PD鼠尾壳核内GAD67 mRNA的表达及L-Dopa的影响
作者：冯兴军 高国栋 张华
单位：冯兴军(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)；高国栋(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)；张华(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)
关键词：GAD67；帕金森病；尾壳核；苍白球；原位杂交
第四军医大学学报000436 摘 要：目的 观察6-OHDA毁损黑质及L-Dopa处理对大鼠尾壳核(CPu) 和苍白球(GP)功能活动的影响. 方法 6-OHDA损毁大鼠单侧中脑黑质制备 PD模型大鼠，用原位杂交的方法分别 观察PD鼠、L-Dopa处理PD鼠及对照组鼠CPu及GP中GAD67 mRNA表达水平的变化. 结果 GAD67 mRNA的表达在PD鼠CPu中明显升高(76%)，在GP无 明显变化. 服用L-Dopa 后，GAD67 m RNA的表达水平在CPu明显下降(31%)而在GP则升高(42%). 结论 CPu 和 GP 功能活动的改变在PD的发病机制中起着重要作用.
, 百拇医药
中图号：：R742.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0505-04
Expression of GAD67 mRNA in the brain of PD rats and the influence of L -DOPA treatment
FENG Xing-Jun, GAO Guo-Dong，Zhang Hua
(Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China)
Abstract:AIM To observe the effects of 6-OHDA lesi on and L-DOPA treatment on the functional activities of rat caudate-putame n (CPu) and global pullidus (GP). METHODS 6-OHDA was injected i nto unilateral substantia nigra to estab lish PD rat model. In situ hybridization methods were used to observe the ch ange s of GAD67 mRNA level in CPu and GP of control, PD and L-DOPA-treate d rats, resp ectively. RESULTS GAD67 mRNA level increased (up 76%) in CPu of PD rats, but di d not change significantly in GP. L-DOPA treatment resulted in a significan t dec rease (down 31%) and increase (up 42%) of GAD67 mRNA expression in CPu and GP, respectively. CONCLUSION Changes of the functionalactivities of CPu and GP may play some important roles in the pathogenesis of PD.
, 百拇医药
Keywords:GAD67; Parkinson′s disease; caudate-p utamen; globus pallidus; in situ hybridization
0 引言
帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是以中脑黑质多巴胺 (dopamine, DA)能神经元发生退变从而导致尾壳核 (CPu) 内DA含量显著降低为主要病理 特征的中枢神经系统退行性疾病[1]. 人们对PD的病理生理学进行了大量研究,并形 成了一个被普遍接受的病理生理模型[2]. 认为,中脑DA能神经元的退行性变通过两 条途径致使苍白球内侧部(GPi)和 黑质网状部(SNr)过度兴奋. 一是直接途径，即CPu对GPi/SNr的抑制作用减弱. 二是间接 途径，即CPu对苍白球外侧部(Gpe，在啮齿类则为GP)的抑制作用增强，致使丘脑底核(ST N)因失去来自GPe的γ-氨基丁酸(GABA)能抑制作用而活动亢进，从而增强了对GPi/SNr 的谷氨酸(Glu)能兴奋作用. 然而近期有研究表明6-羟基多巴胺(6-OHDA)毁损所致PD 鼠GP的活动不减低，STN的过度兴奋亦不依赖于GP的被抑制[3]，从而对已有的PD病 理生理模型提 出挑战. 同时，考虑到左旋多巴(L-Dopa)是治疗PD最有效的药物之一，那么服用L -Dopa应 能改变PD鼠基底节中物质表达水平，而这些改变可能与PD的病理生理有关. 故我们 通过观察正常鼠、PD鼠及服用L-Dopa后的PD鼠的CPu和GP中谷氨酸脱羧酶67(GAD6 7)mRNA表达水平的变化，更进一步的认识PD的病理生理机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①偏侧PD鼠模型的制备:成年雄性SD大鼠30只，体质量200～ 250 g. 在水合氯醛(300 mg.kg-1)麻醉下，将大鼠固定于立体定向仪上. 根据Pax inos大鼠 脑图谱，用10 μL微量注射器向右侧黑质致密部及内侧前脑束注射6-OHDA. 6-OHDA(4 g .L-1)于用前溶于含0.1 g.L-1抗坏血酸的冰生理盐水，避光储存于4℃冰箱 . 注 射部位的坐标为：前囟后4.4 mm,中线旁开1.2 mm，脑表面下7.7 mm. 注射速度1 μL.min -1，留针15 min，缓慢拔针. 对照组大鼠(n=6)将相同体积的生理盐水注入黑质 及内侧前脑束区域. 以阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱发对侧旋转行为来判断毁损效果. 术后2 wk ，所有大鼠ip Apo(0.5 mg.kg-1)诱发其向右侧旋转，记录30 min内的 旋转周数，平均每min 7周以上者为合格的PD鼠模型，用做进一步的实验(n=15). ②实验所用GAD67探针为含30个碱基的寡核苷酸探针. 其序列如下：5′-ATAGAGGTAT TCAGCCAGCTCGA
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AGCATTT-3′，该探针序列与大鼠脑中GAD67 mRNA的一部分(1561 -1590号碱基) 相互补[4]. 探针用3′末端标记法及[α-35S]dATP (37 PBq. mol- 1, A mersham)进行标记. 标记探针的特异性放射活性为1.2×109～1.4×109 dpm.g-1 .
1.2 方法 将15只合格PD鼠随机分成两组，第1组(n=8)直接用于 原位杂交实验；第2组(n=7)先服用L-Dopa ，再行原位杂交实验. 服用L-D opa (100 mg.kg-1.d-1)时辅以苄丝肼(25 mg.kg-1.d-1 )，药物的浓度依照体质量每wk做相应调整. L-Dopa 和苄丝 肼溶于最小体积的含0.1 g.L-1 抗坏血酸的2 mol.L-1 HCl中，以蒸馏水稀 释到所需体积并以6 mol.L-1 NaOH中和pH值至4.5～5.0，连续服用6 wk. 两组大鼠 ，每wk以Apo诱发旋转实验测定大鼠的旋转行为.
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原位杂交及组织化学步骤:动物断头处死，快速取脑并立即包埋于干冰粉末中. 恒冷 箱切片机切片，片厚14 μm, 裱于经明胶-铬明矾处理的载玻片上，置-70℃保存备用. 切片快速干燥后依次入40 g.L-1多聚甲醛，0.1 mol.L-1 PB及杂交前处理液 (含9 g.L-1氯化钠，15 g.L-1三乙胺和2.5 g.L-1乙酸酐). 杂交 时将200～300 μL杂交液[含4×SSC，500 g.L-1甲酰胺，0.25 g.L-1 tRNA ，100 g.L-1硫酸苏糖，1×Denhardt′s液(含0.2 g.L-1牛血清白蛋白，0. 2 g.L-1菲可400，0.2 g.L-1 PVP K-30)]15 μL DTT 及标记探针(dpm为24×106 ～36×106 mL-1)滴于切片表面，于湿盒中(40℃) 孵育4 8 h. 杂交后，用1×SSC(含0.15 mol.L-1氯化钠和0.015 mol.L-1枸橼酸钠 )洗片(55℃，3×20 min)，最后将LM-1 (Amersham) 型乳胶涂于切片表面，暗盒中曝光 (4℃). 4 wk后，Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定影液定影，10 g.L-1硫堇 复染. 脱水，透明，封片，光镜观察.
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统计学分析：用Leica-500图像分析仪对各切片上相关脑区的原位杂交信号的强度进 行测定. 对所得结果进行ANOVA分析，以判断对照组、PD鼠组以及L-Dopa处理PD鼠组相 关脑区内GAD67 mRNA的表达水平是否存在差异.
2 结果
6-OHDA毁损大鼠30只，2 wk后ip Apo，诱导大鼠向右侧旋转行为，共有15只合 格PD大鼠[(11.3±1.6)周.min-1]，成功率为50%，与既往报道结果基本相同， 表明 我们已成功建立了PD鼠模型. 在以后6 wk的旋转行为测试中，PD鼠组的旋转行为基本稳定. 而服用L-Dopa组，1 wk后，大鼠每 min的旋转次数明显减少(-33%，P<0.05)， 至第2 wk时，旋转速度减至(7.2±1.1)周.min-1(-36%，P<0.05)，以后4 wk基本 维持此水平(Fig 1).
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图 1 PD鼠在未服用和服用L-Dopa后的平均旋 转周数
Fig 1 Mean rotation turns per minute of PD rats treated and untreated with L-Dopa
aP<0.05 when compared to that obtained untreated with L-Dopa.
原位杂交实验观察到， CPu内GAD67 mRNA的杂交信号的强度，PD鼠明显高于对 照组大 鼠(+76%, P<0.01). 在服用L-Dopa 6 wk后，大鼠CPu内GAD67 mRNA的表 达水平明显低 于PD鼠 (-31%, P<0.05)，虽仍高于对照组的水平(+18%)，但无统计学意义( Fig 2, Tab 1,P>0.05).
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GAD67 mRNA在PD鼠GP中的表达水平与对照组比虽略有升高(+8%)，但无统计学 意义(P>0.05). 服用L-Dopa后，GP内GAD67 mRNA的表达水平与PD鼠对比 有明显升高(+42%，P<0.05)(Fig 2, Tab 1).
图 2 原位杂交结果显示GAD67 mRNA在对照鼠(a)、PD鼠(b)及L -Dopa处理鼠(c)CPu(C)和GP(G)中的表达变化
Fig 2 In situ hybridization results showing changes of GAD67 mRNA le vel in the CPu (C) and GP (G) of control rats (A), PD rats (B) and L-Dopa- treated rats (C) × 100
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表 1 大鼠CPu和GP内GAD mRNA杂交信号的强度
Tab 1 Hybridization signal density of GAD mRNA in CPu and GP of rats (
±s) Areas
Control rats
(n=6)
PD rats
(n=8)
L-D opa-treated rats
(n=7)
CPU
, http://www.100md.com
67.3±5.8
118.6±7.1a
79 .4±4.2b
GP
55.7±4.8
60.1±3.9
85.5±6.3 ab
aP<0.05 vs control rats;bP<0.05 vs PD rats.3 讨论
GAD是GABA的合成酶，常用来作为GABA特异性的标志物. 它有两种形式，GAD65和 GAD67. 以往的研究证实PD状态下CPu及GP中GAD67 mRNA的表达水平较正常时变 化明显，而GAD65 mRNA无变化[5-7]，故本实验选用前者作为观察指标. 本研究揭示PD大鼠CPu中GAD67 mRNA的表达水平升高，这与以往对PD大鼠的研究 结果一致[7]. 而且在MPTP所致猴PD模型(MPTP猴)，CPu中GAD67 mRNA含量 也明显升高[6]. GAD67 mRNA的升高，表明GADA的合成增多，即CPu神经元活 动增强. 其结果证明DA对CPu起抑制作用.
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经L-Dopa 治疗后，PD鼠的旋转行为得到改善，且CPu中GAD67 mRNA的含量 下降. 既往在对MPTP猴的研究中，L-Dopa的治疗可使CPu中GAD67 mRNA的含量恢 复或接 近正常且症状改善，与我们研究的结果一致[6]. 而Zeng等[7]的研究发现 ，PD鼠在给予L-Dopa治疗后,CPu中GAD67 mRNA的含量下降无统计学意义，且大 鼠的旋转行为加重，与本结果存在着差异. 出现不 同结果的原因可能是由于L-Dopa的用量不同造成，本研究的为100 mg.kg-1.d -1, 而Zeng 等的则为200 mg.kg-1.d-1. L-Dopa可以影响基底节中多种神经递质 的表达，且对 CPu的两个传出途径有不同的影响，那么L-Dopa用量的不同可能产生截然不同的效果.
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传统的PD病理生理认为患病时Gpe的兴奋性较正常时下降，但伴随着爆发放电频率的增 加. 在对PD鼠的研究中，有研究结果与上述观点一致[8]，而Hassanl等[3] 却发现GP放电频 率下降但无统计学意义. 上述结果提示，PD鼠的GP同时受到较强的兴奋作用和抑制作用 . 然而，单从这种电生理特点很难判断GP的整体活动是降低还是升高. 而本研究观察到6-O H DA毁损中脑黑质后，GP神经元中GAD67 mRNA的表达无明显改变，提示PD鼠GP的活动可 能没有变化. 这一结果与Levy等[9]对人和猴的研究结果一致.
从解剖联系上来看，GP除接受来自CPu的GABA能投射外，还接受大量来自STN的Glu能投射， 这种双重支配提示GP的活动水平由这两个途径的平衡作用决定. 生理学证据表明STN神经元 可明显影响GP的活动，刺激STN可强烈增强GP神经元的活动，毁损STN则导致GP活动下降 [9] . 这与以下的研究结果相符合：PD鼠STN的兴奋性显著升高[3]，从而会增强GP的活 动，提高 GP中GAD67 mRNA的表达，而且毁损STN确能降低GP中GAD67 mRNA的表达[1 0]. 相反本文及以往的研究结果证实PD鼠CPu的活动增高，从而增强了对GP的抑制作用，导致GP神经元GAD67 mRNA的表达水平降低. 因此，PD鼠GP中GAD 67 mRNA 含量无明显变化，可能正是由于来自CPu的抑制作用和来自STN的兴奋作用同时增强所致.
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我们还发现，应用L-Dopa后PD鼠的GP中GAD67 mRNA的表达升高. 有实验表 明应用L-Dopa 后STN的活动降低[11]，故它对GP的兴奋作用也降低；另一方面，服用L-Dopa 后，CPu中GAD67 mRNA降低，表明GABA活动降低，那么它对GP的抑制作用也降低. 可 见，在服用L-D opa后 ，GP受到的STN的兴奋作用和CPu的抑制作用同时降低. 但可能由于两者的降低并不平行，即 CPu的抑制作用降低的更为显著，导致GP的功能活动升高. 总之本实验可以得出这样的结论：PD鼠CPu的功能活动显著升高，而GP的不变. L-Dopa 治疗 后，CPu的功能活动明显降低，而GP的则明显升高. 这一结果用传统的PD病理生理模型难 以解释，从而有必要重新认识基底节的功能解剖，以进一步提高对PD的治疗效果.
作者简介：冯兴军(1971-)，男(汉族)，山东省菏泽市人. 硕士. Tel.(0 29)3577555
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参考文献：
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, 百拇医药
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收稿日期:1999-10-25; 修回日期:2000-01-03, http://www.100md.com
单位：冯兴军(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)；高国栋(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)；张华(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)
关键词：GAD67；帕金森病；尾壳核；苍白球；原位杂交
第四军医大学学报000436 摘 要：目的 观察6-OHDA毁损黑质及L-Dopa处理对大鼠尾壳核(CPu) 和苍白球(GP)功能活动的影响. 方法 6-OHDA损毁大鼠单侧中脑黑质制备 PD模型大鼠，用原位杂交的方法分别 观察PD鼠、L-Dopa处理PD鼠及对照组鼠CPu及GP中GAD67 mRNA表达水平的变化. 结果 GAD67 mRNA的表达在PD鼠CPu中明显升高(76%)，在GP无 明显变化. 服用L-Dopa 后，GAD67 m RNA的表达水平在CPu明显下降(31%)而在GP则升高(42%). 结论 CPu 和 GP 功能活动的改变在PD的发病机制中起着重要作用.
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中图号：：R742.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0505-04
Expression of GAD67 mRNA in the brain of PD rats and the influence of L -DOPA treatment
FENG Xing-Jun, GAO Guo-Dong，Zhang Hua
(Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China)
Abstract:AIM To observe the effects of 6-OHDA lesi on and L-DOPA treatment on the functional activities of rat caudate-putame n (CPu) and global pullidus (GP). METHODS 6-OHDA was injected i nto unilateral substantia nigra to estab lish PD rat model. In situ hybridization methods were used to observe the ch ange s of GAD67 mRNA level in CPu and GP of control, PD and L-DOPA-treate d rats, resp ectively. RESULTS GAD67 mRNA level increased (up 76%) in CPu of PD rats, but di d not change significantly in GP. L-DOPA treatment resulted in a significan t dec rease (down 31%) and increase (up 42%) of GAD67 mRNA expression in CPu and GP, respectively. CONCLUSION Changes of the functionalactivities of CPu and GP may play some important roles in the pathogenesis of PD.
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Keywords:GAD67; Parkinson′s disease; caudate-p utamen; globus pallidus; in situ hybridization
0 引言
帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是以中脑黑质多巴胺 (dopamine, DA)能神经元发生退变从而导致尾壳核 (CPu) 内DA含量显著降低为主要病理 特征的中枢神经系统退行性疾病[1]. 人们对PD的病理生理学进行了大量研究,并形 成了一个被普遍接受的病理生理模型[2]. 认为,中脑DA能神经元的退行性变通过两 条途径致使苍白球内侧部(GPi)和 黑质网状部(SNr)过度兴奋. 一是直接途径，即CPu对GPi/SNr的抑制作用减弱. 二是间接 途径，即CPu对苍白球外侧部(Gpe，在啮齿类则为GP)的抑制作用增强，致使丘脑底核(ST N)因失去来自GPe的γ-氨基丁酸(GABA)能抑制作用而活动亢进，从而增强了对GPi/SNr 的谷氨酸(Glu)能兴奋作用. 然而近期有研究表明6-羟基多巴胺(6-OHDA)毁损所致PD 鼠GP的活动不减低，STN的过度兴奋亦不依赖于GP的被抑制[3]，从而对已有的PD病 理生理模型提 出挑战. 同时，考虑到左旋多巴(L-Dopa)是治疗PD最有效的药物之一，那么服用L -Dopa应 能改变PD鼠基底节中物质表达水平，而这些改变可能与PD的病理生理有关. 故我们 通过观察正常鼠、PD鼠及服用L-Dopa后的PD鼠的CPu和GP中谷氨酸脱羧酶67(GAD6 7)mRNA表达水平的变化，更进一步的认识PD的病理生理机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①偏侧PD鼠模型的制备:成年雄性SD大鼠30只，体质量200～ 250 g. 在水合氯醛(300 mg.kg-1)麻醉下，将大鼠固定于立体定向仪上. 根据Pax inos大鼠 脑图谱，用10 μL微量注射器向右侧黑质致密部及内侧前脑束注射6-OHDA. 6-OHDA(4 g .L-1)于用前溶于含0.1 g.L-1抗坏血酸的冰生理盐水，避光储存于4℃冰箱 . 注 射部位的坐标为：前囟后4.4 mm,中线旁开1.2 mm，脑表面下7.7 mm. 注射速度1 μL.min -1，留针15 min，缓慢拔针. 对照组大鼠(n=6)将相同体积的生理盐水注入黑质 及内侧前脑束区域. 以阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱发对侧旋转行为来判断毁损效果. 术后2 wk ，所有大鼠ip Apo(0.5 mg.kg-1)诱发其向右侧旋转，记录30 min内的 旋转周数，平均每min 7周以上者为合格的PD鼠模型，用做进一步的实验(n=15). ②实验所用GAD67探针为含30个碱基的寡核苷酸探针. 其序列如下：5′-ATAGAGGTAT TCAGCCAGCTCGA
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AGCATTT-3′，该探针序列与大鼠脑中GAD67 mRNA的一部分(1561 -1590号碱基) 相互补[4]. 探针用3′末端标记法及[α-35S]dATP (37 PBq. mol- 1, A mersham)进行标记. 标记探针的特异性放射活性为1.2×109～1.4×109 dpm.g-1 .
1.2 方法 将15只合格PD鼠随机分成两组，第1组(n=8)直接用于 原位杂交实验；第2组(n=7)先服用L-Dopa ，再行原位杂交实验. 服用L-D opa (100 mg.kg-1.d-1)时辅以苄丝肼(25 mg.kg-1.d-1 )，药物的浓度依照体质量每wk做相应调整. L-Dopa 和苄丝 肼溶于最小体积的含0.1 g.L-1 抗坏血酸的2 mol.L-1 HCl中，以蒸馏水稀 释到所需体积并以6 mol.L-1 NaOH中和pH值至4.5～5.0，连续服用6 wk. 两组大鼠 ，每wk以Apo诱发旋转实验测定大鼠的旋转行为.
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原位杂交及组织化学步骤:动物断头处死，快速取脑并立即包埋于干冰粉末中. 恒冷 箱切片机切片，片厚14 μm, 裱于经明胶-铬明矾处理的载玻片上，置-70℃保存备用. 切片快速干燥后依次入40 g.L-1多聚甲醛，0.1 mol.L-1 PB及杂交前处理液 (含9 g.L-1氯化钠，15 g.L-1三乙胺和2.5 g.L-1乙酸酐). 杂交 时将200～300 μL杂交液[含4×SSC，500 g.L-1甲酰胺，0.25 g.L-1 tRNA ，100 g.L-1硫酸苏糖，1×Denhardt′s液(含0.2 g.L-1牛血清白蛋白，0. 2 g.L-1菲可400，0.2 g.L-1 PVP K-30)]15 μL DTT 及标记探针(dpm为24×106 ～36×106 mL-1)滴于切片表面，于湿盒中(40℃) 孵育4 8 h. 杂交后，用1×SSC(含0.15 mol.L-1氯化钠和0.015 mol.L-1枸橼酸钠 )洗片(55℃，3×20 min)，最后将LM-1 (Amersham) 型乳胶涂于切片表面，暗盒中曝光 (4℃). 4 wk后，Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定影液定影，10 g.L-1硫堇 复染. 脱水，透明，封片，光镜观察.
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统计学分析：用Leica-500图像分析仪对各切片上相关脑区的原位杂交信号的强度进 行测定. 对所得结果进行ANOVA分析，以判断对照组、PD鼠组以及L-Dopa处理PD鼠组相 关脑区内GAD67 mRNA的表达水平是否存在差异.
2 结果
6-OHDA毁损大鼠30只，2 wk后ip Apo，诱导大鼠向右侧旋转行为，共有15只合 格PD大鼠[(11.3±1.6)周.min-1]，成功率为50%，与既往报道结果基本相同， 表明 我们已成功建立了PD鼠模型. 在以后6 wk的旋转行为测试中，PD鼠组的旋转行为基本稳定. 而服用L-Dopa组，1 wk后，大鼠每 min的旋转次数明显减少(-33%，P<0.05)， 至第2 wk时，旋转速度减至(7.2±1.1)周.min-1(-36%，P<0.05)，以后4 wk基本 维持此水平(Fig 1).
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图 1 PD鼠在未服用和服用L-Dopa后的平均旋 转周数
Fig 1 Mean rotation turns per minute of PD rats treated and untreated with L-Dopa
aP<0.05 when compared to that obtained untreated with L-Dopa.
原位杂交实验观察到， CPu内GAD67 mRNA的杂交信号的强度，PD鼠明显高于对 照组大 鼠(+76%, P<0.01). 在服用L-Dopa 6 wk后，大鼠CPu内GAD67 mRNA的表 达水平明显低 于PD鼠 (-31%, P<0.05)，虽仍高于对照组的水平(+18%)，但无统计学意义( Fig 2, Tab 1,P>0.05).
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GAD67 mRNA在PD鼠GP中的表达水平与对照组比虽略有升高(+8%)，但无统计学 意义(P>0.05). 服用L-Dopa后，GP内GAD67 mRNA的表达水平与PD鼠对比 有明显升高(+42%，P<0.05)(Fig 2, Tab 1).
图 2 原位杂交结果显示GAD67 mRNA在对照鼠(a)、PD鼠(b)及L -Dopa处理鼠(c)CPu(C)和GP(G)中的表达变化
Fig 2 In situ hybridization results showing changes of GAD67 mRNA le vel in the CPu (C) and GP (G) of control rats (A), PD rats (B) and L-Dopa- treated rats (C) × 100
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表 1 大鼠CPu和GP内GAD mRNA杂交信号的强度
Tab 1 Hybridization signal density of GAD mRNA in CPu and GP of rats (
±s) AreasControl rats
(n=6)
PD rats
(n=8)
L-D opa-treated rats
(n=7)
CPU
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67.3±5.8
118.6±7.1a
79 .4±4.2b
GP
55.7±4.8
60.1±3.9
85.5±6.3 ab
aP<0.05 vs control rats;bP<0.05 vs PD rats.3 讨论
GAD是GABA的合成酶，常用来作为GABA特异性的标志物. 它有两种形式，GAD65和 GAD67. 以往的研究证实PD状态下CPu及GP中GAD67 mRNA的表达水平较正常时变 化明显，而GAD65 mRNA无变化[5-7]，故本实验选用前者作为观察指标. 本研究揭示PD大鼠CPu中GAD67 mRNA的表达水平升高，这与以往对PD大鼠的研究 结果一致[7]. 而且在MPTP所致猴PD模型(MPTP猴)，CPu中GAD67 mRNA含量 也明显升高[6]. GAD67 mRNA的升高，表明GADA的合成增多，即CPu神经元活 动增强. 其结果证明DA对CPu起抑制作用.
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经L-Dopa 治疗后，PD鼠的旋转行为得到改善，且CPu中GAD67 mRNA的含量 下降. 既往在对MPTP猴的研究中，L-Dopa的治疗可使CPu中GAD67 mRNA的含量恢 复或接 近正常且症状改善，与我们研究的结果一致[6]. 而Zeng等[7]的研究发现 ，PD鼠在给予L-Dopa治疗后,CPu中GAD67 mRNA的含量下降无统计学意义，且大 鼠的旋转行为加重，与本结果存在着差异. 出现不 同结果的原因可能是由于L-Dopa的用量不同造成，本研究的为100 mg.kg-1.d -1, 而Zeng 等的则为200 mg.kg-1.d-1. L-Dopa可以影响基底节中多种神经递质 的表达，且对 CPu的两个传出途径有不同的影响，那么L-Dopa用量的不同可能产生截然不同的效果.
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传统的PD病理生理认为患病时Gpe的兴奋性较正常时下降，但伴随着爆发放电频率的增 加. 在对PD鼠的研究中，有研究结果与上述观点一致[8]，而Hassanl等[3] 却发现GP放电频 率下降但无统计学意义. 上述结果提示，PD鼠的GP同时受到较强的兴奋作用和抑制作用 . 然而，单从这种电生理特点很难判断GP的整体活动是降低还是升高. 而本研究观察到6-O H DA毁损中脑黑质后，GP神经元中GAD67 mRNA的表达无明显改变，提示PD鼠GP的活动可 能没有变化. 这一结果与Levy等[9]对人和猴的研究结果一致.
从解剖联系上来看，GP除接受来自CPu的GABA能投射外，还接受大量来自STN的Glu能投射， 这种双重支配提示GP的活动水平由这两个途径的平衡作用决定. 生理学证据表明STN神经元 可明显影响GP的活动，刺激STN可强烈增强GP神经元的活动，毁损STN则导致GP活动下降 [9] . 这与以下的研究结果相符合：PD鼠STN的兴奋性显著升高[3]，从而会增强GP的活 动，提高 GP中GAD67 mRNA的表达，而且毁损STN确能降低GP中GAD67 mRNA的表达[1 0]. 相反本文及以往的研究结果证实PD鼠CPu的活动增高，从而增强了对GP的抑制作用，导致GP神经元GAD67 mRNA的表达水平降低. 因此，PD鼠GP中GAD 67 mRNA 含量无明显变化，可能正是由于来自CPu的抑制作用和来自STN的兴奋作用同时增强所致.
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我们还发现，应用L-Dopa后PD鼠的GP中GAD67 mRNA的表达升高. 有实验表 明应用L-Dopa 后STN的活动降低[11]，故它对GP的兴奋作用也降低；另一方面，服用L-Dopa 后，CPu中GAD67 mRNA降低，表明GABA活动降低，那么它对GP的抑制作用也降低. 可 见，在服用L-D opa后 ，GP受到的STN的兴奋作用和CPu的抑制作用同时降低. 但可能由于两者的降低并不平行，即 CPu的抑制作用降低的更为显著，导致GP的功能活动升高. 总之本实验可以得出这样的结论：PD鼠CPu的功能活动显著升高，而GP的不变. L-Dopa 治疗 后，CPu的功能活动明显降低，而GP的则明显升高. 这一结果用传统的PD病理生理模型难 以解释，从而有必要重新认识基底节的功能解剖，以进一步提高对PD的治疗效果.
作者简介：冯兴军(1971-)，男(汉族)，山东省菏泽市人. 硕士. Tel.(0 29)3577555
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收稿日期:1999-10-25; 修回日期:2000-01-03, http://www.100md.com