Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病基因诊断与基因突变情况的调查
王立明 闵志廉 朱有华 齐隽 缪为民 陈建鹤 焦炳华
述 评 Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKDⅠ)是泌尿外科最常见的遗传性疾病，危害大，临床缺乏有效的诊治方法。本文作者采用分子遗传学手段对ADPKDⅠ基因做了分析，为寻找具有普遍意义的突变方式做了一定的工作；同时在汉族人群中对ADPKDⅠ紧密连锁的微卫星SM7的多态信息含量作了计算，证实可利用其对ADPKDⅠ作出基因诊断。这对临床早期诊断，让患者作出再生殖选择，提供了一个有效而方便的方法。
中华医学会泌尿外科学会主任委员
上海医科大学华山医院院长、教授 张元芳
上海医科大学泌尿外科研究所所长
摘 要 目的：(1) 建立Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKDⅠ)的基因诊断方法；(2) 寻找具有普遍意义的突变方式，以优化基因诊断。方法：(1) 采用Southern杂交和 PCR 方法， 调查ADPKDⅠ基因3′端单拷贝区突变情况；(2) PCR扩增分析微卫星SM7。结果：将AH4与16例患者的基因组DNA进行Southern杂交后， 均显示有正常的15 kb的杂交片段。对27例患者ADPKD Ⅰ基因3′端AH4和JH14两探针间的5.72kb 基因组DNA行PCR扩增后，未发现5.5kb基因组DNA缺失。109名正常人SM7 PCR扩增显示，其多态信息含量(PIC)值为0.76，3个家系的SM7 等位片段与疾病基因连锁关系明确。结论：在汉族中：(1) ADPKDⅠ基因3′ 端单拷贝区无常见性大片段基因组DNA缺失类突变；(2) SM7所含PIC 较高，用其可在70%～80%的ADPKDⅠ家系中作出基因诊断。
关键词：肾，多囊，常染色体显性 突变 诊断，基因
Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKDⅠ)临床发病率为1/1000[1]，是成人肾衰的第3大原因。人们对其病因、发病机制一直缺乏了解，更无合适的诊治手段。近10年来，对其基因的研究是从根本上诊治此病的途径，虽已取得不少突破性进展，但仍不够理想[2]。 本研究旨在建立用SM7对其进行基因诊断的方法，并力图寻找具有普遍意义的突变方式，为优化基因诊断作出努力。
1 材料和方法
1.1 研究对象 (1)随机收集109名体检者， 男28名，女81名，年龄52～100岁，均为汉族，来自江苏省无锡市。(2) 另从专科门诊中收选ADPKDⅠ家系和27名无血缘关系的该病患者。ADPKDⅠ诊断标准：B超或CT证实有多囊肾、多囊肝，有家族史；家系标准是至少两代人、两个以上患者。 家系1：多囊肾患者2人，健康者1人；家系2，3：均为患者和健康者各2名； 家系4：患者3人，健康者2名。
1.2 DNA样本的获取 取外周血8～10ml， (1)按经典法，分离出血白细胞，酚-氯仿抽提DNA；(2) 按“低渗法”，红细胞直接用5 倍体积的双蒸水破碎，沉淀即白细胞，以后同(1)；(3) 按“包块法”，将上述得到的血白细胞置于1.5%低熔点琼脂糖，分制成数个100μl的小块， 再经蛋白酶K，RNA酶消化得到DNA样本。
1.3 ADPKDⅠ基因3′ 端单拷贝区突变情况的调查 (1) cDNA探针AH4(荷兰Leiden大学人类基因组系提供),位于ADPKDⅠ基因3′端和结节性硬化症(TSC2) 基因3′端单拷贝区中的两个BamHⅠ酶切位点之内(图1),按碱裂解法制备，与经BamHⅠ酶切的ADPKDⅠ患者基因组DNA Southern杂交。(2) PCR方法。扩增 AH4 和JH14探针间约5.72 kb的基因组DNA(图1)，引物序列：AH4F2，5′-GGGLAAG GGAGGATGACAAG-3′；JH14B3，5′-GGGTTTATCAGCAGCAAGCGG-3′；按特异性扩增条件扩增后，产物经12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
图1 ADPKDⅠ基因3′端突变情况图解
Fig 1 A detailed map of mutation in 3′end of ADPKDⅠ gene
DNA probes (open boxes), PBP and TSC2 instead of the transcripts of ADPKDⅠ gene and TSC2 gene (closed boxes) with direction of transcription indicated by an arrow , and cDNAs (stippled boxes) are shown below the genomic map. The known genomic extent of each gene is indicated at the bottom of the diagram. The positions of genomic deletions reported are also indicated by OX875 and OX114. Restriction sites for EcoRⅠ(E), BamHⅠ(B),SacⅠ(S) and XbaⅠ(X) are shown
1.4 微卫星 SM7 扩增方法 引物1：5′-ACATATGTAGTCTTCTGCAGG-3′；引物2：5′-ACAAGAGTGAATCTCTGACAG-3′；按特异性扩增条件扩增产物经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2 结 果
2.1 突变情况 AH4与16例ADPKDⅠ患者的基因组DNA样本Southern杂交后， 均显示有正常的15kb的杂交片段(图2)。对27例患者ADPKDⅠ基因3′端AH4和JH14两探针间的5.72kb基因组DNA PCR扩增结果，未发现文献报道的5.5kb基因组DNA缺失(图3)，当优化PCR条件后，扩增之产物未见有220bp条带，而均有390bp条带。
图2 AH4与ADPKDⅠ患者总DNA 图3 检测突变之PCR产物于12%
Southern印迹杂交情况 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig 2 AH4 was hybridised Fig 3 PCR products indicated
with patients′ genomic mutation on 12% non-den-
DNA by Southern blot aturing acrylamide gels
A:Patient′s genomic DNA；
B:Rabbit′s genomic DNA；
C:DNA marker λ HindⅢ
2.2 SM7扩增情况 109名正常人SM7扩增之片段分布情况见表1，据此按公式[3]算得的PIC值为0.76。对4个ADPKDⅠ家系进行SM7多态连锁分析后，3个家系显示等位片段与疾病基因的连锁关系明确，另1个未能提供信息。例1家系的SM7扩增结果和连锁分析情况见图4，可见家系成员基因型分别为，Ⅰ1:C1/C2，Ⅱ5:C2/C3，Ⅱ3:C1/C4，显示C1片段与病变基因连锁。
表1 SM7等位片段分布情况
Tab 1 Details of SM7 alleles
(n=100)
SM7
Allele length(bp)
Allele frequency(%)
S1
≥110
18
S2
<110, ≥100
23
S3
<100, ≥90
25
S4
<90, ≥80
21
S5
<80
13
S1→S5 have been used to identify alleles of marker SM7 in various length space
图4 家系1 SM7 PCR扩增产物 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig 4 Polymorphisms of SM7 in family 1 on 12% non-denaturing acrylamide gels
3 讨 论
1994年， 欧洲多囊肾协作组报道了克隆到ADPKDⅠ基因[4]，其结构特点是 3′ 末端1/3的基因组区段是单拷贝，5′端2/3是重复区域(图1)，因此寻找突变的工作相当困难。Harris等用1A1H6和CW10两个cDNA探针，对282个无血缘关系的ADPKDⅠ患者进行了基因组DNA Southern杂交，作突变筛查，结果发现2例3′末端单拷贝区的突变，其中1例为5.5kb的缺失(图1)，另1例是个新生(de novo)突变，有2 kb的基因组DNA 缺失。 此外， 他们采用RT-PCR法对另外48例患者cDNA的3′ 末端单拷贝区进行了筛查，又发现1 例拼接突变[4]。Sehneider等[5]用单链构象多态性(SSCP)及DNA测序技术对ADPKDⅠ患者3′末端单拷贝区的8个外显子逐一进行了分析，又发现了3个错义突变。本研究采用ADPKDⅠ3′末端cDNA探针AH4，与16例无血缘关系患者的DNA进行Southern杂交，检查ADPKDⅠ基因3′末端至5′端一侧的BamHⅠ酶切位点间约9kb的间距内， 有无大片段基因组DNA缺失，或增加，或酶切位点改变等。 结果均出现了15kb的正常条带，未发现有明显的缺失突变(图2)；同时合成AH4F2和JH14B3一对引物，采用PCR方法，对AH4和JH14两个探针间约5.72kb的基因组DNA进行了检查(图1)，共筛检27例患者，亦未发现有Harris报道的5.5kb的缺失，均显示仅有390bp的扩增条带，而未发现有220bp条带(图3)。因此认为：我国ADPKDⅠ患者中，ADPKDⅠ基因3′端单拷贝区无常见性大片段基因组DNA 缺失类突变。
自1985年Reeders首先发现ADPKDⅠ基因与距α-珠蛋白基因族约8kb的高变序列(3′HVR)间的遗传联系之后， 人们陆续得到了许多与此基因连锁的多态遗传标记，均可通过Southern杂交和RFLP分析方法对ADPKDⅠ作出基因诊断。 在我国，1991年刘国仰等[6]首先报道用3′HVR探针对ADPKDⅠ进行基因诊断成功。此后一些研究者亦相继报道了类似的工作，但采用的具体实验方法均为Southern杂交和RFLP分析方法。1990年Saris等[7]采用PCR技术及变性梯度凝胶电泳的方法，通过分析ADPKDⅠ基因旁侧26-6位点的多态性，进行家系连锁分析，成功地对一个ADPKDⅠ家系进行了基因诊断，开创了PCR技术在ADPKDⅠ基因诊断中应用的先例，但变性梯度凝胶的方法仍较繁琐。1991年Harris等[8]在16号染色体质粒文库中寻找分离到一个与ADPKDⅠ紧密连锁的微卫星SM7，设计了相应的引物， 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色的方法，使ADPKDⅠ基因诊断更加简便、 快速。 他们在高加索人中分析了SM7的PIC，发现SM7有11个等位片段，PIC为0.63，将其用于12个ADPKDⅠ家系的多态连锁分析，获得了满意的结果，从而确定了SM7作为ADPKDⅠ的一个多态遗传性标记的价值。 此后Turco等[9]也成功地运用此法对1例ADPKDⅠ幼儿进行了症状前诊断。本研究通过加大 DNA模板量、增加聚丙烯酰胺凝胶浓度、减少凝胶厚度等改进方法，优化了实验条件，使SM7扩增之条带清晰可见。同时凝胶的长度也可大大缩短， 同Harris报道的40cm长不同，只需15cm长即足以将SM7条带分开至能进行连锁分析的程度，这为凝胶的染色、移动等操作带来了很大的方便，并大大简化了实验操作过程。其次，我们的初步研究结果亦显示，SM7所含的PIC较高(为0.76)，表明约在70%～80%的ADPKDⅠ家系中可以作出基因诊断。本组4个家系有3个得到了明确诊断(图4)，即说明了这一点。其中一个家系未能作出基因诊断，可能是因SM7标记在此家系中不能提供遗传信息，即不显示多态性，或是Ⅱ型ADPKD[10]。该结果表明， 较高加索人而言，在我国汉族人群中微卫星SM7具有更高的PIC值，更适宜用于ADPKDⅠ基因诊断。
虽然从已有的研究资料显示，利用SM7多态性可在70%～80%的ADPKDⅠ家系中作出基因诊断，这极有利于再生殖选择，避免了相当多的患儿继续出生。但仍有约20%～30% 的家系不适用，此时仍需联合应用其他多态性遗传标记合并Southern方法才能对其作出基因诊断。因此，从方便基因诊断的角度来说， 尽快从已克隆的ADPKDⅠ基因中找到具有普遍意义的突变方式，仍是目前当务之急。
王立明，男，1965年6月生，博士，副主任医师
作者单位：王立明 闵志廉 朱有华 齐 隽 长征医院泌尿外科，上海，200003；
缪为民 陈建鹤 焦炳华 第二军医大学基础医学生物学教研室
参 考 文 献
[1] 王志仁, 唐德云, 梁才栋, 等. 承德地区 11 807人中肾囊肿与多囊肾发生率的调查报告. 临床泌尿外科杂志, 1993,8(1):46
[2] The international polycystic kidney disease consortium. Polycystic kidney disease: the complete structure of the PKDⅠ gene and its protein. Cell,1995,81(2):289
[3] 任 波, 张贵寅. 微小卫星体与遗传特性的连锁分析. 国外医学*遗传学分册, 1994,2(2): 84
[4] The european polycystic kidney disease consortium. The polycystic kidney disease Ⅰ gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. Cell, 1994,77(6):881
[5] Schneider MC, Zhang F, Geng L, et al. Identification of the autosomal dominant polycystic kidney disease gene,PKDⅠ. Am J Hum Genet, 1994，55(Suppl):81
[6] 刘国仰, 刘 忡,张小晓, 等. 成人型多囊肾病的基因诊断. 中华医学遗传学杂志, 1994,11(3):138
[7] Saris JJ, Breuning MH, Daunerse HG, et al. Rapid detection of polymorphism near gene for adult polycystic kidney disease. Lancet, 1990,335(8697):1102
[8] Harris PC, Thomas S, Ratcliffe PJ, et al. Rapid genetic analysis of families with polycystic kidney disease Ⅰ by means of a microsatellite marker. Lancet, 1991，338(14):1484
[9] Turco AE, Padovani EM, Chiaffoni GP, et al. Molecular genetic diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease in a newborn with bilateral cystic kidneys detected prenatally and multiple steletal malformations. J Med Genet, 1993,30(11): 419
[10] Iglesias D, Fraga AR, Arrizurieta E, et al. Atrial myxoma in awoman with autosomal dominant polycystic kidney disease type 2. Am J Kidney Dis, 1997,29(1):164