自杀基因治疗恶性胶质瘤的研究
杨学军 浦佩玉 姚开泰 曹亚 马先勇 张云亭 刘松龄
摘 要 目的：单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV-tk)基因治疗恶性胶质瘤体内外试验。方法：分子克隆及真核细胞基因转染技术构建逆转录病毒(RV)载体pMV7(tk)及PA317tk包装细胞系；体外不同比例混合鼠C6胶质瘤细胞与PA317tk细胞，在GCV(Ganciclovir)作用下观察细胞存活率；建立SD大鼠颅内C6胶质瘤模型(种植5×105C6细胞)，治疗组第3天原位注射5×106PA317tk细胞，5天后腹腔给予GCV(30mg/kg.d)，MRI全程监测肿瘤消长，观察病症及存活期，并行病理检查。结果：在GCV0.1～101μg/ml浓度范围内，C6细胞存活率随PA317tk细胞混入比例增加而逐渐减低(P<0.001)，并具有GCV剂量依赖性(P<0.01)；体内试验治疗组病症轻，生存期延长，MRI表明治疗组肿瘤体积较对照组明显减小(P<0.01)，1个月时病理检查见肿瘤细胞消失，代之以小胶质细胞增生并形成坏死囊。结论：应用本实验室构建的RV载体pMV7(tk)及其PA317tk包装细胞系治疗恶性胶质瘤是一种有效及具有前途的治疗方法。
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关键词：胶质瘤 自杀基因 MRI监测
恶性脑胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，迄今的治疗方法都不能从根本上改变这一致命肿瘤的自然转归。随着胶质瘤分子机理的进一步阐明，近年来有关治疗的研究日益集中于脑肿瘤的分子外科-基因治疗上来。携带自杀基因的逆转录病毒载体及GCV治疗系统是第一个人类胶质瘤体内基因治疗计划[1]。本研究的目的是应用本实验室建立的逆转录病毒载体及包装细胞系，系统进行体外及体内治疗研究，并用MRI全程监测体内试验过程。
1 材料与方法
1.1 RV载体pMV7(tk)及其包装细胞PA317tk的构建
应用分子克隆技术将2.7kb的HSV-tk基因片段连接在pMV7载体质粒上，pMV7(tk)的基本骨架为：5′LTR(MoMSV)-HSV-tk-tk-promoter-NeoR-3′LTR。脂质体法将重组载体转导入双嗜性包装细胞系PA317，定名为PA317tk，Southern与Northern杂交分析证实HSV-tk基因在其中的整合及表达。PA317tk细胞系满足高病毒滴度(105～106cfu/ml)、无辅助病毒产生的要求。PA317tk细胞产生的病毒颗粒体外感染C6鼠胶质瘤细胞，原位杂交表明HSV-tk基因修饰的C6tk细胞中HSV-tk基因表达良好。
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1.2 C6与PA317tk细胞体外共培养
于96孔板，每孔接种细胞总数为4×103，按不同比例加入PA317tk细胞(0,10%～100%)，每种比例设4孔，5%CO2，37℃，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中共同孵育48小时；加入GCV(0.1,100,101μg/ml)，继续培养96小时，观察细胞存活率(MTT法)，取均值。
1.3体内模拟治疗试验
二级实验动物SD大鼠，雄性，体重150～200g。腹腔注射苯巴比妥30mg/kg麻醉。使用鼠立体定向仪，前囟右旁开4mm，前1mm，进针深度5mm，接种部位相当于右侧尾状核头部。微量注射持续时间不少于20分钟，停针5分钟后退针。模拟治疗组：10只鼠，颅内接种5×105C6细胞于20μl无血清DMEM培养基中，第三天颅内原位接种5×106PA317tk细胞于50μl无血清DMEM，再过5天后开始腹腔注射GCV30mg/kg.d，连续给药14天。随机选取2只鼠瘤龄1个月时处死行病理检查，其余8只作长期存活观察。对照组：5只鼠，颅内接种5×105C6细胞，同期等剂量给予GCV。两组动物均用MRI监测肿瘤的消长，常规T1，T2加权成像扫描及强化扫描(Gd-DTPA:0.2mmol/kg,iv)。观察鼠的存活期，常规病理检查及TUNEL法原位凋亡检测。肿瘤体积=(4/3×π×L×W×H)×1/8。
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1.4统计方法
根据不同资料要求，使用的统计学方法有直线相关分析，方差分析，秩和检验，结果以P<0.05为差别有显著性，P>0.05无显著性。
2 结果
2.1 C6与PA317tk按不同比例体外混合培养
如附表。在GCV0.1～101μg/ml浓度范围内，C6细胞的存活率随PA317tk细胞混入比例的增加而逐渐降低，两者在统计学上呈明显的负相关(P<0.001)，并具有明显的GCV剂量依赖性(F=445.56,P<0.01)。
附表 C6细胞与PA317tk细胞按不同比例混合在GCV作用下细胞存活率观察(%)
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2.2体内治疗试验
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对照组肿瘤细胞接种后出现不同程度的进食、饮水量减少，攻击性减弱(个别鼠接种早期出现攻击性增强)，随后出现行走不稳，摄食动作不协调，偏瘫，癫痫(仅观察到1例)，濒死前可出现毛发竖起，呼吸急促，结膜眶周及消化道出血。本组5只鼠生存期均不超过20天，中位生存期为16天。影像学(图1)及病理组织学检查表明，C6细胞种植组虽然同样接受了GCV治疗，但在瘤龄两周行MRI检查时，颅内仍然可见强化明显的肿瘤影像。死亡后病理检查发现肿瘤内有出血和坏死，新生血管活跃，瘤细胞呈假栅栏状排列并向正常脑组织浸润，无包膜形成。原位凋亡检查仅见个别细胞出现凋亡。
图1 对照组瘤龄2周时强化MRI肿瘤影像(冠状位)
颅内肿瘤C6-PA317tk模拟治疗组治疗早期可出现上述一般表现，个别鼠出现行走不稳，动作不协调。在瘤龄14天时(包装细胞接种12天，GCV治疗7天)MRI检查(图2)，与对照组比较 ，两组间肿瘤体积具有显著性差别，秩和检验P<0.01。C6-PA317tk模拟治疗组在存活30天复查MRI时(图3)，9例中有7例肿瘤完全消失，2例可见残余肿瘤(24.98mm3,9.36mm3)。病理学检查2周时仍可见明显肿瘤组织，HE切片显示肿瘤组织中间杂有片状坏死灶；1个月时肿瘤基本消失，肿瘤部位形成软化灶，同侧脑室扩大，HE切片见病灶中主要为格子细胞及小胶质细胞。治疗组长期存活观察的8只鼠存活均超过90天。
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图2 治疗组瘤龄2周时强化MRI肿瘤影像(冠状位)
图3 治疗组瘤龄1个月时强化MRI表现(冠状位)
3 讨论
恶性胶质瘤基因治疗的策略主要集中在两方面：创造理想的载体及基因转移方式；发现并选择可用于治疗的靶基因[2]。HSV-tk基因作为自杀基因的突出代表[3]，其开放读框由启始密码子AUG至终止密码子UGA，共1128个核苷酸，所编码的HSV-TK酶能够催化许多核苷类似物(如ACV,GCV,BVdU等)的一磷酸化，然后进一步使之二磷酸化及三磷酸化，哺乳动物细胞内源性TK酶可参与后一过程。所形成的药物三磷酸毒性分子，可以抑制DNA多聚酶并竞争性的掺入细胞DNA链中，使DNA链破碎，杀死细胞。哺乳动物细胞的内源性TK，其底物范围较窄，对GCV的亲和力非常低，因而不产生系统毒性。应用携带自杀基因的RV载体治疗脑肿瘤的优势在于：RV载体只能在DNA合成活跃的肿瘤细胞中整合及表达目的基因，周围正常脑组织不能被转染治疗基因，因而不受GCV的影响；恶性脑胶质瘤相对局限，很少远隔转移；另外被转导的肿瘤细胞及RV载体的包装细胞可以被宿主免疫系统及GCV治疗所杀死，消除了插入突变的潜在危险；再者，脑是部分免疫特权器官，可以允许鼠源的包装细胞存活一定时间以较充分的转导肿瘤[4]。
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在体外试验中，我们对比鼠胶质瘤C6细胞在转导HSV-tk基因前后对GCV的敏感性，证实C6tk细胞的半数致死量约为C6细胞的1/1000，原位杂交也证明C6tk细胞中HSVtk的良好表达(资料本文未包括)，这与文献报道基本一致[5]。将C6细胞与PA317tk细胞按照不同比例共培养，发现C6细胞的存活率与混入PA317tk细胞的比率成负相关，并在GCV有效浓度内(0.1μg/ml～10μg/ml)具有明显的剂量依赖性。
本试验所建立的SD鼠颅内C6胶质瘤模型，肿瘤免疫组织化学染色均有GFAP及S100蛋白的表达，说明了肿瘤胶质细胞来源性未变[6]。本模型成瘤时间短，瘤细胞呈假栅栏状排列，新生血管活跃，肿瘤内有出血和坏死，向正常脑组织内浸润生长，无包膜，符合脑肿瘤的病理状况。我们全程采用高分辨率MRI监测治疗组与对照组颅内肿瘤消长，冠状及矢状薄层扫描直观了解肿瘤影像，并常规行T1、T2加权及强化成像检查。每只鼠在MRI片上不仅注明编号还标记治疗组别、检查日期，并与相应病理组织学检查发现对照，使试验结果更加严格准确。
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向脑肿瘤内移植在一段时间内(一般7～14天)可以持续产生病毒的包装细胞来增加瘤床中可被利用的载体总量来解决病毒滴度低的问题是一种重要的治疗策略[7]。我们在颅内也注射了10倍于初始瘤细胞数目(5×105)的包装细胞，原位杂交结果虽然显示有部分肿瘤细胞未能被转移治疗基因(资料本文未包括)，但治疗组肿瘤植反应轻微，1个月时肿瘤可达影像学消失，病理反应以胶质细胞增生为特点，生存期明显延长，而对照组病症逐渐加重，出现偏瘫、癫痫、结膜及消化道出血，存活均不超过20天.
基因治疗所应用的载体、肿瘤模型、治疗基因的表达情况都会影响到最终的基因转移率[8]，虽然改造载体、引入强启动子上调治疗基因的表达不失为一种尝试，但在目前尚无其它良策进一步提高基因转移率的情况下，治疗模式的优化成为又一研究领域.
参考文献
, 百拇医药
1 Oldfield EH. Gene therapy for the rteatment of brain tumors using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir.Hum Gene Ther,1993;4:39
2 Liau LM,Black KL.Gene therapy for malignant glioma.Crit Rev Neurosurg,1996;6:178
3 Rogulski KR,Kim JH,Kim SH,et al.Glioma cells transduced with an Escherichia coli CD/HSV-1TK fusion gene exhibit enhanced metabolic suicide and radiosensitivity.Hum Gene Ther,1997;8:73
, 百拇医药
4 杨学军，浦佩玉.胶质瘤基因治疗的基因转移系统及旁效应机制.国外医学神经病学神经处科学分册，1997;24:116
5 Barba D,Hardin J,Ray J,et al.Thmidine kinase-mediated killing of rat brain tumors.J Neurosurg,1993;79:229
6 Peterson DL,Sheridan PJ,Brown WE Jr.Animal models for brain tumors:historical perspectives and future directions.J Neurosurg,1994;80:865
7 Takamiya Y,Short MP,Moolten FL,et al .An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumors.J Neurosurg,1993;70:104
8 杨学军，浦佩玉.神经胶质瘤基因治疗的载体研究进展.中华神经处科杂志，1997;13(5):306
作者单位：杨学军 浦佩玉 天津医科大学总医院神经外科(天津市 300052)
姚开泰 曹 亚 马先勇湖南医科大学肿瘤研究所
张云亭 刘松龄 天津医科大学总医院放射科, 百拇医药
摘 要 目的：单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV-tk)基因治疗恶性胶质瘤体内外试验。方法：分子克隆及真核细胞基因转染技术构建逆转录病毒(RV)载体pMV7(tk)及PA317tk包装细胞系；体外不同比例混合鼠C6胶质瘤细胞与PA317tk细胞，在GCV(Ganciclovir)作用下观察细胞存活率；建立SD大鼠颅内C6胶质瘤模型(种植5×105C6细胞)，治疗组第3天原位注射5×106PA317tk细胞，5天后腹腔给予GCV(30mg/kg.d)，MRI全程监测肿瘤消长，观察病症及存活期，并行病理检查。结果：在GCV0.1～101μg/ml浓度范围内，C6细胞存活率随PA317tk细胞混入比例增加而逐渐减低(P<0.001)，并具有GCV剂量依赖性(P<0.01)；体内试验治疗组病症轻，生存期延长，MRI表明治疗组肿瘤体积较对照组明显减小(P<0.01)，1个月时病理检查见肿瘤细胞消失，代之以小胶质细胞增生并形成坏死囊。结论：应用本实验室构建的RV载体pMV7(tk)及其PA317tk包装细胞系治疗恶性胶质瘤是一种有效及具有前途的治疗方法。
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关键词：胶质瘤 自杀基因 MRI监测
恶性脑胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，迄今的治疗方法都不能从根本上改变这一致命肿瘤的自然转归。随着胶质瘤分子机理的进一步阐明，近年来有关治疗的研究日益集中于脑肿瘤的分子外科-基因治疗上来。携带自杀基因的逆转录病毒载体及GCV治疗系统是第一个人类胶质瘤体内基因治疗计划[1]。本研究的目的是应用本实验室建立的逆转录病毒载体及包装细胞系，系统进行体外及体内治疗研究，并用MRI全程监测体内试验过程。
1 材料与方法
1.1 RV载体pMV7(tk)及其包装细胞PA317tk的构建
应用分子克隆技术将2.7kb的HSV-tk基因片段连接在pMV7载体质粒上，pMV7(tk)的基本骨架为：5′LTR(MoMSV)-HSV-tk-tk-promoter-NeoR-3′LTR。脂质体法将重组载体转导入双嗜性包装细胞系PA317，定名为PA317tk，Southern与Northern杂交分析证实HSV-tk基因在其中的整合及表达。PA317tk细胞系满足高病毒滴度(105～106cfu/ml)、无辅助病毒产生的要求。PA317tk细胞产生的病毒颗粒体外感染C6鼠胶质瘤细胞，原位杂交表明HSV-tk基因修饰的C6tk细胞中HSV-tk基因表达良好。
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1.2 C6与PA317tk细胞体外共培养
于96孔板，每孔接种细胞总数为4×103，按不同比例加入PA317tk细胞(0,10%～100%)，每种比例设4孔，5%CO2，37℃，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中共同孵育48小时；加入GCV(0.1,100,101μg/ml)，继续培养96小时，观察细胞存活率(MTT法)，取均值。
1.3体内模拟治疗试验
二级实验动物SD大鼠，雄性，体重150～200g。腹腔注射苯巴比妥30mg/kg麻醉。使用鼠立体定向仪，前囟右旁开4mm，前1mm，进针深度5mm，接种部位相当于右侧尾状核头部。微量注射持续时间不少于20分钟，停针5分钟后退针。模拟治疗组：10只鼠，颅内接种5×105C6细胞于20μl无血清DMEM培养基中，第三天颅内原位接种5×106PA317tk细胞于50μl无血清DMEM，再过5天后开始腹腔注射GCV30mg/kg.d，连续给药14天。随机选取2只鼠瘤龄1个月时处死行病理检查，其余8只作长期存活观察。对照组：5只鼠，颅内接种5×105C6细胞，同期等剂量给予GCV。两组动物均用MRI监测肿瘤的消长，常规T1，T2加权成像扫描及强化扫描(Gd-DTPA:0.2mmol/kg,iv)。观察鼠的存活期，常规病理检查及TUNEL法原位凋亡检测。肿瘤体积=(4/3×π×L×W×H)×1/8。
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1.4统计方法
根据不同资料要求，使用的统计学方法有直线相关分析，方差分析，秩和检验，结果以P<0.05为差别有显著性，P>0.05无显著性。
2 结果
2.1 C6与PA317tk按不同比例体外混合培养
如附表。在GCV0.1～101μg/ml浓度范围内，C6细胞的存活率随PA317tk细胞混入比例的增加而逐渐降低，两者在统计学上呈明显的负相关(P<0.001)，并具有明显的GCV剂量依赖性(F=445.56,P<0.01)。
附表 C6细胞与PA317tk细胞按不同比例混合在GCV作用下细胞存活率观察(%)
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2.2体内治疗试验
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对照组肿瘤细胞接种后出现不同程度的进食、饮水量减少，攻击性减弱(个别鼠接种早期出现攻击性增强)，随后出现行走不稳，摄食动作不协调，偏瘫，癫痫(仅观察到1例)，濒死前可出现毛发竖起，呼吸急促，结膜眶周及消化道出血。本组5只鼠生存期均不超过20天，中位生存期为16天。影像学(图1)及病理组织学检查表明，C6细胞种植组虽然同样接受了GCV治疗，但在瘤龄两周行MRI检查时，颅内仍然可见强化明显的肿瘤影像。死亡后病理检查发现肿瘤内有出血和坏死，新生血管活跃，瘤细胞呈假栅栏状排列并向正常脑组织浸润，无包膜形成。原位凋亡检查仅见个别细胞出现凋亡。
图1 对照组瘤龄2周时强化MRI肿瘤影像(冠状位)
颅内肿瘤C6-PA317tk模拟治疗组治疗早期可出现上述一般表现，个别鼠出现行走不稳，动作不协调。在瘤龄14天时(包装细胞接种12天，GCV治疗7天)MRI检查(图2)，与对照组比较 ，两组间肿瘤体积具有显著性差别，秩和检验P<0.01。C6-PA317tk模拟治疗组在存活30天复查MRI时(图3)，9例中有7例肿瘤完全消失，2例可见残余肿瘤(24.98mm3,9.36mm3)。病理学检查2周时仍可见明显肿瘤组织，HE切片显示肿瘤组织中间杂有片状坏死灶；1个月时肿瘤基本消失，肿瘤部位形成软化灶，同侧脑室扩大，HE切片见病灶中主要为格子细胞及小胶质细胞。治疗组长期存活观察的8只鼠存活均超过90天。
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图2 治疗组瘤龄2周时强化MRI肿瘤影像(冠状位)
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3 讨论
恶性胶质瘤基因治疗的策略主要集中在两方面：创造理想的载体及基因转移方式；发现并选择可用于治疗的靶基因[2]。HSV-tk基因作为自杀基因的突出代表[3]，其开放读框由启始密码子AUG至终止密码子UGA，共1128个核苷酸，所编码的HSV-TK酶能够催化许多核苷类似物(如ACV,GCV,BVdU等)的一磷酸化，然后进一步使之二磷酸化及三磷酸化，哺乳动物细胞内源性TK酶可参与后一过程。所形成的药物三磷酸毒性分子，可以抑制DNA多聚酶并竞争性的掺入细胞DNA链中，使DNA链破碎，杀死细胞。哺乳动物细胞的内源性TK，其底物范围较窄，对GCV的亲和力非常低，因而不产生系统毒性。应用携带自杀基因的RV载体治疗脑肿瘤的优势在于：RV载体只能在DNA合成活跃的肿瘤细胞中整合及表达目的基因，周围正常脑组织不能被转染治疗基因，因而不受GCV的影响；恶性脑胶质瘤相对局限，很少远隔转移；另外被转导的肿瘤细胞及RV载体的包装细胞可以被宿主免疫系统及GCV治疗所杀死，消除了插入突变的潜在危险；再者，脑是部分免疫特权器官，可以允许鼠源的包装细胞存活一定时间以较充分的转导肿瘤[4]。
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在体外试验中，我们对比鼠胶质瘤C6细胞在转导HSV-tk基因前后对GCV的敏感性，证实C6tk细胞的半数致死量约为C6细胞的1/1000，原位杂交也证明C6tk细胞中HSVtk的良好表达(资料本文未包括)，这与文献报道基本一致[5]。将C6细胞与PA317tk细胞按照不同比例共培养，发现C6细胞的存活率与混入PA317tk细胞的比率成负相关，并在GCV有效浓度内(0.1μg/ml～10μg/ml)具有明显的剂量依赖性。
本试验所建立的SD鼠颅内C6胶质瘤模型，肿瘤免疫组织化学染色均有GFAP及S100蛋白的表达，说明了肿瘤胶质细胞来源性未变[6]。本模型成瘤时间短，瘤细胞呈假栅栏状排列，新生血管活跃，肿瘤内有出血和坏死，向正常脑组织内浸润生长，无包膜，符合脑肿瘤的病理状况。我们全程采用高分辨率MRI监测治疗组与对照组颅内肿瘤消长，冠状及矢状薄层扫描直观了解肿瘤影像，并常规行T1、T2加权及强化成像检查。每只鼠在MRI片上不仅注明编号还标记治疗组别、检查日期，并与相应病理组织学检查发现对照，使试验结果更加严格准确。
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向脑肿瘤内移植在一段时间内(一般7～14天)可以持续产生病毒的包装细胞来增加瘤床中可被利用的载体总量来解决病毒滴度低的问题是一种重要的治疗策略[7]。我们在颅内也注射了10倍于初始瘤细胞数目(5×105)的包装细胞，原位杂交结果虽然显示有部分肿瘤细胞未能被转移治疗基因(资料本文未包括)，但治疗组肿瘤植反应轻微，1个月时肿瘤可达影像学消失，病理反应以胶质细胞增生为特点，生存期明显延长，而对照组病症逐渐加重，出现偏瘫、癫痫、结膜及消化道出血，存活均不超过20天.
基因治疗所应用的载体、肿瘤模型、治疗基因的表达情况都会影响到最终的基因转移率[8]，虽然改造载体、引入强启动子上调治疗基因的表达不失为一种尝试，但在目前尚无其它良策进一步提高基因转移率的情况下，治疗模式的优化成为又一研究领域.
参考文献
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1 Oldfield EH. Gene therapy for the rteatment of brain tumors using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir.Hum Gene Ther,1993;4:39
2 Liau LM,Black KL.Gene therapy for malignant glioma.Crit Rev Neurosurg,1996;6:178
3 Rogulski KR,Kim JH,Kim SH,et al.Glioma cells transduced with an Escherichia coli CD/HSV-1TK fusion gene exhibit enhanced metabolic suicide and radiosensitivity.Hum Gene Ther,1997;8:73
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4 杨学军，浦佩玉.胶质瘤基因治疗的基因转移系统及旁效应机制.国外医学神经病学神经处科学分册，1997;24:116
5 Barba D,Hardin J,Ray J,et al.Thmidine kinase-mediated killing of rat brain tumors.J Neurosurg,1993;79:229
6 Peterson DL,Sheridan PJ,Brown WE Jr.Animal models for brain tumors:historical perspectives and future directions.J Neurosurg,1994;80:865
7 Takamiya Y,Short MP,Moolten FL,et al .An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumors.J Neurosurg,1993;70:104
8 杨学军，浦佩玉.神经胶质瘤基因治疗的载体研究进展.中华神经处科杂志，1997;13(5):306
作者单位：杨学军 浦佩玉 天津医科大学总医院神经外科(天津市 300052)
姚开泰 曹 亚 马先勇湖南医科大学肿瘤研究所
张云亭 刘松龄 天津医科大学总医院放射科, 百拇医药