ATP酶染色退色后复染HE可再显肌纤维类型
作者：张巧全 张平
单位：210029南京医科大学附属脑科医院
关键词：
临床神经病学杂志000435 在神经肌肉疾病的病理诊断和研究中，应用酶组织化学的方法显示肌球蛋白ATP酶的技术(Dubowitz V,et al.Bailliere Yindall,1985)已广泛应用于临床和科研工作中。但是随着时间的推移，ATP酶染色的着色能力逐渐褪色以致于原着色完全消失，从而给回顾性研究神经肌肉疾病产生了很大的困难。我们在开展日常肌肉检查和研究中，在对存放了1～7年后的ATP酶染色完全褪色的玻片进行常规HE染色，结果发现部分切片不但可再显现肌纤维的类型，而且稳定性较好，延长保存时间。现将其方法介绍如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机抽取本院1992～1997年以来部分褪色或完全褪色的ATP酶(pH9.4)切片180张(每年30张)。其中神经源性肌萎缩93例(运动神经元病23例，青年单侧上肢远端肌萎缩23例，成人型脊髓性肌萎缩15例，周围神经源肌萎缩32例 )；肌源性肌损害67例(肌营养不良23例，皮肌炎14例，多发性肌炎23例，筋膜炎4例，II型肌纤维萎缩3例)；其它7例(糖元沉积性肌病1例，脂肪沉积性肌病3例，先天性肌强直症2例，中央轴空病1例)；正常20例。
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1.2 ATP酶(pH 9.4)的配制及染色方法 ATP酶染剂的配制(pH 9.4)：(1)甘氨酸氯化钠储备液：甘氨酸0.75 g，氯化钠0.58 g，蒸馏水加至100 ml。(2)1 mol/L氯化钙储备液：氯化钙14.7 g，蒸馏水加至100 ml。(3)0.1 mol/L氢氧化钠储备液：氢氧化纳4 g，蒸馏水加至100 ml。(4)2%氯化钴溶液：二氯化钴4 g，蒸馏水加至200 ml。(5)1%氯化钙溶液：氯化钙2 g，蒸馏水加至200 ml。(6)ATP酶工作液：注射用三磷酸腺苷二钠(每支2 ml，含20 mg)。(1)、(2)、(3)、(6)4℃冰箱保存，(4)、(5)室温下保存。
ATP酶(pH 9.4)染色步骤：ATP酶孵育液20 ml临时配制：0.1 M NaOH 7 ml,1 M CaCl2 2 ml,0.1 M甘氨酸NaCl 10 ml，ATP酶针剂1 ml。37℃温箱内1.5小时。1% CaCL2 6分钟，2% CoCL2 6分钟，水洗5分钟，经硫化铵稀释液30秒钟，水洗5分钟，最后脱水、透明、封固。
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1.3 HE的配制及染色方法 改良HE1000 ml的配制：硫酸铝5 g溶于蒸馏水750 ml中，为饱和A液。苏木精2 g溶于无水乙醇250 ml中，充分遥匀为B液。将A液与B液混合，至均匀，再将氢化剂碘酸钠0.2 g加入混合液中充分摇匀。放置5分钟，依次加入中和剂丙三醇50 ml和促染剂柠檬酸0.3 g，震荡数分钟，放置过夜后即可使用。
HE的染色步骤：将已褪色的ATP酶(pH 9.4)染色玻片放入纯二甲苯(I)中，依退掉盖玻片为准，进入二甲苯(II)5分钟，无水乙醇(I)1分钟，无水乙醇(II)1分钟，95%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，自来水洗后蒸馏水洗1分钟，入苏木精液10分钟。自来水洗。1%盐酸酒精分化了3秒钟，饱和碳酸锂水溶液或温开水中返蓝30秒钟，入80%乙醇1分钟，0.5%伊红乙醇1分钟，95%乙醇I、II脱水各1分钟，无水乙醇I、II脱水各1分钟，入石炭酸二甲苯混合液透明和吸水1分钟，再经二甲苯I、II各1分钟洗净石炭酸、透明，封片。
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2 结果 1992～1994年的90张ATP酶染色后的切片肉眼和显微镜下均已完全褪色，经HE染色I型与II型肌纤维在所有病例均区分不出来。1995～1996年的60张ATP酶切片肉眼见完全褪色，显微镜下仍可见弱色反应，复染HE后1995年30张切片中。4张显示弱色反应，1996年15张(50%)虽可区分肌纤维的类型，但染色效果较差，这部分病理仍然可作回顾性研究使用。1997年30张肉眼和显微镜下明确显示两型肌纤维的切片，复染HE后两型肌纤维的分型结果良好，色差清晰。
3 讨论 对ATP酶染色后完全褪色或部分褪色的切片几年后复染HE可再显示并区分出肌纤维的类型的方法尚未见报道。我们认为其染色机理可能与ATP酶的活性有关。超过4年以上的ATP酶染色玻片，ATP酶的活性已完全消失，HE染色的结果与其一致。2～4年的ATP酶染色切片仅半数以下或最多半数可以应用于回顾性研究，1年以内的ATP酶染色切片复染HE后进行观察研究，结果可靠，方法简单，效果较稳定，至少可保持半年，最终能延长多久保持时间，尚待我们继续观察。总之，此方法对研究神经肌肉疾病有很大价值。
(收稿1999-09-22), 百拇医药
单位：210029南京医科大学附属脑科医院
关键词：
临床神经病学杂志000435 在神经肌肉疾病的病理诊断和研究中，应用酶组织化学的方法显示肌球蛋白ATP酶的技术(Dubowitz V,et al.Bailliere Yindall,1985)已广泛应用于临床和科研工作中。但是随着时间的推移，ATP酶染色的着色能力逐渐褪色以致于原着色完全消失，从而给回顾性研究神经肌肉疾病产生了很大的困难。我们在开展日常肌肉检查和研究中，在对存放了1～7年后的ATP酶染色完全褪色的玻片进行常规HE染色，结果发现部分切片不但可再显现肌纤维的类型，而且稳定性较好，延长保存时间。现将其方法介绍如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机抽取本院1992～1997年以来部分褪色或完全褪色的ATP酶(pH9.4)切片180张(每年30张)。其中神经源性肌萎缩93例(运动神经元病23例，青年单侧上肢远端肌萎缩23例，成人型脊髓性肌萎缩15例，周围神经源肌萎缩32例 )；肌源性肌损害67例(肌营养不良23例，皮肌炎14例，多发性肌炎23例，筋膜炎4例，II型肌纤维萎缩3例)；其它7例(糖元沉积性肌病1例，脂肪沉积性肌病3例，先天性肌强直症2例，中央轴空病1例)；正常20例。
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1.2 ATP酶(pH 9.4)的配制及染色方法 ATP酶染剂的配制(pH 9.4)：(1)甘氨酸氯化钠储备液：甘氨酸0.75 g，氯化钠0.58 g，蒸馏水加至100 ml。(2)1 mol/L氯化钙储备液：氯化钙14.7 g，蒸馏水加至100 ml。(3)0.1 mol/L氢氧化钠储备液：氢氧化纳4 g，蒸馏水加至100 ml。(4)2%氯化钴溶液：二氯化钴4 g，蒸馏水加至200 ml。(5)1%氯化钙溶液：氯化钙2 g，蒸馏水加至200 ml。(6)ATP酶工作液：注射用三磷酸腺苷二钠(每支2 ml，含20 mg)。(1)、(2)、(3)、(6)4℃冰箱保存，(4)、(5)室温下保存。
ATP酶(pH 9.4)染色步骤：ATP酶孵育液20 ml临时配制：0.1 M NaOH 7 ml,1 M CaCl2 2 ml,0.1 M甘氨酸NaCl 10 ml，ATP酶针剂1 ml。37℃温箱内1.5小时。1% CaCL2 6分钟，2% CoCL2 6分钟，水洗5分钟，经硫化铵稀释液30秒钟，水洗5分钟，最后脱水、透明、封固。
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1.3 HE的配制及染色方法 改良HE1000 ml的配制：硫酸铝5 g溶于蒸馏水750 ml中，为饱和A液。苏木精2 g溶于无水乙醇250 ml中，充分遥匀为B液。将A液与B液混合，至均匀，再将氢化剂碘酸钠0.2 g加入混合液中充分摇匀。放置5分钟，依次加入中和剂丙三醇50 ml和促染剂柠檬酸0.3 g，震荡数分钟，放置过夜后即可使用。
HE的染色步骤：将已褪色的ATP酶(pH 9.4)染色玻片放入纯二甲苯(I)中，依退掉盖玻片为准，进入二甲苯(II)5分钟，无水乙醇(I)1分钟，无水乙醇(II)1分钟，95%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，自来水洗后蒸馏水洗1分钟，入苏木精液10分钟。自来水洗。1%盐酸酒精分化了3秒钟，饱和碳酸锂水溶液或温开水中返蓝30秒钟，入80%乙醇1分钟，0.5%伊红乙醇1分钟，95%乙醇I、II脱水各1分钟，无水乙醇I、II脱水各1分钟，入石炭酸二甲苯混合液透明和吸水1分钟，再经二甲苯I、II各1分钟洗净石炭酸、透明，封片。
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2 结果 1992～1994年的90张ATP酶染色后的切片肉眼和显微镜下均已完全褪色，经HE染色I型与II型肌纤维在所有病例均区分不出来。1995～1996年的60张ATP酶切片肉眼见完全褪色，显微镜下仍可见弱色反应，复染HE后1995年30张切片中。4张显示弱色反应，1996年15张(50%)虽可区分肌纤维的类型，但染色效果较差，这部分病理仍然可作回顾性研究使用。1997年30张肉眼和显微镜下明确显示两型肌纤维的切片，复染HE后两型肌纤维的分型结果良好，色差清晰。
3 讨论 对ATP酶染色后完全褪色或部分褪色的切片几年后复染HE可再显示并区分出肌纤维的类型的方法尚未见报道。我们认为其染色机理可能与ATP酶的活性有关。超过4年以上的ATP酶染色玻片，ATP酶的活性已完全消失，HE染色的结果与其一致。2～4年的ATP酶染色切片仅半数以下或最多半数可以应用于回顾性研究，1年以内的ATP酶染色切片复染HE后进行观察研究，结果可靠，方法简单，效果较稳定，至少可保持半年，最终能延长多久保持时间，尚待我们继续观察。总之，此方法对研究神经肌肉疾病有很大价值。
(收稿1999-09-22), 百拇医药