h)
value(Au.mm2)
value(Au.mm2)
, 百拇医药
value(Au.mm2)
control
TGF-β
control
TGF-β
control
TGF-β
24
0.81
0.51
0.79
0.86
, http://www.100md.com
0.22
0.39
48
0.90
0.11
0.89
1.07
0.29
0.52
72
0.81
0.87
0.92
, http://www.100md.com
0.31
0.54
对于MMP-2，TGF-β的作用则不同。TGF-β对相对分子质量为72×103 MMP-2的前酶形式和相对分子质量为68×103的活性形式均有一定的刺激作用。各质量浓度TGF-β对MMP-2的刺激作用差别不太明显，对72×103 MMP-2的刺激作用为1.06～1.3倍，1ng/ml的TGF-β作用最明显，可使MMP-2的活性增强1.3倍。我们检测了TGF-β在不同时间对MMP-2的作用发现，第2天时，TGF-β对MMP-2的刺激作用最高，第1天和第3天时仅分别使MMP-2的活性增强至1.06和1.08倍。相对于72×103 MMP-2的前酶形式而言，TGF-β对68×103MMP-2的活性形式的刺激作用要强一些，各质量浓度TGF-β对其刺激作用仍以1ng/ml的TGF-β最为明显(1.84倍)，但与其他质量浓度的作用差别不太明显，各时间点1ng/ml的TGF-β对MMP-2活性形式的作用几乎无变化，为1.74～1.79倍。
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在抑制实验中，显色缓冲液中加入了EDTA，EDTA是一种钙离子螯合剂，能够阻断钙离子的作用，结果凝胶中见不到蛋白分解带，MMP-2，MMP-9的活性完全被抑制。因为MMP是一种钙离子依赖的蛋白分解酶，本抑制实验从另一方面证明了实验中所见到的确系MMP的作用。3 讨论
MMPs是一组由结缔组织细胞分泌，参与细胞外基质降解的蛋白酶，其活性受TIMPs(金属蛋白酶组织抑制因子)的抑制，二者的失衡涉及到正常组织的重塑、创伤愈合、肿瘤转移和许多疾病的发生。MMP-2和MMP-9同属于MMPs中的明胶酶(gelatinase)类，因其主要作用底物为基底膜成分Ⅳ型胶原而在基底膜降解疾病中引入注目。
角膜溃疡以角膜基质细胞外基质成分的大量降解丢失为特征，MMPs在这一过程中起着重要的作用。对角膜溃疡动物模型的研究表明，基质细胞外基质的降解发生在上皮下基底膜消失之后，MMP-9在这一过程中可能起主要作用。MMP-9的过量表达导致了角膜基底膜的降解，控制此酶的过量表达可能会成为阻止角膜溃疡发生的一种有效措施。MMP-2则不同，其主要作用并非促进溃疡发生过程中基底膜的降解，而是在修复组织向正常组织形态转变的重塑过程中起作用[1]。动物研究表明，在角膜溃疡发生过程中，至少有一部分MMP-9是由角膜本身的细胞所分泌的，角膜基质细胞在培养中可分泌MMP-9，为MMP-9的重要来源或重要来源之一，因此角膜成纤维细胞应成为抑制角膜中MMP-9表达的一个重要的切入点[2]。
, 百拇医药
本实验结果中可见到3条蛋白分解带，相对分子质量分别为92×103，72×103，68×103，与MMP-9，MMP-2和MMP-2的活性形式的相对分子质量相当，我们的检测结果与Laura等人在其他组织中的检测结果相似[3]。而当显色缓冲液中加入EDTA时，酶的蛋白分解作用可以被抑制，说明这种酶是一种钙离子依赖的酶。由相对分子质量和抑制实验两方面的证据，说明我们的实验结果中能够降解底物明胶的酶的确是MMP-2和MMP-9，而非其他蛋白酶，也就是说传代培养的人角膜细胞能够分泌MMP-2和MMP-9。
既往对兔角膜基质细胞的研究表明，原代培养的兔角膜基质细胞仅分泌MMP-2，不分泌MMP-9，而传代后这种情况会发生改变，传代的兔角膜基质细胞不仅分泌MMP-2，还能分泌MMP-9[4]。本研究中实验对象为传代的人角膜基质细胞，结果表明，传代培养的人角膜基质细胞也可分泌两种明胶酶，MMP-2和MMP-9。正常人角膜组织中仅能检测到MMP-2的分泌，传代培养的人角膜基质细胞与正常角膜组织间这种明胶酶分泌能力的不同，可能正是体内静止的角膜细胞激活后发生的改变的反映。
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本实验还利用此方法对TGF-β对人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的作用做了一定程度的定量分析，Fini等学者曾研究TGF-β对原代培养的兔角膜细胞分泌MMP-2的作用，结果表明，TGF-β对MMP-2的分泌有一定的促进作用[5]，但该研究中实验对象为原代培养的细胞，不能恰当地反映角膜基质细胞激活后的生物学改变，并且人与兔角膜基质细胞对TGF-β作用的反应可能会具有一定的种属差异，所以在本实验中，我们采用传代培养的人角膜基质细胞为实验对象，以期准确地反映TGF-β对于激活的人角膜基质细胞分泌明胶酶的能力的作用究竟如何。
将本实验的酶谱结果进行光密度扫描可见：TGF-β可抑制人角膜基质细胞分泌MMP-9，这种作用随TGF-β质量浓度的升高而增强，随着TGF-β作用时间的延长也逐渐增强。但TGF-β对人角膜基质细胞分泌明胶酶的作用是双向性的，对MMP-2与对MMP-9的作用相反，表现为一定程度的促进作用，并且TGF-β的质量浓度和作用时间对这种作用的影响较小。且TGF-β对MMP-2的前酶形式和活性形式的作用又有不同，TGF-β对72×103 MMP-2的作用甚小，质量浓度为1ng/ml的TGF-β作用最强，仅使其活性增加至1.3倍，而0.1ng/ml和5ng/ml仅使其活性增加至1.19倍和1.06倍，相对而言，TGF-β对68×103 MMP-2的活性形式作用较为明显，各质量浓度的作用平均为1.72倍，1ng/ml的TGF-β在各时间点的作用平均为1.76倍。我们分析其原因可能与MMP-2特殊的激活机制有关[6]，MMP-2与MMPs家族中其他成员不同，其他MMP的激活剂如纤溶酶，胰蛋白酶等不能激活MMP-2，但TGF-β则是有限的几种能够激活MMP-2的物质之一，所以，本实验中检到的MMP-2活性形式的增加也许是因为TGF-β激活了MMP-2，从而主要表现为活性MMP-2的增加。
, 百拇医药
TGF-β对角膜基质细胞MMP-9的抑制作用有可能阻止MMP-9对基底膜的降解，从而阻止溃疡的发生，而TGF-β对MMP-2的一定程度的促进作用可能对基底膜降解并无明显的作用，因为MMP-2是一种主要在组织重塑过程中起作用的酶。TGF-β的这种对于明胶酶的双向作用可能是使角膜基质细胞对MMP的表达趋向于正常组织的表达方式：仅表达MMP-2，不表达MMP-9，在一些疾病如角膜溃疡中，可能正是因为TGF-β的缺乏才造成了MMP的异常表达方式，导致疾病发生[5]。
本课题受教育部留学回国人员科研启动基金资助
参考文献：
1.Fini ME，Girard MT，Matsubara M.Collagenolytic/gelatinolytic enzymes in corneal wound healing.Acta Ophthalmol.1992，70(Suppl)∶ 26
, 百拇医药
2.Fini ME，Parks WC，Rinehart WB，et al.Role of matrix metalloproteinases in failure to re-epithelizlize after corneal injury.Am J Pathol，1996，149∶1287
3.Laura Bc，Ineke DCJ，Docherty AJP，et al.Gelatinase A (MMP-2) and cysteine proteinase are essential for the degeneration of collagenin soft connective tissue.Matrix Biology，1998，17∶ 35
4.Fini ME，Girard MT.The pattern of metalloproteinase expression by corneal fibroblasts is altered with passage in cell culture.J Cell Sci，1990，97∶ 373
, http://www.100md.com
5.Girard MT，Matsubara M，Fini ME.Transforming growth factor-β and interleukin-1 modulate metalloproteinase expression by corneal stromal cells.Invest Ophthalmol Vis Sc，1991，32∶ 2441
6.Murphy G，Docherty AJP.The matrix metalloproteinases and their inhibitors.Am J Respir Cell Mol Biol，1992，7∶ 120
收稿：1999- 6-30
修回：2000-05-06, 百拇医药
单位：晏晓明 吴静安(100034 北京医科大学第一医院眼科)；王晓飞(博士研究生，现在首都医科大学附属北京同仁医院100730)
关键词：转化生长因子β；基质细胞；角膜成纤维细胞
眼科研究000402 摘要 目的观察转化生长因子β(TGF-β)对培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的调节作用，探讨TGF-β治疗非感染性角膜溃疡的潜在可能性。方法采用酶谱法检测人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌，并观察TGT-β对MMP-2和MMP-9分泌的调节作用。结果培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9，TGF-β抑制MMP-9的活性，且随TGF-β质量浓度增加而增强，随TGF-β作用时间延长而增强；对MMP-2的活性，TGF-β有较弱的促进作用。结论TGF-β作为一种MMP-9的抑制剂，在促进非感染性角膜溃疡愈合方面很有潜力。
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分类号 R772
TGF-β modulates secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human
corneal keratocytes
Yan Xiaoming Wang Xiaofei Wu Jing’an
(Department of Ophthalmology，the First Hospital，Beijing MedicalUniversity，Beijing 100034)
Abstract ObjectiveTo observe modulation of TGF-β for secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes and investigate the possibility of treatment of non-infectious corneal ulcer with TGF-β.MethodsThe second～third passage cells were seeded at proper density，incubated with TGF-β of different concentration(0，0.1，1，5ng/ml)or for different time(24，48，72h).The supernatants were collected and checked.Zymography was applied to test secretion of MMP-2 and MMP-9 by human corneal keratocytes.To observe the TGF-β’s effect on the secretion，the zymography results were examined by densitometric analysis.ResultsCultured human corneal keratocytes secreted MMP-2 and MMP-9.TGF-β inhibited the activation of MMP-9 and the inhibition was dose-dependent and time-dependent.TGF-β mildly promoted the activation of MMP-2. ConclusionCultured human corneal keratocytes secrete MMP-2 and MMP-9.Being an inhibitor of MMP-9，TGF-β may be very potential in improving the healing of non-infectious corneal ulcer.
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Key words transforming growth factor-β matrix metalloproteinases corneal fibroblast
在角膜溃疡发生发展过程中，能降解角膜基质细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)起着重要的作用。转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子，能调节多种细胞的生长、分化和移行，参与调节细胞外基质的合成，在伤口愈合中起重要作用。TGF-β可抑制兔角膜基质细胞中MMP-1，MMP-3的表达，对MMP-2表现为促进作用。然而，TGF-β对人角膜基质细胞MMPs表达如何调节尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 细胞来源：体外培养的传2～3代的人角膜基质细胞，处于指数增生期，60%～70%汇合。
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1.2 不同剂量TGF-β作用组样本制备
常规消化细胞，制备单细胞悬液。取24孔板，每孔接种1×105个细胞，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养1天，换用不含FBS的DMEM培养液，同样条件培养1天。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为4组，每组6孔，分别加入DMEM培养液及含0.1，1，5ng/mlTGF-β的DMEM培养液。置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养72h后，收集培养液。
1.3 不同时间TGF-β作用组样本制备
制备单细胞悬液及培养方法同上。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为6组，每组4孔，其中3组加入DMEM培养液为对照组，另3组加入含1ng/mlTGF-β的DMEM培养液为作用组，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。于24，48，72h分别收集1组对照组和1组作用组的培养液。
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1.4 酶谱法
取40μl各组样本培养液，加入10μl上样缓冲液，室温下孵育10min。按预定顺序加样于含明胶的丙烯酰胺凝胶孔中，每孔上样量相同，以80V电压电泳，进入分离胶后，改为100V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部，关闭电源。取下电泳后的丙烯酰胺凝胶，置于100ml 2.5%Triton X-100中，室温轻摇1h。换为显色缓冲液，37℃孵育过夜。固定液固定凝胶3h，考马斯亮蓝R250显色液显色至满意，脱色液脱色。拍摄凝胶照片，留作永久实验记录。取不同样本重复实验3次。取其中典型者进行光密度扫描。
1.5 抑制实验：显色缓冲液中加入10mmol/L EDTA，其他步骤同上。
2 结果
本实验的酶谱结果中可以看到3条带。分别位于相对分子质量为92×103，72×103，68×103处，相应的明胶酶是92×103-明胶酶(MMP-9)，72×103-明胶酶(MMP-2)和MMP-2的活性形式。
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光密度扫描结果见表1和表2。
根据酶谱法结果和光密度扫描值可以发现(表1，2)：TGF-β可以抑制MMP-9的活性，但对MMP-2的活性则有刺激作用。0.1ng/ml的TGF-β即可明显地抑制MMP-9的活性(约65%)，1ng/ml的 TGF-β对MMP-9活性的抑制作用更为明显(约86%)，而在5ng/ml TGF-β作用的样本中，已经看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎已完全被抑制。TGF-β对MMP-9活性的抑制作用随时间的延长而增强，1ng/mlTGF-β作用1天后，MMP-9的活性约37%被抑制，两天后，87%的活性被抑制，3天后则看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎完全被抑制。
表1 不同质量浓度TGF-β作用后MMP-2，MMP-9的光密度分析
Tab.1 Densitometric analysis of MMP-2 and
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MMP-9 after different dose TGF-β treatment Concentration of TGF-β
(ng/ml)
Densitometric value(Au.mm2)
92×103
72×103
68×103
0(control)
0.29
0.46
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0.1
0.10
0.55
0.42
1
0.04
0.60
0.48
5
0.49
0.45
表2 TGF-β作用不同时间后MMP-2，MMP-9的光密度分析
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Tab.2 Densitometric analysis of MMP-2 and MMP-9
after TGF-β treatment at different time Time
92×103 Densitometric
72×103 Densitometric
68×103 Densitometric
(h)
value(Au.mm2)
value(Au.mm2)
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value(Au.mm2)
control
TGF-β
control
TGF-β
control
TGF-β
24
0.81
0.51
0.79
0.86
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0.22
0.39
48
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0.11
0.89
1.07
0.29
0.52
72
0.81
0.87
0.92
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0.31
0.54
对于MMP-2，TGF-β的作用则不同。TGF-β对相对分子质量为72×103 MMP-2的前酶形式和相对分子质量为68×103的活性形式均有一定的刺激作用。各质量浓度TGF-β对MMP-2的刺激作用差别不太明显，对72×103 MMP-2的刺激作用为1.06～1.3倍，1ng/ml的TGF-β作用最明显，可使MMP-2的活性增强1.3倍。我们检测了TGF-β在不同时间对MMP-2的作用发现，第2天时，TGF-β对MMP-2的刺激作用最高，第1天和第3天时仅分别使MMP-2的活性增强至1.06和1.08倍。相对于72×103 MMP-2的前酶形式而言，TGF-β对68×103MMP-2的活性形式的刺激作用要强一些，各质量浓度TGF-β对其刺激作用仍以1ng/ml的TGF-β最为明显(1.84倍)，但与其他质量浓度的作用差别不太明显，各时间点1ng/ml的TGF-β对MMP-2活性形式的作用几乎无变化，为1.74～1.79倍。
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在抑制实验中，显色缓冲液中加入了EDTA，EDTA是一种钙离子螯合剂，能够阻断钙离子的作用，结果凝胶中见不到蛋白分解带，MMP-2，MMP-9的活性完全被抑制。因为MMP是一种钙离子依赖的蛋白分解酶，本抑制实验从另一方面证明了实验中所见到的确系MMP的作用。3 讨论
MMPs是一组由结缔组织细胞分泌，参与细胞外基质降解的蛋白酶，其活性受TIMPs(金属蛋白酶组织抑制因子)的抑制，二者的失衡涉及到正常组织的重塑、创伤愈合、肿瘤转移和许多疾病的发生。MMP-2和MMP-9同属于MMPs中的明胶酶(gelatinase)类，因其主要作用底物为基底膜成分Ⅳ型胶原而在基底膜降解疾病中引入注目。
角膜溃疡以角膜基质细胞外基质成分的大量降解丢失为特征，MMPs在这一过程中起着重要的作用。对角膜溃疡动物模型的研究表明，基质细胞外基质的降解发生在上皮下基底膜消失之后，MMP-9在这一过程中可能起主要作用。MMP-9的过量表达导致了角膜基底膜的降解，控制此酶的过量表达可能会成为阻止角膜溃疡发生的一种有效措施。MMP-2则不同，其主要作用并非促进溃疡发生过程中基底膜的降解，而是在修复组织向正常组织形态转变的重塑过程中起作用[1]。动物研究表明，在角膜溃疡发生过程中，至少有一部分MMP-9是由角膜本身的细胞所分泌的，角膜基质细胞在培养中可分泌MMP-9，为MMP-9的重要来源或重要来源之一，因此角膜成纤维细胞应成为抑制角膜中MMP-9表达的一个重要的切入点[2]。
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本实验结果中可见到3条蛋白分解带，相对分子质量分别为92×103，72×103，68×103，与MMP-9，MMP-2和MMP-2的活性形式的相对分子质量相当，我们的检测结果与Laura等人在其他组织中的检测结果相似[3]。而当显色缓冲液中加入EDTA时，酶的蛋白分解作用可以被抑制，说明这种酶是一种钙离子依赖的酶。由相对分子质量和抑制实验两方面的证据，说明我们的实验结果中能够降解底物明胶的酶的确是MMP-2和MMP-9，而非其他蛋白酶，也就是说传代培养的人角膜细胞能够分泌MMP-2和MMP-9。
既往对兔角膜基质细胞的研究表明，原代培养的兔角膜基质细胞仅分泌MMP-2，不分泌MMP-9，而传代后这种情况会发生改变，传代的兔角膜基质细胞不仅分泌MMP-2，还能分泌MMP-9[4]。本研究中实验对象为传代的人角膜基质细胞，结果表明，传代培养的人角膜基质细胞也可分泌两种明胶酶，MMP-2和MMP-9。正常人角膜组织中仅能检测到MMP-2的分泌，传代培养的人角膜基质细胞与正常角膜组织间这种明胶酶分泌能力的不同，可能正是体内静止的角膜细胞激活后发生的改变的反映。
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本实验还利用此方法对TGF-β对人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的作用做了一定程度的定量分析，Fini等学者曾研究TGF-β对原代培养的兔角膜细胞分泌MMP-2的作用，结果表明，TGF-β对MMP-2的分泌有一定的促进作用[5]，但该研究中实验对象为原代培养的细胞，不能恰当地反映角膜基质细胞激活后的生物学改变，并且人与兔角膜基质细胞对TGF-β作用的反应可能会具有一定的种属差异，所以在本实验中，我们采用传代培养的人角膜基质细胞为实验对象，以期准确地反映TGF-β对于激活的人角膜基质细胞分泌明胶酶的能力的作用究竟如何。
将本实验的酶谱结果进行光密度扫描可见：TGF-β可抑制人角膜基质细胞分泌MMP-9，这种作用随TGF-β质量浓度的升高而增强，随着TGF-β作用时间的延长也逐渐增强。但TGF-β对人角膜基质细胞分泌明胶酶的作用是双向性的，对MMP-2与对MMP-9的作用相反，表现为一定程度的促进作用，并且TGF-β的质量浓度和作用时间对这种作用的影响较小。且TGF-β对MMP-2的前酶形式和活性形式的作用又有不同，TGF-β对72×103 MMP-2的作用甚小，质量浓度为1ng/ml的TGF-β作用最强，仅使其活性增加至1.3倍，而0.1ng/ml和5ng/ml仅使其活性增加至1.19倍和1.06倍，相对而言，TGF-β对68×103 MMP-2的活性形式作用较为明显，各质量浓度的作用平均为1.72倍，1ng/ml的TGF-β在各时间点的作用平均为1.76倍。我们分析其原因可能与MMP-2特殊的激活机制有关[6]，MMP-2与MMPs家族中其他成员不同，其他MMP的激活剂如纤溶酶，胰蛋白酶等不能激活MMP-2，但TGF-β则是有限的几种能够激活MMP-2的物质之一，所以，本实验中检到的MMP-2活性形式的增加也许是因为TGF-β激活了MMP-2，从而主要表现为活性MMP-2的增加。
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TGF-β对角膜基质细胞MMP-9的抑制作用有可能阻止MMP-9对基底膜的降解，从而阻止溃疡的发生，而TGF-β对MMP-2的一定程度的促进作用可能对基底膜降解并无明显的作用，因为MMP-2是一种主要在组织重塑过程中起作用的酶。TGF-β的这种对于明胶酶的双向作用可能是使角膜基质细胞对MMP的表达趋向于正常组织的表达方式：仅表达MMP-2，不表达MMP-9，在一些疾病如角膜溃疡中，可能正是因为TGF-β的缺乏才造成了MMP的异常表达方式，导致疾病发生[5]。
本课题受教育部留学回国人员科研启动基金资助
参考文献：
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2.Fini ME，Parks WC，Rinehart WB，et al.Role of matrix metalloproteinases in failure to re-epithelizlize after corneal injury.Am J Pathol，1996，149∶1287
3.Laura Bc，Ineke DCJ，Docherty AJP，et al.Gelatinase A (MMP-2) and cysteine proteinase are essential for the degeneration of collagenin soft connective tissue.Matrix Biology，1998，17∶ 35
4.Fini ME，Girard MT.The pattern of metalloproteinase expression by corneal fibroblasts is altered with passage in cell culture.J Cell Sci，1990，97∶ 373
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5.Girard MT，Matsubara M，Fini ME.Transforming growth factor-β and interleukin-1 modulate metalloproteinase expression by corneal stromal cells.Invest Ophthalmol Vis Sc，1991，32∶ 2441
6.Murphy G，Docherty AJP.The matrix metalloproteinases and their inhibitors.Am J Respir Cell Mol Biol，1992，7∶ 120
收稿：1999- 6-30
修回：2000-05-06, 百拇医药