长期运动对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物的影响
作者：陈彩珍 卢健 许豪文
单位：陈彩珍 卢健(广州体育学院，广东广州510075)；许豪文(华东师范大学)
关键词：运动训练；骨骼肌线粒体；复合物I；复合物IV
现代康复000431
摘要：目的：研究长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物I和复合物Ⅳ活性的影响，并探讨其机制。方法：以C57BL/6J雄性小鼠跑转笼为运动方式，通过分光光度法和极谱氧电极法测定线粒体复合物I和复合物Ⅳ的活性。结果：随着小鼠年龄的增长，骨骼肌线粒体复合物I(NADH脱氢酶)活性显著下降，复合物IV(细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物I及复合物IV活性明显升高，显著高于同龄对照鼠甚至高于5月龄鼠。结论：运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。
, 百拇医药
中图分类号：R339.4 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)04-0568-02
Effects of long- term physical activity on complex of skeletal muscle mitochondria of old mice
CHEN Cai zhen，LU Jian，XU Hao wen
(Guangzhou Institute of Physical Education,Guangzhou 510076,China)
Abstract Objective:To observe the effects of long term physical activity (running wheel) on the age- related changes of complex I and IV activities of mice skeletal muscle mitochondria. Methods:The activity level of complex I and complex Ⅳ of 10 elderly training mice,10 elder non- training mice and 10 young mice was obtained by spectrophotography and polarography.Result: The complex I activity decreased with age, and complex IV activity was not influenced. After 8 months physical training, the activities of complex I and IV increased.Conclusion:The adaptive changes of mitochondria were brought by long term physical activity which might delay the age- related decline of mitochondrial function.
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Key words physical activity;skeletal muscle mitochondria; complex I; complex IV
线粒体DNAmtDNA编码的复合物I和IV的活性随增龄而下降明显，但长期运动对复合物I和IV的研究报道很少。本文以C57BL/6J雄性小鼠跑转笼为运动方式，研究了从5月龄开始进行为期8个月的长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物I和复合物IV活性的影响。
1资料和方法
1.1实验动物运动模型的建立本研究选择30只近交系C57BL/6J雄性小鼠为实验对象，2月龄小鼠购自第一军医大学实验动物中心。小鼠5月龄后随机取10只处死进行相关指标的测试，此组为5月龄鼠。随机取10只开始运动训练，训练的方式为跑转笼(runningwheel)，将小鼠放进直径为17cm的带轴承转笼，让其主动跑笼，第1天跑10min，以后每天增加10min，直至每天1h，自动记录跑笼圈数。每天跑笼1h，每周5d，所有运动训练均在动物暗周期6pm～10pm完成，剩余10只对照组在相同时间放进转笼，但转笼固定不动。8个月后均达13月龄。
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1.2主要试剂和仪器NADH、细胞色素C、抗坏血酸钠均购自Sigma试剂公司，其余试剂均为国产分析纯。主要仪器有：731紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，氧电极(上海植物生理研究所)，记录仪(上海市大华仪表厂)。
1.3实验方法
1.3.1小鼠骨骼肌线粒体的制备将小鼠断头处死取腓肠肌，剪碎后电动匀浆器匀浆，差速离心分离线粒体。分离介质为0.25mol/L蔗糖，1mmol/LEDTA，5mmol/LTris-HCl(pH7.4)。所有操作均在4℃以下进行。
1.3.2线粒体复合物I活性的测定参考Schneider[1]的方法。反应体系中含Tris-Hcl缓冲液(pH7.5)，10mmol/L正铁氰化钾，15nmol/LNADH，记录410nm处吸光度的下降值。酶活性以每毫克蛋白计算，摩尔消光系数为1030。
, http://www.100md.com 1.3.3线粒体复合物IV活性的测定通过极谱氧电极法测定密闭反应体系中氧饱和度的变化，确定氧的消耗量，以计算样品中酶的活性。反应体积1.6ml，25℃恒温，反应介质为10mmol/L磷酸钠，pH7.4，4.5mmol/L抗坏血酸，2.7mmol/L四甲基-对苯二胺盐酸盐(TEMPD)，1mmol/L细胞色素C。开动磁力搅拌器,待平衡后将线粒体悬液注入反应室,记录仪曲线下降，根据记录仪走纸的格数来计算酶的活力，酶活力以每秒内每分子细胞色素C转移的电子数(e-/s.hemea)为单位。
1.3.4统计处理所有实验数据由Excel统计软件处理，以x±s表示，t检验。
2结果
结果表明，对照组随着小鼠年龄的增长，骨骼肌线粒体复合物I(NADH脱氢酶)活性显著下降，复合物IV(细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物I及复合物IV活性明显升高，显著高于同龄对照鼠甚至高于5月龄鼠。见表1。
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表1 运动训练对小鼠骨骼肌线华粒体复合物I及复合物IV活性的影响
5月龄鼠
13月龄运动鼠
13月龄对照鼠
复合物I
0.3187±0.1275
0.3878±0.1249*#
0.2686±0.1232
复合物IV
0.0934±0.366
0.1202±0.0408*#
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0.0931±0.0120
3讨论
研究证实线粒体呼吸链上的某些酶是由线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)共同编码的。由于mtDNA特殊的结构特点及所处的位置(线粒体内膜，自由基产生的主要来源)所以mtDNA很容易受到自由基损伤，又缺乏较完善的修复机制，从而引起损伤积累，造成呼吸链酶的缺陷，影响氧化磷酸化功能[2,3],许多研究证实，mtDNA突变随增龄而升高，氧化磷酸化能力随增龄而下降。许多研究表明，线粒体的老化是细胞衰老的重要原因之一，随着年龄的增加，线粒体结构和功能出现异常，由线粒体功能下降引起的细胞能量缺损可能消弱细胞活性和细胞适应各种生理应激的能力。缺血性实验对线粒体呼吸链活性的影响发现，复合物I为最脆弱部分。有实验表明，在衰老进程中，横纹肌中细胞色素氧化酶活性显著下降[4]。该酶活性下降与线粒体产生的氧化物的增加相关。进一步的研究检测发现线粒体细胞色素氧化酶进行性和随机的丧失与年龄相关的线粒体RNA合成的下降有密切关系。NADH脱氢酶有7个亚单位是由线粒体DNA(mtDNA)编码的，占总的蛋白质编码区的59.2%，复合物IV的3个亚单位占24.4%也是由mtDNA编码的[5]。由于mtDNA在胞内的位置及其结构特性，决定了它易受线粒体氧化还原反应产生的氧自由基的攻击，引起mtDNA的突变。尤其是随着年龄的增长，组织中抗氧化剂随增龄而减少时，体内积累的氧化损伤作用即可导致线粒体和mtDNA的变异，从而使氧化磷酸化反应减退。氧化磷酸化缺陷时，可严重威胁各种器官和组织的能量需求和正常运转，从而产生临床症状和老化相关性疾病。也正基于此，Wallace等提出了mtDNA突变导致衰老和老年退化病的假说[6]。
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近期有关运动与衰老的研究表明，运动训练可提高衰老大鼠线粒体基质酶及呼吸酶活性[7,8]。Tate等人的研究表明衰老大鼠心肌细胞色素氧化酶活性与成年大鼠相比明显下降，8～10周跑台训练后，该酶活性显著提高[8]。衰老个体线粒体酶活性的提高直接反映了线粒体功能的改善。本研究通过对小鼠长达8个月的训练，发现长期有氧运动对骨骼肌线粒体复合物I活性无影响，但却使复合物IV活性明显升高。由此可见，运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。根据本实验室对骨骼肌线粒体抗氧化能力的研究结果(另文发表)分析，长期运动训练通过诱导抗氧化酶活性的升高，及时清除氧自由基，减少其对生物大分子如核酸、蛋白质及脂类的氧化损伤，mtDNA结构的完整有利于其编码的酶活性的表达。有实验发现，骨骼肌线粒体呼吸链活性随增龄而逐渐下降，mtDNA突变率却逐渐升高，推测体细胞随增龄而出现mtDNA突变是呼吸链酶活性下降的可能原因之一。运动训练可提高mtDNA编码的mRNA(细胞色素b，复合物IV亚单位I，复合物I亚单位ND6，16sRNA)及核DNA编码的mRNA(复合物IV亚单位IV，琥珀酸脱氢酶)。Tate等报道老年大鼠心肌细胞色素氧化酶mRNA含量下降，运动训练后细胞色素氧化酶mRNA含量升高，与老年大鼠训练前后细胞色素氧化酶活性变化一致[8]。适量的运动训练是否通过抗氧化酶活性的适应性增强而保护线粒体DNA结构，保障线粒体功能较完好的发挥，从而延缓衰老过程中相应功能能力的衰退，其确切机制还需进一步深入研究。
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作者简介：陈彩珍(1967-)，女，福建人，博士，实验中心主任。研究方向：运动训练的生物化学。
参 考 文 献
[1]Schneider H. Liposome- mitochondrial inner membrane fusion[J].J Biol Chem,1980,255:3748
[2]Shigenega M K, Hagen T M, Ames B N. Oxidative damage and mito chondrial decay in aging[J].Proc Natl Acad Sci， 1994,91:10 771～10 778
[3]Shadel G S. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates[J].Anne Rev Biochem, 1997,66:409～ 435
, 百拇医药
[4]Hansford R G. Bioenergetics in aging[J].Biochem Biophys Acta, 1983,726:41
[5]Ozawa T. Genetic and functional changes in mitochondria associated with aging[J]. Physiol Rev, 1997,77:425～ 464
[6]Wallance D C. Mitochondrial genetics: A paradigm for aging and de generative diseases?[J].Science, 1992,236:628～ 636
[7]Ji LL. Myocardial aging:antioxidant enzymes and related biochemical properties[J].Am J Physiol,1991,261:R386～ R392
[8]Tata CA, Helgason T, Hyek MF,et al. SERCA2a and mitochondrial cytochrome oxidase expression are increased in heart of exercise-trained oldrats[J].Am J Physiol, 1996,271(Heart Circ. Physiol.40):H68～H 72
收稿：2000-01-12, http://www.100md.com
单位：陈彩珍 卢健(广州体育学院，广东广州510075)；许豪文(华东师范大学)
关键词：运动训练；骨骼肌线粒体；复合物I；复合物IV
现代康复000431
摘要：目的：研究长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物I和复合物Ⅳ活性的影响，并探讨其机制。方法：以C57BL/6J雄性小鼠跑转笼为运动方式，通过分光光度法和极谱氧电极法测定线粒体复合物I和复合物Ⅳ的活性。结果：随着小鼠年龄的增长，骨骼肌线粒体复合物I(NADH脱氢酶)活性显著下降，复合物IV(细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物I及复合物IV活性明显升高，显著高于同龄对照鼠甚至高于5月龄鼠。结论：运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。
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中图分类号：R339.4 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)04-0568-02
Effects of long- term physical activity on complex of skeletal muscle mitochondria of old mice
CHEN Cai zhen，LU Jian，XU Hao wen
(Guangzhou Institute of Physical Education,Guangzhou 510076,China)
Abstract Objective:To observe the effects of long term physical activity (running wheel) on the age- related changes of complex I and IV activities of mice skeletal muscle mitochondria. Methods:The activity level of complex I and complex Ⅳ of 10 elderly training mice,10 elder non- training mice and 10 young mice was obtained by spectrophotography and polarography.Result: The complex I activity decreased with age, and complex IV activity was not influenced. After 8 months physical training, the activities of complex I and IV increased.Conclusion:The adaptive changes of mitochondria were brought by long term physical activity which might delay the age- related decline of mitochondrial function.
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Key words physical activity;skeletal muscle mitochondria; complex I; complex IV
线粒体DNAmtDNA编码的复合物I和IV的活性随增龄而下降明显，但长期运动对复合物I和IV的研究报道很少。本文以C57BL/6J雄性小鼠跑转笼为运动方式，研究了从5月龄开始进行为期8个月的长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物I和复合物IV活性的影响。
1资料和方法
1.1实验动物运动模型的建立本研究选择30只近交系C57BL/6J雄性小鼠为实验对象，2月龄小鼠购自第一军医大学实验动物中心。小鼠5月龄后随机取10只处死进行相关指标的测试，此组为5月龄鼠。随机取10只开始运动训练，训练的方式为跑转笼(runningwheel)，将小鼠放进直径为17cm的带轴承转笼，让其主动跑笼，第1天跑10min，以后每天增加10min，直至每天1h，自动记录跑笼圈数。每天跑笼1h，每周5d，所有运动训练均在动物暗周期6pm～10pm完成，剩余10只对照组在相同时间放进转笼，但转笼固定不动。8个月后均达13月龄。
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1.2主要试剂和仪器NADH、细胞色素C、抗坏血酸钠均购自Sigma试剂公司，其余试剂均为国产分析纯。主要仪器有：731紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，氧电极(上海植物生理研究所)，记录仪(上海市大华仪表厂)。
1.3实验方法
1.3.1小鼠骨骼肌线粒体的制备将小鼠断头处死取腓肠肌，剪碎后电动匀浆器匀浆，差速离心分离线粒体。分离介质为0.25mol/L蔗糖，1mmol/LEDTA，5mmol/LTris-HCl(pH7.4)。所有操作均在4℃以下进行。
1.3.2线粒体复合物I活性的测定参考Schneider[1]的方法。反应体系中含Tris-Hcl缓冲液(pH7.5)，10mmol/L正铁氰化钾，15nmol/LNADH，记录410nm处吸光度的下降值。酶活性以每毫克蛋白计算，摩尔消光系数为1030。
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1.3.4统计处理所有实验数据由Excel统计软件处理，以x±s表示，t检验。
2结果
结果表明，对照组随着小鼠年龄的增长，骨骼肌线粒体复合物I(NADH脱氢酶)活性显著下降，复合物IV(细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物I及复合物IV活性明显升高，显著高于同龄对照鼠甚至高于5月龄鼠。见表1。
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表1 运动训练对小鼠骨骼肌线华粒体复合物I及复合物IV活性的影响
5月龄鼠
13月龄运动鼠
13月龄对照鼠
复合物I
0.3187±0.1275
0.3878±0.1249*#
0.2686±0.1232
复合物IV
0.0934±0.366
0.1202±0.0408*#
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0.0931±0.0120
3讨论
研究证实线粒体呼吸链上的某些酶是由线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)共同编码的。由于mtDNA特殊的结构特点及所处的位置(线粒体内膜，自由基产生的主要来源)所以mtDNA很容易受到自由基损伤，又缺乏较完善的修复机制，从而引起损伤积累，造成呼吸链酶的缺陷，影响氧化磷酸化功能[2,3],许多研究证实，mtDNA突变随增龄而升高，氧化磷酸化能力随增龄而下降。许多研究表明，线粒体的老化是细胞衰老的重要原因之一，随着年龄的增加，线粒体结构和功能出现异常，由线粒体功能下降引起的细胞能量缺损可能消弱细胞活性和细胞适应各种生理应激的能力。缺血性实验对线粒体呼吸链活性的影响发现，复合物I为最脆弱部分。有实验表明，在衰老进程中，横纹肌中细胞色素氧化酶活性显著下降[4]。该酶活性下降与线粒体产生的氧化物的增加相关。进一步的研究检测发现线粒体细胞色素氧化酶进行性和随机的丧失与年龄相关的线粒体RNA合成的下降有密切关系。NADH脱氢酶有7个亚单位是由线粒体DNA(mtDNA)编码的，占总的蛋白质编码区的59.2%，复合物IV的3个亚单位占24.4%也是由mtDNA编码的[5]。由于mtDNA在胞内的位置及其结构特性，决定了它易受线粒体氧化还原反应产生的氧自由基的攻击，引起mtDNA的突变。尤其是随着年龄的增长，组织中抗氧化剂随增龄而减少时，体内积累的氧化损伤作用即可导致线粒体和mtDNA的变异，从而使氧化磷酸化反应减退。氧化磷酸化缺陷时，可严重威胁各种器官和组织的能量需求和正常运转，从而产生临床症状和老化相关性疾病。也正基于此，Wallace等提出了mtDNA突变导致衰老和老年退化病的假说[6]。
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近期有关运动与衰老的研究表明，运动训练可提高衰老大鼠线粒体基质酶及呼吸酶活性[7,8]。Tate等人的研究表明衰老大鼠心肌细胞色素氧化酶活性与成年大鼠相比明显下降，8～10周跑台训练后，该酶活性显著提高[8]。衰老个体线粒体酶活性的提高直接反映了线粒体功能的改善。本研究通过对小鼠长达8个月的训练，发现长期有氧运动对骨骼肌线粒体复合物I活性无影响，但却使复合物IV活性明显升高。由此可见，运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。根据本实验室对骨骼肌线粒体抗氧化能力的研究结果(另文发表)分析，长期运动训练通过诱导抗氧化酶活性的升高，及时清除氧自由基，减少其对生物大分子如核酸、蛋白质及脂类的氧化损伤，mtDNA结构的完整有利于其编码的酶活性的表达。有实验发现，骨骼肌线粒体呼吸链活性随增龄而逐渐下降，mtDNA突变率却逐渐升高，推测体细胞随增龄而出现mtDNA突变是呼吸链酶活性下降的可能原因之一。运动训练可提高mtDNA编码的mRNA(细胞色素b，复合物IV亚单位I，复合物I亚单位ND6，16sRNA)及核DNA编码的mRNA(复合物IV亚单位IV，琥珀酸脱氢酶)。Tate等报道老年大鼠心肌细胞色素氧化酶mRNA含量下降，运动训练后细胞色素氧化酶mRNA含量升高，与老年大鼠训练前后细胞色素氧化酶活性变化一致[8]。适量的运动训练是否通过抗氧化酶活性的适应性增强而保护线粒体DNA结构，保障线粒体功能较完好的发挥，从而延缓衰老过程中相应功能能力的衰退，其确切机制还需进一步深入研究。
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作者简介：陈彩珍(1967-)，女，福建人，博士，实验中心主任。研究方向：运动训练的生物化学。
参 考 文 献
[1]Schneider H. Liposome- mitochondrial inner membrane fusion[J].J Biol Chem,1980,255:3748
[2]Shigenega M K, Hagen T M, Ames B N. Oxidative damage and mito chondrial decay in aging[J].Proc Natl Acad Sci， 1994,91:10 771～10 778
[3]Shadel G S. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates[J].Anne Rev Biochem, 1997,66:409～ 435
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[4]Hansford R G. Bioenergetics in aging[J].Biochem Biophys Acta, 1983,726:41
[5]Ozawa T. Genetic and functional changes in mitochondria associated with aging[J]. Physiol Rev, 1997,77:425～ 464
[6]Wallance D C. Mitochondrial genetics: A paradigm for aging and de generative diseases?[J].Science, 1992,236:628～ 636
[7]Ji LL. Myocardial aging:antioxidant enzymes and related biochemical properties[J].Am J Physiol,1991,261:R386～ R392
[8]Tata CA, Helgason T, Hyek MF,et al. SERCA2a and mitochondrial cytochrome oxidase expression are increased in heart of exercise-trained oldrats[J].Am J Physiol, 1996,271(Heart Circ. Physiol.40):H68～H 72
收稿：2000-01-12, http://www.100md.com