五种抗氧化剂对细胞膜紫外线损伤的防护作用
作者：文雯 胡庆柳 朴英杰
单位：文雯(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)；胡庆柳(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)；朴英杰(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)
关键词：维生素E；过氧化氢酶；过氧化物歧化酶；茶多酚；抗氧化剂；细胞膜流动性；紫外线
第一军医大学学报000411 摘要：目的 研究5种抗氧化剂对细胞膜流动性的防护作用。方法 用粘附式细胞仪(ACAS570) 检测。结果与结论 紫外线(UVB)照射能迅速增高NIH3T3细胞中的脂质过氧化物。UVB照射10 min的NIH3T3细胞 (阳性对照组) 膜流动性明显低于阴性对照组(正常NIH3T3细胞，不用UVB照射)。超氧化物歧化酶(SOD)的保护作用不明显，加入该抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性降低到与阳性对照组相同的数量级。维生素E、过氧化氢酶(CAT)、SOD+CAT、茶多酚的保护作用较明显，加入这些抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性与阳性对照组比较，均高出一个数量级。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q461; Q571 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0347-02
The protective effects of five antioxidants against UVB damage to cell membrane
WEN Wen, HU Qing-liu, PIAO Ying-jie
(Central Laboratory, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To study the protective effects of 5 antioxidants against UVB damage to cell membrane. Method The effects were monitored with ACAS570. Results and conclusions It was found that UVB irradiation can rapidly elevate lipoperoxides (LPO) in NIH3T3 cells. The mobility of NIH3T3 cells irradiated for 10 min by UVB was lower than that of control sample (normal NIH3T3 cells). The protective effects of SOD against the cell membrane damage was not significent, because after adding SOD to NIH3T3, the membrane mobility decreased to the same degree as positive control sample (NIH3T3 cells irradiated by UVB for 10 min, without antioxidant added). After adding Vit E, catalase (CAT), SOD+CAT, or green tea polyphenol, membrane mobility of these samples was 10-fold higher than that of the positive sample.
, 百拇医药
Key words: vitamin E; catalase; SOD; china green tea polyphenol; antioxidant; membrane mobility; UVB
在已往的实验中，我们研究了紫外线损伤细胞的特征[1]。本实验研究几种抗氧化剂对细胞膜紫外线(UVB)损伤的防护作用。
1 材料与方法
所用抗氧化剂为：超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、茶多酚、维生素E (Vit E)，均为Sigma公司产品。紫外线灯管功率为15 W，UVB波长为320 nm。紫外光源距照射样品的垂直距离为40 cm。
1.1 粘附细胞仪 (ACAS570) 检测UVB对NIH3T3细胞膜脂质过氧化物 (LPO)的影响
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1.1.1荧光染料的配制 用DMSO将2’, 7’-二氯二乙酸荧光素(2’, 7’-dichlorofluoresin)稀释，10 μl分装，-20 ℃避光保存。使用前用Hanks液稀释成5 μl/ml。
1.1.2 样本设计 样本1：正常NIH3T3细胞，不用UVB照射；样本2：UVB照射10 min的NIH3T3细胞。
1.1.3 实验步骤 细胞经处理后用PBS缓冲液洗2～3次；每个培养皿中加入0.5 ml 2’, 7’-二氯二乙酸荧光素室温孵育30 min；PBS洗5遍；加入0.5 ml PBS上机测试。
1.2 粘附细胞仪(ACAS570)检测UVB对NIH3T3细胞膜流动性的影响
1.2.1荧光染料的配制 将一支荧光染料NBD-C6-HPC溶入1 ml无水乙醇成500 μg/ml，分装成10 μl/支，-20 ℃避光保存。染色前用Hanks液将其稀释成1～10 μ g/ml。
, 百拇医药
1.2.2 样本设计 样本1：正常NIH3T3，不加抗氧化剂，不用UVB照射；样本2：NIH3T3，UVB照射10 min，不加抗氧化剂；样本3：NIH3T3，UVB照射10 min，加SOD (100 μg/ml)；样本4：NIH3T3，UVB照射10 min，加CAT (100 μg /ml)；样本5：NIH3T3，UVB照射10 min，加SOD + CAT (100 μg / ml)；样本6：NIH3T3，UVB照射10 min，加茶多酚 (100 μg / ml)；样本7：NIH3T3，UVB照射10 min，加Vit E (0.1 mmol/L)
1.2.3实验步骤
细胞经培养后去原培养基，加入含有不同浓度抗氧化剂的新培养基，37 ℃培养30 min；去培养基，每个培养皿中加入0.5 ml无酚红Hanks液，用UVB照射相应时间；用Hanks液洗3次；滴入100 μl 1 μg / ml的荧光染料NBD-C6- HPC，4 ℃避光孵育20 min；用Hanks液洗2次；每个皿中加入1 ml无酚红Hanks液，上机测试。
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2 结果
在测定脂质过氧化物 (LPO)的实验中，样本2的荧光平均值和总值均明显高于样本1(图1、2)，说明UVB照射可引起NIH3T3细胞脂质过氧化物急剧升高。在测定细胞膜流动性的实验中，样本1～7膜的流动性依次为：1.12e-09、3.61e-10、7.20e-11、4.37e-10、1.89e-10、1.43e-10、5.22e-10(图3、4)。UVB照射10 min的NIH3T3细胞(样本2)膜流动性明显低于对照组(样本1)。SOD的保护作用不明显，该样本(样本3)细胞膜流动性仍下降到与样本2相同的数量级。其它抗氧化剂均有明显的保护作用，与样本2 (UVB照射10 min，不加抗氧化剂) 相比，均使细胞膜流动性上升了一个数量级。
图1 正常与实验组NIH3T3细胞LPO总荧光值比较
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Fig.1 LPO integrated value of normal NIH3T3 cells and experimental
sample (UVB 10 min, A:Experimental sample; B: Normal NIH3T3 cells)
图2 正常与实验组 NIH3T3细胞LPO平均荧光值比较
Fig.2 LPO average value of normal NIH3T3 cells and experimental
sample (UVB 10 min, A:Experimental sample; B: Normal NIH3T3 cells)
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图3 样本1、2的细胞膜流动性
Fig.3 Membrane mobility of sample 1 and 2
Sample 1: 1.12e- 09；Sample 2: 3.61e- 10
图4 样本3～7的细胞膜流动性
Fig.4 Membrane mobility of sample 3-7
Sample 3: 7.20e- 11；Sample 4: 4.37e- 10；Sample 5: 1.89e- 10；
Sample 6: 1.43e- 10；Sample 7: 5.22e- 10
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3 讨论
SOD的作用是使过氧化物歧化生成H2O2[2]；CAT则催化H2O2生成H2O和O2；Vit E不但是1O2和O2- 的清除剂，而且更重要的是脂质过氧化作用的阻断剂；茶多酚可以有效地阻止低密度脂蛋白的氧化，可阻止低密度脂蛋白中Vit E和其它内源性抗氧化剂的氧化，延迟脂质过氧化的开始[3]。
我们推测，UVB照射后产生的过氧化物被SOD歧化生成H2O2，由于样本3没有外加分解H2O2的抗氧化剂，造成H2O2的积累，导致细胞中脂质过氧化程度加剧，从而使细胞膜流动性降低，不能起到对细胞的保护作用。只有将SOD和分解H2O2的CAT同时加入(样本5)才能起到对细胞的保护作用。鉴于茶多酚和Vit E在细胞中所起的作用，它们对细胞所起的保护作用是不难理解的。
, 百拇医药
我们在过去的实验中证实，紫外线照射可引起细胞凋亡[4、5]。细胞凋亡可由多种因子诱发，Godar[6]用相当剂量 (10% 生存率) 的UVA、UVB和UVC辐照可诱发L5178-R小鼠淋巴瘤细胞的即时和延迟凋亡，认为膜和DNA损伤分别是UVA诱发的即时凋亡和UVB、UVC诱发的延迟凋亡最可能的启动因子。那么，紫外线照射所产生的自由基是不是凋亡的启动因子之一？哪一种自由基所起的作用最大？哪一种抗氧化剂最能有效地防护紫外线所诱发的细胞凋亡？这些都是需要进一步探索的课题。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830390)
作者简介：文 雯(1958-)，女，江苏盐城人，药剂师，现工作单位为广州白云区公费医疗门诊部，电话：87750855
参考文献：
[1] 胡庆柳, 丁振华, 谭小华，等. 紫外辐射损伤NIH3T3细胞的特性[J]. 第一军医大学学报, 1998, 18(1):11.
, http://www.100md.com
[2] 陈 瑗, 周 玫. 自由基医学[M]. 北京:人民军医出版社, 1991.55-66.
[3] Ding ZH, Chen Y, Zhou M, et al. Inhibitory effect of China green teapolyphenol on the oxidative modification of low density lipoprotein by macrophages[J]. Med Sci Res, 1991, 19:767-71.
[4] 胡庆柳，丁振华，谭小华，等. 紫外辐射诱发NIH3T3细胞凋亡时DNA断裂的特性[J]. 生物化学与生物物理进展, 1998, 25(1):53-6.
[5] 胡庆柳, 丁振华, 谭小华，等. 凋亡而不出现DNA梯形带一例[J]. 细胞生物学杂志, 1998, 20(2):76-8.
[6] Godar DE. Preprogrammed and programmed cell death mechanisms of apoptosis:UV-induced immediate and delayed apoptosis[J]. Photochem Photobiol, 1996, 63(6):825-30.
收稿日期：1999-10-12, http://www.100md.com
单位：文雯(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)；胡庆柳(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)；朴英杰(第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515)
关键词：维生素E；过氧化氢酶；过氧化物歧化酶；茶多酚；抗氧化剂；细胞膜流动性；紫外线
第一军医大学学报000411 摘要：目的 研究5种抗氧化剂对细胞膜流动性的防护作用。方法 用粘附式细胞仪(ACAS570) 检测。结果与结论 紫外线(UVB)照射能迅速增高NIH3T3细胞中的脂质过氧化物。UVB照射10 min的NIH3T3细胞 (阳性对照组) 膜流动性明显低于阴性对照组(正常NIH3T3细胞，不用UVB照射)。超氧化物歧化酶(SOD)的保护作用不明显，加入该抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性降低到与阳性对照组相同的数量级。维生素E、过氧化氢酶(CAT)、SOD+CAT、茶多酚的保护作用较明显，加入这些抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性与阳性对照组比较，均高出一个数量级。
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中图分类号：Q461; Q571 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0347-02
The protective effects of five antioxidants against UVB damage to cell membrane
WEN Wen, HU Qing-liu, PIAO Ying-jie
(Central Laboratory, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To study the protective effects of 5 antioxidants against UVB damage to cell membrane. Method The effects were monitored with ACAS570. Results and conclusions It was found that UVB irradiation can rapidly elevate lipoperoxides (LPO) in NIH3T3 cells. The mobility of NIH3T3 cells irradiated for 10 min by UVB was lower than that of control sample (normal NIH3T3 cells). The protective effects of SOD against the cell membrane damage was not significent, because after adding SOD to NIH3T3, the membrane mobility decreased to the same degree as positive control sample (NIH3T3 cells irradiated by UVB for 10 min, without antioxidant added). After adding Vit E, catalase (CAT), SOD+CAT, or green tea polyphenol, membrane mobility of these samples was 10-fold higher than that of the positive sample.
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Key words: vitamin E; catalase; SOD; china green tea polyphenol; antioxidant; membrane mobility; UVB
在已往的实验中，我们研究了紫外线损伤细胞的特征[1]。本实验研究几种抗氧化剂对细胞膜紫外线(UVB)损伤的防护作用。
1 材料与方法
所用抗氧化剂为：超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、茶多酚、维生素E (Vit E)，均为Sigma公司产品。紫外线灯管功率为15 W，UVB波长为320 nm。紫外光源距照射样品的垂直距离为40 cm。
1.1 粘附细胞仪 (ACAS570) 检测UVB对NIH3T3细胞膜脂质过氧化物 (LPO)的影响
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1.1.1荧光染料的配制 用DMSO将2’, 7’-二氯二乙酸荧光素(2’, 7’-dichlorofluoresin)稀释，10 μl分装，-20 ℃避光保存。使用前用Hanks液稀释成5 μl/ml。
1.1.2 样本设计 样本1：正常NIH3T3细胞，不用UVB照射；样本2：UVB照射10 min的NIH3T3细胞。
1.1.3 实验步骤 细胞经处理后用PBS缓冲液洗2～3次；每个培养皿中加入0.5 ml 2’, 7’-二氯二乙酸荧光素室温孵育30 min；PBS洗5遍；加入0.5 ml PBS上机测试。
1.2 粘附细胞仪(ACAS570)检测UVB对NIH3T3细胞膜流动性的影响
1.2.1荧光染料的配制 将一支荧光染料NBD-C6-HPC溶入1 ml无水乙醇成500 μg/ml，分装成10 μl/支，-20 ℃避光保存。染色前用Hanks液将其稀释成1～10 μ g/ml。
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1.2.2 样本设计 样本1：正常NIH3T3，不加抗氧化剂，不用UVB照射；样本2：NIH3T3，UVB照射10 min，不加抗氧化剂；样本3：NIH3T3，UVB照射10 min，加SOD (100 μg/ml)；样本4：NIH3T3，UVB照射10 min，加CAT (100 μg /ml)；样本5：NIH3T3，UVB照射10 min，加SOD + CAT (100 μg / ml)；样本6：NIH3T3，UVB照射10 min，加茶多酚 (100 μg / ml)；样本7：NIH3T3，UVB照射10 min，加Vit E (0.1 mmol/L)
1.2.3实验步骤
细胞经培养后去原培养基，加入含有不同浓度抗氧化剂的新培养基，37 ℃培养30 min；去培养基，每个培养皿中加入0.5 ml无酚红Hanks液，用UVB照射相应时间；用Hanks液洗3次；滴入100 μl 1 μg / ml的荧光染料NBD-C6- HPC，4 ℃避光孵育20 min；用Hanks液洗2次；每个皿中加入1 ml无酚红Hanks液，上机测试。
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2 结果
在测定脂质过氧化物 (LPO)的实验中，样本2的荧光平均值和总值均明显高于样本1(图1、2)，说明UVB照射可引起NIH3T3细胞脂质过氧化物急剧升高。在测定细胞膜流动性的实验中，样本1～7膜的流动性依次为：1.12e-09、3.61e-10、7.20e-11、4.37e-10、1.89e-10、1.43e-10、5.22e-10(图3、4)。UVB照射10 min的NIH3T3细胞(样本2)膜流动性明显低于对照组(样本1)。SOD的保护作用不明显，该样本(样本3)细胞膜流动性仍下降到与样本2相同的数量级。其它抗氧化剂均有明显的保护作用，与样本2 (UVB照射10 min，不加抗氧化剂) 相比，均使细胞膜流动性上升了一个数量级。
图1 正常与实验组NIH3T3细胞LPO总荧光值比较
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Fig.1 LPO integrated value of normal NIH3T3 cells and experimental
sample (UVB 10 min, A:Experimental sample; B: Normal NIH3T3 cells)
图2 正常与实验组 NIH3T3细胞LPO平均荧光值比较
Fig.2 LPO average value of normal NIH3T3 cells and experimental
sample (UVB 10 min, A:Experimental sample; B: Normal NIH3T3 cells)
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图3 样本1、2的细胞膜流动性
Fig.3 Membrane mobility of sample 1 and 2
Sample 1: 1.12e- 09；Sample 2: 3.61e- 10
图4 样本3～7的细胞膜流动性
Fig.4 Membrane mobility of sample 3-7
Sample 3: 7.20e- 11；Sample 4: 4.37e- 10；Sample 5: 1.89e- 10；
Sample 6: 1.43e- 10；Sample 7: 5.22e- 10
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3 讨论
SOD的作用是使过氧化物歧化生成H2O2[2]；CAT则催化H2O2生成H2O和O2；Vit E不但是1O2和O2- 的清除剂，而且更重要的是脂质过氧化作用的阻断剂；茶多酚可以有效地阻止低密度脂蛋白的氧化，可阻止低密度脂蛋白中Vit E和其它内源性抗氧化剂的氧化，延迟脂质过氧化的开始[3]。
我们推测，UVB照射后产生的过氧化物被SOD歧化生成H2O2，由于样本3没有外加分解H2O2的抗氧化剂，造成H2O2的积累，导致细胞中脂质过氧化程度加剧，从而使细胞膜流动性降低，不能起到对细胞的保护作用。只有将SOD和分解H2O2的CAT同时加入(样本5)才能起到对细胞的保护作用。鉴于茶多酚和Vit E在细胞中所起的作用，它们对细胞所起的保护作用是不难理解的。
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我们在过去的实验中证实，紫外线照射可引起细胞凋亡[4、5]。细胞凋亡可由多种因子诱发，Godar[6]用相当剂量 (10% 生存率) 的UVA、UVB和UVC辐照可诱发L5178-R小鼠淋巴瘤细胞的即时和延迟凋亡，认为膜和DNA损伤分别是UVA诱发的即时凋亡和UVB、UVC诱发的延迟凋亡最可能的启动因子。那么，紫外线照射所产生的自由基是不是凋亡的启动因子之一？哪一种自由基所起的作用最大？哪一种抗氧化剂最能有效地防护紫外线所诱发的细胞凋亡？这些都是需要进一步探索的课题。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830390)
作者简介：文 雯(1958-)，女，江苏盐城人，药剂师，现工作单位为广州白云区公费医疗门诊部，电话：87750855
参考文献：
[1] 胡庆柳, 丁振华, 谭小华，等. 紫外辐射损伤NIH3T3细胞的特性[J]. 第一军医大学学报, 1998, 18(1):11.
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[2] 陈 瑗, 周 玫. 自由基医学[M]. 北京:人民军医出版社, 1991.55-66.
[3] Ding ZH, Chen Y, Zhou M, et al. Inhibitory effect of China green teapolyphenol on the oxidative modification of low density lipoprotein by macrophages[J]. Med Sci Res, 1991, 19:767-71.
[4] 胡庆柳，丁振华，谭小华，等. 紫外辐射诱发NIH3T3细胞凋亡时DNA断裂的特性[J]. 生物化学与生物物理进展, 1998, 25(1):53-6.
[5] 胡庆柳, 丁振华, 谭小华，等. 凋亡而不出现DNA梯形带一例[J]. 细胞生物学杂志, 1998, 20(2):76-8.
[6] Godar DE. Preprogrammed and programmed cell death mechanisms of apoptosis:UV-induced immediate and delayed apoptosis[J]. Photochem Photobiol, 1996, 63(6):825-30.
收稿日期：1999-10-12, http://www.100md.com