HPLC法测定血浆中喷昔洛韦浓度
作者：李可欣 张京晶. 胡 欣 孙春华 宋友华
单位：张京晶(北京中国中医研究院广安门医院 100053)；李可欣 胡欣 胡欣 孙春华 宋友华(卫生部北京医院临床药理室 北京 100730)
关键词：泛昔洛韦；喷昔洛韦；HPLC
药物分析杂志000410 摘要 目的：建立泛昔洛韦人体内活性代谢产物—喷昔洛韦血浆浓度测定方法。方法：采用C18反相色谱柱，以0.02 mol.L-1高氯酸-甲醇(450∶8)为流动相，荧光检测波长为λex=270 nm，λem=375 nm，内标物为阿昔洛韦，血浆样品采用6 mol.L-1高氯酸液沉淀蛋白。结果：喷昔洛韦血浆浓度在0.125～16 mg.L-1范围内，与面积呈良好的线性关系(r=0.999 8)；本试验最低检测浓度为0.05 mg.L-1，日内及日间RSD均小于8%，喷昔洛韦的方法回收率大于90%。结论：该方法简便、准确、灵敏，可用于泛昔洛韦人体药代动力学及生物利用度的研究。
, 百拇医药
Determination of Penciclovir Concentration in Plasma by HPLC
Li Kexin Zhang Jingjing Hu Xin Sun Chunhua Song Youhua
(Department of Clinical Pharmacol,Beijing Hospital,Beijing 100730)
Abstract Objective：Plasma concentration of penciclovir,the active metabolite found in plasma after administration of famciclovir,was determined by HPLC with fluorescence detection.Methods:Penciclovir was separated on a reverse-phase C18 columm with the mobile phase consisted of 0.02 mol.L-1 HC1O4-methanol(450∶8) and assayed by fluorescence detection at λex=270 nm and λem=375 nm.Aciclovir was the internal standard.Results:The linearity range of the concentration curves for penciclovir in plasma was from 0.125 to 16 mg.L-1(r=0.999 8) and the minimal detectable concentration was 0.05 mg.L-1.The RSD within-day and day-to-day were less than 8% and recoveries of penciclovir was more than 90%.Conclusion:This method is simple,accurate and sensitive.It can be used to study for pharmacokinetic and bioavailability of famciclovir.
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Key words famciclovir,penciclovir,HPLC▲
泛昔洛韦(famciclovir)为一种开环核苷类新型高效、低毒抗病毒药物。该药对单纯疱疹Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1，HSV-2)、水痘、带状疱疹病毒(VZV)均有抗病毒活性[1～3]。该药口服后在体内迅速去乙酰化及氧化而被代谢为具有抗病毒活性的喷昔洛韦(penciclovir)。喷昔洛韦体内药物浓度测定方法国外已有报道[4～6]，均采用HPLC紫外检测及外标法。本研究采用HPLC荧光检测器，以阿昔洛韦为内标，建立了精确度、灵敏度高，操作简便，特异性强的HPLC分析方法，旨在为人体药代动力学及生物利用度研究提供检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器 日本岛津LC-10AT高效液相色谱系统；RF-10AXL荧光检测器；Phenomex Luna C18色谱柱，5 μm,150 mm×4.6 mm;450型色谱积分仪。
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1.2 药品与试剂 喷昔洛韦对照品：广东彼迪药业有限公司提供，纯度为99.8%；内标物：阿昔洛韦，由北京大翔药业有限公司提供。甲醇为色谱纯，高氯酸为分析纯，水为超纯水。
2 实验条件选择
2.1 流动相及检测波长的选择 参照阿昔洛韦荧光检测方法[7]，经反复试验，将原文献中的流动相(0.02 mol.L-1高氯酸液)改为0.02 mol.L-1高氯酸液-甲醇(450∶3，pH约1.8)，以调整喷昔洛韦与阿昔洛韦的保留时间及分离度。选择如此低pH流动相的原因是为提高荧光检测的灵敏度[7]，且本试验选用了Phenomex Luna色谱柱，该柱可在pH 1.5～10.0范围内稳定使用1 000 h。流速选择1.2 mL.min-1，荧光检测波长为λex=270 nm,λem=375 nm，在此波长处，喷昔洛韦的荧光信号最强。
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2.2 标准储备液及内标液的配制
精密称取喷昔洛韦对照品适量，置50 mL量瓶中，用水溶解(40 ℃水浴)并定容成1 mg.mL-1;再精密量取5 mL于50 mL量瓶中，用水定容成100 mg.L-1标准储备液备用。
称取阿昔洛韦(内标物)适量，置100 mL量瓶中用流动相溶解，并稀释至刻度，即得500 mg.L-1的内标液。
2.3 血浆样品的处理及测定 取血浆样品0.2 mL，置1 mL具塞离心管中，准确加入内标液16 μL，混匀，加入6 mol.L-1高氯酸80 μL，振荡0.5 min，高速(10 000 r.min-1)离心4 min，取上清液10 μL进样，记录色谱图、内标峰面积、喷昔洛韦峰面积。
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3 结果
3.1 标准曲线的制备 取空白血浆0.5 mL，加入100 mg.L-1喷昔洛韦标准储备液适量，使成16 mg.L-1浓度，再用空白血浆逐级稀释成8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 mg.L-1系列浓度，按“2.3”项下方法处理后进样分析，绘制标准曲线。以对照品峰面积与内标峰面积比R对浓度C(mg.L-1)作线性回归，得回归方程为：
R=0.360 0C-0.037 3 r=0.999 8
线性范围：0.125～16 mg.L-1，最低检测浓度为0.05 mg.L-1(以信噪比≥3计)。
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3.2 回收率试验 在空白血浆中加入喷昔洛韦标准储备液适量，配成8，2，0.25 mg.L-1 3个浓度的血样，按“2.3”项下方法处理后进样分析，计算回收率，结果见表1。
3.3 精密度试验 在空白血浆中加入喷昔洛韦标准储备液适量，配成8，2，0.25 mg.L-1 3个浓度的血样，测定日内、日间RSD，结果见表1。
表1 喷昔洛韦的方法回收率及日内、日间RSD(n=5) 浓度/mg.L-1
回收率/
%
日内
日间
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测得值/
mg.L-1
RSD
/%
测得值/
mg.L-1
RSD
/%
8
96.63
8.032
4.01
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8.049
5.09
2
94.88
1.943
4.94
1.937
5.78
0.25
95.15
0.255
6.67
0.261
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6.51
3.4 色谱图 在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。 由图1可见，喷昔洛韦、泛昔洛韦及内标物的保留时间分别为9.54，8.05，6.19 min，3者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。受试者服用泛昔洛韦后的血浆中(图1-D)无泛昔洛韦色谱峰出现，仅有喷昔洛韦峰，说明本品在人体内可迅速转变为喷昔洛韦。
图1 泛昔洛韦、喷昔洛韦及内标物HPLC色谱图
A.空白血浆+喷昔洛韦 B.空白血浆+内标物
C.空白血浆+喷昔洛韦+泛昔洛韦 D.健康人血样+内标物
1.喷昔洛韦 2.内标物 3.泛昔洛韦
3.5 应用 12名健康男性受试者单次口服500 mg泛昔洛韦胶囊后，分别于0.15，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，12 h各取静脉血2 mL，分离出血浆，按标准曲线项下操作测定，药-时曲线见图2。试验结果表明，本方法适用于该药的人体药代动力学研究。
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图2 12名健康男性受试者口服500 mg
泛昔洛韦后的药-时曲线
4 讨论
采用HPLC紫外检测器测定血浆中喷昔洛韦浓度已有报道[7]，但基于该类药物具有很强的亲水性，用有机溶媒很难将其从血浆中萃取、浓缩，因此欲检测血浆中喷昔洛韦浓度，必须首先考虑提高检测灵敏度。用紫外检测器测定血浆中10～50 ng.L-1检测限的药物浓度是不合适的，本试验首次采用荧光检测器测定血浆中喷昔洛韦浓度，参照文献报道[7]的阿昔洛韦荧光检测波长(λex=260 nm,λem=375 nm)及流动相(0.02 mol.L-1高氯酸液)，经反复试验确定，以0.02 mol.L-1高氯酸液-甲醇(450∶3，pH约1.8)做为流动相，λex=270 nm,λem=375 nm为检测波长的方法与文献报道的紫外检测法[4]相比，检测限可提高约10倍。并选用阿昔洛韦做为内标，以减少操作误差。该方法操作简单，基线平稳，杂质峰少，样品与内标峰形良好，分离完全，日内日间RSD均小于8%。
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泛昔洛韦口服后，在体内迅速去乙酰化及氧化代谢为6-脱氧-喷昔洛韦，再迅速转变为喷昔洛韦，喷昔洛韦为主要活性代谢产物，因此本实验建立了测定喷昔洛韦的方法，并用该方法对12名健康男性受试者口服500 mg泛昔洛韦后的人体药代动力学进行了研究，结果与国外文献报道[4]相近。■
参考文献
1.Boyd MR,Bacon TH,Sutton D,et al.Antiherpesvirus activity of 9-(4-hydroxy-3-hydroxy-methybut-1-yl)guanine(BRL 39123) in cell culture.Antimicrob Agents Chemother,1987,31:1238
2.Gheoraert P.Efficacy and safety of famciclovir in the treatment of uncomplicated herpes zoster.Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1992.11;Anaheim,CA.
, 百拇医药
3.Tyring S,Nahlik J,Cunningham A,et al.Efficacy and safety of famciclovir in the treatment of patients with herpes zoster.Results of the first placebo controlled study.Abstracts of the Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1993,33:400
4.Steven C Boike,Martin Pue,Patricia R Audet,et al.Pharmacokinetics of famciclovir in subjects with chromic hepatic disease.J Clin Pharmacol,1994,34(12):1199
5.Colin W Filer,Jayant Ramji,高桥直树，et al.フアムシクロビルの体内动态.药理と治疗，1996，24(8)：159
, 百拇医药
6.McMeekin JR,Fowles SE,Winton CF,et al.Rapid high performance liquid chromatographic method for the analysis of the active antiherpes agent penciclovir and its precursor,BRL 42359, in human plasma and urine following administration of the oral prodrug,famciclovir.Anal Proc, 1992,29:178
7.Mascher H,Kikuta C.New high-sensitivity HPLC method for the determination of acyclovir in human plasma,using fluorometric detection.J Chromatogr,1992,583:122
(本文于1999年5月4日收到), 百拇医药
单位：张京晶(北京中国中医研究院广安门医院 100053)；李可欣 胡欣 胡欣 孙春华 宋友华(卫生部北京医院临床药理室 北京 100730)
关键词：泛昔洛韦；喷昔洛韦；HPLC
药物分析杂志000410 摘要 目的：建立泛昔洛韦人体内活性代谢产物—喷昔洛韦血浆浓度测定方法。方法：采用C18反相色谱柱，以0.02 mol.L-1高氯酸-甲醇(450∶8)为流动相，荧光检测波长为λex=270 nm，λem=375 nm，内标物为阿昔洛韦，血浆样品采用6 mol.L-1高氯酸液沉淀蛋白。结果：喷昔洛韦血浆浓度在0.125～16 mg.L-1范围内，与面积呈良好的线性关系(r=0.999 8)；本试验最低检测浓度为0.05 mg.L-1，日内及日间RSD均小于8%，喷昔洛韦的方法回收率大于90%。结论：该方法简便、准确、灵敏，可用于泛昔洛韦人体药代动力学及生物利用度的研究。
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Determination of Penciclovir Concentration in Plasma by HPLC
Li Kexin Zhang Jingjing Hu Xin Sun Chunhua Song Youhua
(Department of Clinical Pharmacol,Beijing Hospital,Beijing 100730)
Abstract Objective：Plasma concentration of penciclovir,the active metabolite found in plasma after administration of famciclovir,was determined by HPLC with fluorescence detection.Methods:Penciclovir was separated on a reverse-phase C18 columm with the mobile phase consisted of 0.02 mol.L-1 HC1O4-methanol(450∶8) and assayed by fluorescence detection at λex=270 nm and λem=375 nm.Aciclovir was the internal standard.Results:The linearity range of the concentration curves for penciclovir in plasma was from 0.125 to 16 mg.L-1(r=0.999 8) and the minimal detectable concentration was 0.05 mg.L-1.The RSD within-day and day-to-day were less than 8% and recoveries of penciclovir was more than 90%.Conclusion:This method is simple,accurate and sensitive.It can be used to study for pharmacokinetic and bioavailability of famciclovir.
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Key words famciclovir,penciclovir,HPLC▲
泛昔洛韦(famciclovir)为一种开环核苷类新型高效、低毒抗病毒药物。该药对单纯疱疹Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1，HSV-2)、水痘、带状疱疹病毒(VZV)均有抗病毒活性[1～3]。该药口服后在体内迅速去乙酰化及氧化而被代谢为具有抗病毒活性的喷昔洛韦(penciclovir)。喷昔洛韦体内药物浓度测定方法国外已有报道[4～6]，均采用HPLC紫外检测及外标法。本研究采用HPLC荧光检测器，以阿昔洛韦为内标，建立了精确度、灵敏度高，操作简便，特异性强的HPLC分析方法，旨在为人体药代动力学及生物利用度研究提供检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器 日本岛津LC-10AT高效液相色谱系统；RF-10AXL荧光检测器；Phenomex Luna C18色谱柱，5 μm,150 mm×4.6 mm;450型色谱积分仪。
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1.2 药品与试剂 喷昔洛韦对照品：广东彼迪药业有限公司提供，纯度为99.8%；内标物：阿昔洛韦，由北京大翔药业有限公司提供。甲醇为色谱纯，高氯酸为分析纯，水为超纯水。
2 实验条件选择
2.1 流动相及检测波长的选择 参照阿昔洛韦荧光检测方法[7]，经反复试验，将原文献中的流动相(0.02 mol.L-1高氯酸液)改为0.02 mol.L-1高氯酸液-甲醇(450∶3，pH约1.8)，以调整喷昔洛韦与阿昔洛韦的保留时间及分离度。选择如此低pH流动相的原因是为提高荧光检测的灵敏度[7]，且本试验选用了Phenomex Luna色谱柱，该柱可在pH 1.5～10.0范围内稳定使用1 000 h。流速选择1.2 mL.min-1，荧光检测波长为λex=270 nm,λem=375 nm，在此波长处，喷昔洛韦的荧光信号最强。
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2.2 标准储备液及内标液的配制
精密称取喷昔洛韦对照品适量，置50 mL量瓶中，用水溶解(40 ℃水浴)并定容成1 mg.mL-1;再精密量取5 mL于50 mL量瓶中，用水定容成100 mg.L-1标准储备液备用。
称取阿昔洛韦(内标物)适量，置100 mL量瓶中用流动相溶解，并稀释至刻度，即得500 mg.L-1的内标液。
2.3 血浆样品的处理及测定 取血浆样品0.2 mL，置1 mL具塞离心管中，准确加入内标液16 μL，混匀，加入6 mol.L-1高氯酸80 μL，振荡0.5 min，高速(10 000 r.min-1)离心4 min，取上清液10 μL进样，记录色谱图、内标峰面积、喷昔洛韦峰面积。
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3 结果
3.1 标准曲线的制备 取空白血浆0.5 mL，加入100 mg.L-1喷昔洛韦标准储备液适量，使成16 mg.L-1浓度，再用空白血浆逐级稀释成8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 mg.L-1系列浓度，按“2.3”项下方法处理后进样分析，绘制标准曲线。以对照品峰面积与内标峰面积比R对浓度C(mg.L-1)作线性回归，得回归方程为：
R=0.360 0C-0.037 3 r=0.999 8
线性范围：0.125～16 mg.L-1，最低检测浓度为0.05 mg.L-1(以信噪比≥3计)。
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3.2 回收率试验 在空白血浆中加入喷昔洛韦标准储备液适量，配成8，2，0.25 mg.L-1 3个浓度的血样，按“2.3”项下方法处理后进样分析，计算回收率，结果见表1。
3.3 精密度试验 在空白血浆中加入喷昔洛韦标准储备液适量，配成8，2，0.25 mg.L-1 3个浓度的血样，测定日内、日间RSD，结果见表1。
表1 喷昔洛韦的方法回收率及日内、日间RSD(n=5) 浓度/mg.L-1
回收率/
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日内
日间
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测得值/
mg.L-1
RSD
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测得值/
mg.L-1
RSD
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8
96.63
8.032
4.01
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8.049
5.09
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94.88
1.943
4.94
1.937
5.78
0.25
95.15
0.255
6.67
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6.51
3.4 色谱图 在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。 由图1可见，喷昔洛韦、泛昔洛韦及内标物的保留时间分别为9.54，8.05，6.19 min，3者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。受试者服用泛昔洛韦后的血浆中(图1-D)无泛昔洛韦色谱峰出现，仅有喷昔洛韦峰，说明本品在人体内可迅速转变为喷昔洛韦。
图1 泛昔洛韦、喷昔洛韦及内标物HPLC色谱图
A.空白血浆+喷昔洛韦 B.空白血浆+内标物
C.空白血浆+喷昔洛韦+泛昔洛韦 D.健康人血样+内标物
1.喷昔洛韦 2.内标物 3.泛昔洛韦
3.5 应用 12名健康男性受试者单次口服500 mg泛昔洛韦胶囊后，分别于0.15，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，12 h各取静脉血2 mL，分离出血浆，按标准曲线项下操作测定，药-时曲线见图2。试验结果表明，本方法适用于该药的人体药代动力学研究。
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图2 12名健康男性受试者口服500 mg
泛昔洛韦后的药-时曲线
4 讨论
采用HPLC紫外检测器测定血浆中喷昔洛韦浓度已有报道[7]，但基于该类药物具有很强的亲水性，用有机溶媒很难将其从血浆中萃取、浓缩，因此欲检测血浆中喷昔洛韦浓度，必须首先考虑提高检测灵敏度。用紫外检测器测定血浆中10～50 ng.L-1检测限的药物浓度是不合适的，本试验首次采用荧光检测器测定血浆中喷昔洛韦浓度，参照文献报道[7]的阿昔洛韦荧光检测波长(λex=260 nm,λem=375 nm)及流动相(0.02 mol.L-1高氯酸液)，经反复试验确定，以0.02 mol.L-1高氯酸液-甲醇(450∶3，pH约1.8)做为流动相，λex=270 nm,λem=375 nm为检测波长的方法与文献报道的紫外检测法[4]相比，检测限可提高约10倍。并选用阿昔洛韦做为内标，以减少操作误差。该方法操作简单，基线平稳，杂质峰少，样品与内标峰形良好，分离完全，日内日间RSD均小于8%。
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泛昔洛韦口服后，在体内迅速去乙酰化及氧化代谢为6-脱氧-喷昔洛韦，再迅速转变为喷昔洛韦，喷昔洛韦为主要活性代谢产物，因此本实验建立了测定喷昔洛韦的方法，并用该方法对12名健康男性受试者口服500 mg泛昔洛韦后的人体药代动力学进行了研究，结果与国外文献报道[4]相近。■
参考文献
1.Boyd MR,Bacon TH,Sutton D,et al.Antiherpesvirus activity of 9-(4-hydroxy-3-hydroxy-methybut-1-yl)guanine(BRL 39123) in cell culture.Antimicrob Agents Chemother,1987,31:1238
2.Gheoraert P.Efficacy and safety of famciclovir in the treatment of uncomplicated herpes zoster.Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1992.11;Anaheim,CA.
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3.Tyring S,Nahlik J,Cunningham A,et al.Efficacy and safety of famciclovir in the treatment of patients with herpes zoster.Results of the first placebo controlled study.Abstracts of the Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1993,33:400
4.Steven C Boike,Martin Pue,Patricia R Audet,et al.Pharmacokinetics of famciclovir in subjects with chromic hepatic disease.J Clin Pharmacol,1994,34(12):1199
5.Colin W Filer,Jayant Ramji,高桥直树，et al.フアムシクロビルの体内动态.药理と治疗，1996，24(8)：159
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6.McMeekin JR,Fowles SE,Winton CF,et al.Rapid high performance liquid chromatographic method for the analysis of the active antiherpes agent penciclovir and its precursor,BRL 42359, in human plasma and urine following administration of the oral prodrug,famciclovir.Anal Proc, 1992,29:178
7.Mascher H,Kikuta C.New high-sensitivity HPLC method for the determination of acyclovir in human plasma,using fluorometric detection.J Chromatogr,1992,583:122
(本文于1999年5月4日收到), 百拇医药