猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染猴模型的建立
作者：吴小闲 张奉学 何伏秋 李国桥 符林春 邓文娣 罗红梅 廖兴荣
单位：广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405
关键词：猴获得性免疫缺陷综合征；疾病模型，动物；猕猴属
广州中医药大学学报000421摘要：目的：在先前已建立了模拟人艾滋病感染者和患者的猴免疫缺陷病毒(SIV)急性感染猴和中、晚期猴艾滋病(SAIDS)模型的基础上，再摸索建立SIV慢性感染猴模型，以期为抗艾滋病药物的体内药效学评价研究提供更合适的动物模型。方法：用SIVmac251感染恒河猴17只，追踪观察其临床表现，体征变化，病程进展，血浆和全血病毒血症规律，淋巴细胞亚群CD4的动态等。结果：临床体征有特征性，病程较长，1年内死亡2只(11.8%)。血浆病毒血症水平在感染后14d达高峰，感染21d开始下降，60～360d检不出或低滴度。全血病毒血症水平在感染后10d开始持续高滴度至3个月，3个月后仍有半数以上持续高滴度，9个月后才下降。淋巴细胞亚群CD4值感染后14～30d略下降，后回升。结论：SIV慢性感染猴模型临床表现、病毒学和免疫学的变化及病程进展类似人艾滋病感染者在进入艾滋病中、晚期前的慢性感染过程，可用于抗艾滋病药物疗效的研究。
, http://www.100md.com
中图分类号：R512.91 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0355-03
Establishment of Monkey Model with Chronic Infection of
Simian Acquired Immunodeficiency Virus
WU Xiaoxian, ZHANG Fengxue, LI Guoqiao, FU Linchun, DENG Wendi, LUO Hongmei, LIAO Xingrong
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
, 百拇医药
HE Fuqiao
(Institute of Experimental Animal, China Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)
Abstract: Further exploration of the establishment of monkey model chronically infected with Simian acquired immunodeficiency virus (SIV) was conducted on the basis of previous studies of SIV monkey models and simian acquired immunodeficiency syndrome models. Seventeen Rhesus monkeys were infected with SIVmac?251. Items such as symptoms and signs, course of infection,plasma viremia and the whole blood, changes of CD4 lymphocyte subgroup were observed periodically. The results showed that specific clinical manifestations occurred, disease course prolonged and 2 of 17 monkeys died of severe immunodeficiency. Plasma viremia reached the peak on 14th day after infection, began to decrease on 21st day, and remained low titer or underdetermined from 60th to 360th day. Whole blood viremia reached high titer from 10th to 90th day, and over half of the monkeys maintained high viremia level up to 9th month and then decreased afterwards. CD4 lymphocyte level decreased from 14th to 30th day, and then increased. The above changes of clinical manifestations, virology and immunology are similar to cases with chronic infection of human immunodeficiency virus (HIV) in the early stage. And this will provide a suitable animal model for the research of anti-AIDS drugs.
, 百拇医药
Key words: SIMIAN ACQUIRED IMMUNODEFICIENCY SYNDROMES; DISEASE MODELS, ANIMAL; MACACA
猴免疫缺陷病毒(SIV) 感染猴和模型猴因其发病过程和发病机理酷似人免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)，而广泛应用于抗AIDS药物的疗效观察、疫苗效果以及发病机理等的研究。抗AIDS药物的疗效观察一般用SIV急性感染猴模型[1]，给药与感染同步进行。以急性期血浆病毒血症水平的降低为判定依据。治疗AIDS总的目标是抑制病毒和提高机体免疫功能和整体健康水平，三者是互相依存的。因此，单纯用SIV急性感染猴模型是不完善的。鉴于此，笔者摸索建立SIV慢性感染猴模型，观察其发病规律，病程进展，以求建立更适合于抗艾滋病药物的体药效学实验研究的动物模型。
1 材料和方法
1.1 恒河猴、感染毒株和剂量[2]
, 百拇医药
恒河猴17只，用SIVmac251 3MID100(3个100%猴感染剂量)1mL静脉注射。
1.2 血液标本来源和采集
感染后不同时间点从猴静脉采血，分别用于检查血常规，T淋巴细胞亚群CD4、全血和血浆病毒滴定和抗体测定，全部标本均采自未经治疗试验的猴。
1.3 血浆和全血病毒血症水平滴定
见文献[2]。
1.4 荧光抗体和中和抗体测定
荧光抗体测定用自制的SIV抗原片，常规间接免疫荧光法测定。中和抗体测定：血浆标本1∶5稀释，56℃灭活30min，在96孔板上作系列2倍稀释，从1∶5～1∶160，每孔50μL，作复孔，每50μL加入20～40个TCID(组织培养感染病毒量)SIVmac病毒液，在37℃的CO2孵箱中和30min，加入2×105/mL CEMx174细胞100μL，复置37℃的CO2孵箱，3d换液1次，6d读结果，以最高稀释度血清抑制75%细胞病变为滴度。
, 百拇医药
1.5 T淋巴细胞亚群CD4测定
CD4单抗购自北京医科大学免疫室，操作按说明书要求，送中山医科大学免疫检验研究室用细胞流量分析仪计算CD4淋巴细胞比例，最后计算CD4绝对值：nWBC×nLym×nCD4×%。
2 结果
2.1 临床表现和体征
与以前的报导[7]基本类同，大多有浅表淋巴结肿大，有些有脾略肿大和皮肤红斑。最常见的合并症为腹泻，有间歇性或偶发性，易导致体重下降。动物在病死前伴有体重下降，精神、食欲欠佳，不进食，衰竭而死。17只猴在1年内死亡2只，15个月又死亡1只，均死于机体衰竭。
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2.2 血常规和淋巴细胞亚群CD4的检测
系统观察了4只猴的系列资料，感染后2～3周白细胞总数和淋巴细胞亚群CD4绝对值均有所下降，后回升，9个月和9个月后又有下降，成波浪形(图1)。血常规其他指标未见异常。
2.3 血浆和全血的病毒血症水平
血浆和全血检查的标本大部分是两种方法平行进行，小部分为单独进行，各时间点标本数不是一致(血浆标本数4～16份，全血标本数2～9份)。血浆病毒水平10d开始上升，14d达高峰，21d后下降，60d几乎检不出或很低，直至360d。全血病毒水平也是10d开始上升，14d达高峰，持续高滴度至3个月。3个月后有些猴滴度下降，有些仍持续高滴度(约50%)，直至9个月还有半数猴维持低滴度全血病毒血症(图2)。
有2只猴分别死于9.5个月和12个月，尸检显示均死于艾滋病，淋巴组织极度耗竭，这2只猴全血检查一直持续高病毒血症，但均在死亡前2～3个月病毒血症下降，死亡前检测不到病毒。
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为了观察SIV感染猴全血病毒滴度降至测不出的水平时，用SIV再感染能否重现急性感染时的病毒血症水平。笔者用100MID100SIVmac 251静脉注射再感染3只猴，再感染后12d和15d采样测定血浆和全血的病毒滴度。结果只有1只猴12d时全血有低滴度病毒水平(每mL含125TCID)，其余均未检出病毒，表明再感染不能重现高滴度的病毒血症。
图1 SIV感染猴后血液白细胞(WBC)和CD4值的动态变化
图2 SIV感染猴全血和血浆病毒滴度的动态变化2.4 荧光抗体和中和抗体的检测
荧光抗体在感染后14d约有半数出现很低抗体(1∶10阳性)，30d时均有低滴度抗体(1∶40～1∶160)，而2～3个月时抗体可达高滴度(1∶2560～1∶10 240或更高)。如荧光抗体不出现或很低则一般属于急性进展型病例，本次试验未见此型病例。
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中和抗体一般出现较晚，感染后2～3个月有低滴度(1∶5～1∶20)，约半数猴一直维持低滴度，其余可升至1∶40～1∶160。
3 讨论
SIV感染猴模型可用来评价药物抗艾滋病的疗效。近来也有用新生恒河猴先感染病毒3周再给药的方式来观察病程的进展[3]。笔者曾用急性感染猴模型[4]和感染中、晚期的SAIDS模型猴[5]进行评价抗艾滋病药物效果的研究，取得了一定的成效，各有优缺点。中、晚期SAIDS模型可观察到被破坏的淋巴结的修复，但观察抑制病毒血症的效果欠佳，因中、晚期SAIDS猴病毒血症用病毒分离培养方法不易测出，而测定SIV病毒载量拷贝数(RT-PCR)方法繁琐，费用昂贵。本研究测定病毒血症水平除测定血浆外，还测定全血的病毒滴度。对全血培养检测和定量病毒血症水平的敏感性有人已作过比较和报导[6]，这次试验又证实SIV感染猴全血的病毒滴度持续高滴度达3个月，3～8个月仍有半数以上猴维持高水平，9～12个月滴度下降。从而为检测艾滋病感染在进入中、晚期前药物的疗效提供了可能性。使用感染3个月以内的猴作抗艾滋病药物的疗效观察，可模拟人HIV感染者的用药观察，可检测药物抑制病毒的效果及对病程的进展和淋巴结病变的进展的作用。除SIV急性感染猴模型和SIV感染中、晚期的SAIDS模型猴外，还可添加一种SIV慢性感染猴模型，为两种的中间型，以供药物体内筛选时根据不同目的来选择模型。
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淋巴结的病理形态学变化在艾滋病的发展过程中，是一项具有特征性和重要的指标，将另文详述。
本实验SIVmac251感染猴17只，未观察到快速进展型，1年内死亡猴2只(11.8%)，均较过去的观察[7]病程进展慢，死亡率低。作为药物筛选的模型，病程进展太快或太慢均不适宜，感染至死亡宜在6～12个月，1年内的死亡率约50%～80%为佳。因此，用毒力更强的毒株，培育更敏感的基因稳定的猴群，减少个体差异，是今后努力的方向。
基金项目：广东省科委攻关课题(编号：SKkF9813)
作者简介：吴小闲(1928-)，女，研究员；
参考文献：
[1] Lundgren B,Bottiger D,Liungdahl-Stahle E, et al. Antiviral effects of 3'-fluorothymidine and 3'_azidothymidine in cynomolgus monkeys infected with simian immunodeficiency virus [J].Acquired Immune Defic Syndr,1991, 4:489
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[2] 吴小闲，卢耀增，魏强，等.两株SIVmac的滴定和特性[J].中国实验动物学报，1998，6：18
[3] Van Rompay K K A, Cherrington J M, Marthas M L, et al. 9-[2-(phosphonomethoxy)propyl] adenine therapy of established simian immunodeficiency virus infected in infant rhesus macaques[J].Antimicrob Agents Chemother, 1996,40:2586
[4] 吴小闲，卢耀增，何伏秋，等.急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果[J].中国性病艾滋病防治，1996，2：213
[5] 卢耀增，吴小闲，何伏秋，等.中药1号治疗SIVmac感染猴和艾滋病模型猴的观察[J].中国性病艾滋病防治，1995，1：35
[6] 丛，吴小闲，蒋虹，等.全血分离猴免疫缺陷病毒(SIV)的效果观察[J].中国性病艾滋病防治，1997，3：218
[7] 卢耀增，吴小闲，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立[J].中国实验动物学报，1994，2：94
收稿日期：2000-05-22, 百拇医药
单位：广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405
关键词：猴获得性免疫缺陷综合征；疾病模型，动物；猕猴属
广州中医药大学学报000421摘要：目的：在先前已建立了模拟人艾滋病感染者和患者的猴免疫缺陷病毒(SIV)急性感染猴和中、晚期猴艾滋病(SAIDS)模型的基础上，再摸索建立SIV慢性感染猴模型，以期为抗艾滋病药物的体内药效学评价研究提供更合适的动物模型。方法：用SIVmac251感染恒河猴17只，追踪观察其临床表现，体征变化，病程进展，血浆和全血病毒血症规律，淋巴细胞亚群CD4的动态等。结果：临床体征有特征性，病程较长，1年内死亡2只(11.8%)。血浆病毒血症水平在感染后14d达高峰，感染21d开始下降，60～360d检不出或低滴度。全血病毒血症水平在感染后10d开始持续高滴度至3个月，3个月后仍有半数以上持续高滴度，9个月后才下降。淋巴细胞亚群CD4值感染后14～30d略下降，后回升。结论：SIV慢性感染猴模型临床表现、病毒学和免疫学的变化及病程进展类似人艾滋病感染者在进入艾滋病中、晚期前的慢性感染过程，可用于抗艾滋病药物疗效的研究。
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中图分类号：R512.91 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0355-03
Establishment of Monkey Model with Chronic Infection of
Simian Acquired Immunodeficiency Virus
WU Xiaoxian, ZHANG Fengxue, LI Guoqiao, FU Linchun, DENG Wendi, LUO Hongmei, LIAO Xingrong
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
, 百拇医药
HE Fuqiao
(Institute of Experimental Animal, China Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)
Abstract: Further exploration of the establishment of monkey model chronically infected with Simian acquired immunodeficiency virus (SIV) was conducted on the basis of previous studies of SIV monkey models and simian acquired immunodeficiency syndrome models. Seventeen Rhesus monkeys were infected with SIVmac?251. Items such as symptoms and signs, course of infection,plasma viremia and the whole blood, changes of CD4 lymphocyte subgroup were observed periodically. The results showed that specific clinical manifestations occurred, disease course prolonged and 2 of 17 monkeys died of severe immunodeficiency. Plasma viremia reached the peak on 14th day after infection, began to decrease on 21st day, and remained low titer or underdetermined from 60th to 360th day. Whole blood viremia reached high titer from 10th to 90th day, and over half of the monkeys maintained high viremia level up to 9th month and then decreased afterwards. CD4 lymphocyte level decreased from 14th to 30th day, and then increased. The above changes of clinical manifestations, virology and immunology are similar to cases with chronic infection of human immunodeficiency virus (HIV) in the early stage. And this will provide a suitable animal model for the research of anti-AIDS drugs.
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Key words: SIMIAN ACQUIRED IMMUNODEFICIENCY SYNDROMES; DISEASE MODELS, ANIMAL; MACACA
猴免疫缺陷病毒(SIV) 感染猴和模型猴因其发病过程和发病机理酷似人免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)，而广泛应用于抗AIDS药物的疗效观察、疫苗效果以及发病机理等的研究。抗AIDS药物的疗效观察一般用SIV急性感染猴模型[1]，给药与感染同步进行。以急性期血浆病毒血症水平的降低为判定依据。治疗AIDS总的目标是抑制病毒和提高机体免疫功能和整体健康水平，三者是互相依存的。因此，单纯用SIV急性感染猴模型是不完善的。鉴于此，笔者摸索建立SIV慢性感染猴模型，观察其发病规律，病程进展，以求建立更适合于抗艾滋病药物的体药效学实验研究的动物模型。
1 材料和方法
1.1 恒河猴、感染毒株和剂量[2]
, 百拇医药
恒河猴17只，用SIVmac251 3MID100(3个100%猴感染剂量)1mL静脉注射。
1.2 血液标本来源和采集
感染后不同时间点从猴静脉采血，分别用于检查血常规，T淋巴细胞亚群CD4、全血和血浆病毒滴定和抗体测定，全部标本均采自未经治疗试验的猴。
1.3 血浆和全血病毒血症水平滴定
见文献[2]。
1.4 荧光抗体和中和抗体测定
荧光抗体测定用自制的SIV抗原片，常规间接免疫荧光法测定。中和抗体测定：血浆标本1∶5稀释，56℃灭活30min，在96孔板上作系列2倍稀释，从1∶5～1∶160，每孔50μL，作复孔，每50μL加入20～40个TCID(组织培养感染病毒量)SIVmac病毒液，在37℃的CO2孵箱中和30min，加入2×105/mL CEMx174细胞100μL，复置37℃的CO2孵箱，3d换液1次，6d读结果，以最高稀释度血清抑制75%细胞病变为滴度。
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1.5 T淋巴细胞亚群CD4测定
CD4单抗购自北京医科大学免疫室，操作按说明书要求，送中山医科大学免疫检验研究室用细胞流量分析仪计算CD4淋巴细胞比例，最后计算CD4绝对值：nWBC×nLym×nCD4×%。
2 结果
2.1 临床表现和体征
与以前的报导[7]基本类同，大多有浅表淋巴结肿大，有些有脾略肿大和皮肤红斑。最常见的合并症为腹泻，有间歇性或偶发性，易导致体重下降。动物在病死前伴有体重下降，精神、食欲欠佳，不进食，衰竭而死。17只猴在1年内死亡2只，15个月又死亡1只，均死于机体衰竭。
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2.2 血常规和淋巴细胞亚群CD4的检测
系统观察了4只猴的系列资料，感染后2～3周白细胞总数和淋巴细胞亚群CD4绝对值均有所下降，后回升，9个月和9个月后又有下降，成波浪形(图1)。血常规其他指标未见异常。
2.3 血浆和全血的病毒血症水平
血浆和全血检查的标本大部分是两种方法平行进行，小部分为单独进行，各时间点标本数不是一致(血浆标本数4～16份，全血标本数2～9份)。血浆病毒水平10d开始上升，14d达高峰，21d后下降，60d几乎检不出或很低，直至360d。全血病毒水平也是10d开始上升，14d达高峰，持续高滴度至3个月。3个月后有些猴滴度下降，有些仍持续高滴度(约50%)，直至9个月还有半数猴维持低滴度全血病毒血症(图2)。
有2只猴分别死于9.5个月和12个月，尸检显示均死于艾滋病，淋巴组织极度耗竭，这2只猴全血检查一直持续高病毒血症，但均在死亡前2～3个月病毒血症下降，死亡前检测不到病毒。
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为了观察SIV感染猴全血病毒滴度降至测不出的水平时，用SIV再感染能否重现急性感染时的病毒血症水平。笔者用100MID100SIVmac 251静脉注射再感染3只猴，再感染后12d和15d采样测定血浆和全血的病毒滴度。结果只有1只猴12d时全血有低滴度病毒水平(每mL含125TCID)，其余均未检出病毒，表明再感染不能重现高滴度的病毒血症。
图1 SIV感染猴后血液白细胞(WBC)和CD4值的动态变化
图2 SIV感染猴全血和血浆病毒滴度的动态变化2.4 荧光抗体和中和抗体的检测
荧光抗体在感染后14d约有半数出现很低抗体(1∶10阳性)，30d时均有低滴度抗体(1∶40～1∶160)，而2～3个月时抗体可达高滴度(1∶2560～1∶10 240或更高)。如荧光抗体不出现或很低则一般属于急性进展型病例，本次试验未见此型病例。
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中和抗体一般出现较晚，感染后2～3个月有低滴度(1∶5～1∶20)，约半数猴一直维持低滴度，其余可升至1∶40～1∶160。
3 讨论
SIV感染猴模型可用来评价药物抗艾滋病的疗效。近来也有用新生恒河猴先感染病毒3周再给药的方式来观察病程的进展[3]。笔者曾用急性感染猴模型[4]和感染中、晚期的SAIDS模型猴[5]进行评价抗艾滋病药物效果的研究，取得了一定的成效，各有优缺点。中、晚期SAIDS模型可观察到被破坏的淋巴结的修复，但观察抑制病毒血症的效果欠佳，因中、晚期SAIDS猴病毒血症用病毒分离培养方法不易测出，而测定SIV病毒载量拷贝数(RT-PCR)方法繁琐，费用昂贵。本研究测定病毒血症水平除测定血浆外，还测定全血的病毒滴度。对全血培养检测和定量病毒血症水平的敏感性有人已作过比较和报导[6]，这次试验又证实SIV感染猴全血的病毒滴度持续高滴度达3个月，3～8个月仍有半数以上猴维持高水平，9～12个月滴度下降。从而为检测艾滋病感染在进入中、晚期前药物的疗效提供了可能性。使用感染3个月以内的猴作抗艾滋病药物的疗效观察，可模拟人HIV感染者的用药观察，可检测药物抑制病毒的效果及对病程的进展和淋巴结病变的进展的作用。除SIV急性感染猴模型和SIV感染中、晚期的SAIDS模型猴外，还可添加一种SIV慢性感染猴模型，为两种的中间型，以供药物体内筛选时根据不同目的来选择模型。
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淋巴结的病理形态学变化在艾滋病的发展过程中，是一项具有特征性和重要的指标，将另文详述。
本实验SIVmac251感染猴17只，未观察到快速进展型，1年内死亡猴2只(11.8%)，均较过去的观察[7]病程进展慢，死亡率低。作为药物筛选的模型，病程进展太快或太慢均不适宜，感染至死亡宜在6～12个月，1年内的死亡率约50%～80%为佳。因此，用毒力更强的毒株，培育更敏感的基因稳定的猴群，减少个体差异，是今后努力的方向。
基金项目：广东省科委攻关课题(编号：SKkF9813)
作者简介：吴小闲(1928-)，女，研究员；
参考文献：
[1] Lundgren B,Bottiger D,Liungdahl-Stahle E, et al. Antiviral effects of 3'-fluorothymidine and 3'_azidothymidine in cynomolgus monkeys infected with simian immunodeficiency virus [J].Acquired Immune Defic Syndr,1991, 4:489
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[2] 吴小闲，卢耀增，魏强，等.两株SIVmac的滴定和特性[J].中国实验动物学报，1998，6：18
[3] Van Rompay K K A, Cherrington J M, Marthas M L, et al. 9-[2-(phosphonomethoxy)propyl] adenine therapy of established simian immunodeficiency virus infected in infant rhesus macaques[J].Antimicrob Agents Chemother, 1996,40:2586
[4] 吴小闲，卢耀增，何伏秋，等.急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果[J].中国性病艾滋病防治，1996，2：213
[5] 卢耀增，吴小闲，何伏秋，等.中药1号治疗SIVmac感染猴和艾滋病模型猴的观察[J].中国性病艾滋病防治，1995，1：35
[6] 丛，吴小闲，蒋虹，等.全血分离猴免疫缺陷病毒(SIV)的效果观察[J].中国性病艾滋病防治，1997，3：218
[7] 卢耀增，吴小闲，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立[J].中国实验动物学报，1994，2：94
收稿日期：2000-05-22, 百拇医药