矩形髓内钉固定对兔胫骨骨折骨痂含量和成骨细胞内骨形态生成蛋白含量影响
王文良 吴岳嵩 王志伟 王新伟 余永伟
摘 要 目的：探讨钢板和矩形髓内钉固定对兔胫腓骨骨折骨痂含量和成骨细胞内骨形态生成蛋白(BMP)含量的影响。方法：第1部分实验用新西兰兔24只，对同一动物的两侧下肢分别用矩形髓内钉和4孔不锈钢板固定，并分3批于固定后14，21，28 d处死。用免疫组化方法检测骨痂中成骨细胞中BMP的分布，用计算机图像分析系统将结果进行定量分析。第2部分实验用新西兰兔8只，同法制作动物实验模型,于术后56 d摄双侧胫骨X线片，将X线片经计算机图像分析处理系统对骨折处骨痂图像进行定量分析。结果：矩形髓内钉组术后56 d骨痂含量和术后14，21，28 d骨痂中成骨细胞内BMP含量均高于钢板组(P<0.05)。结论:矩形髓内钉内固定胫骨有利于骨折愈合。
关键词：矩形髓内钉 骨折 骨形态生成蛋白
矩形髓内钉是一种可屈性髓内钉[1,2]，主要用于胫腓骨骨折的内固定。长期临床应用和生物力学研究表明，该钉不仅疗效优良，而且具有良好的力学优势，本实验为进一步研究矩形髓内钉内固定对胫骨骨折愈合的影响，探讨了可屈性髓内钉固定与坚强接骨板固定后骨折愈合的不同过程及其机制。
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1 材料和方法
1.1 动物 健康新西兰兔32只，体质量1.8～2.2 kg，购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 仪器和器械 (1) 30 mA X线摄片机。(2)IMS 图像分析处理系统，包括:光源部分；CCD摄像机；计算机图象分析系统；灰度密度分析专用软件。 (3)兔胫骨矩形髓内钉(宽2.2～3.0 mm，厚0.8～0.9 mm，上海钢研所订制)。(4) 4孔钢板，上海浦卫医疗器械厂生产。
1.3 试剂 (1)一抗：BMP-Ab 购自第四军医大学口腔医学院病理科。工作浓度1∶100。(2)二抗：Biotinylated Second antibody goat anti-(Mouse, Rabbit,Guinea Pig and Rat)IgG，为Wak医学化学公司产品，由长海医院病理科免疫室提供。 (3)三抗：Streptoavidin-peroxidase-conjugate，为Wak医学化学公司产品。(4)过氧化氢酶阻断剂(Peroxidase blocking reagent)含有0.03%过氧化氢，Dako公司产品。 (5)10%正常羊血清，为Wak医学化学公司产品。(6)0.01 mol/L PBS，由长海医院病理科免疫室提供。
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1.4 动物模型 动物1%戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位，双上肢固定，双下肢取双膝中段前外侧切口，线锯造成骨折。左膝下0.3 cm，胫前两侧倒“八”字切口，暴露上段胫骨，各打入矩形髓内钉1根(矩形髓内钉组)，右胫骨骨折处用钢板内固定(钢板组)，逐层缝合伤口。术前术后常规80万U青霉素肌注。
1.5 取材 内固定14，21，28 d处死动物(每时间点8只)后,立即取双侧胫骨骨痂标本-80℃冰箱中保存。10%中性缓冲甲醛固定8 h，石蜡包埋。常温下连续切片，切片厚6 μm。
1.6 测定项目 (1)采用金岩等[3]检测骨形态生成蛋白方法，(2)灰度密度积分：细胞染色中出现棕色为阳性反应，每次染色均作对照，用PBS代替BMP-Ab,其结果为阴性。将免疫组化片经图象处理系统，分别于每个标本中手选10个细胞，用密度积分法算出每个细胞平均积分光密度，代表该标本中单个细胞BMP含量。(3)摄片:术后56 d(8只动物)摄取双胫骨X线片，为减少图像误差，将双胫骨放在同一张X线片上摄片，电压65 kV，时间1 s，电流30～40 mA，球管距标本距离35 cm。骨折X线片骨痂区图像，经摄像机输入到图像处理系统，用光标定出实验侧和对照侧骨痂区相同面积(6 mm2)，用积分法算出双侧灰度密度积分。
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1.7 统计学处理 数据以X±s表示，用未配对资料t检验。
2 结 果
2.1 骨痂量比较 矩形髓内钉组骨折处骨痂灰度密度积分值显著高于钢板固定组(P<0.05,表1)。
2.2 成骨细胞内BMP比较 结果表明，术后14，21，28 d时，矩形髓内钉组间每个细胞平均积分光密度均显著高于钢板组(P<0.05，表1)。
表 1 矩形髓内钉组(RIM)与钢板组(PLATE)术后骨痂灰度密度值(术后56 d)与成骨细胞内BMP平均积分光密度值比较
Fig 1 Comparison of Grayscale value and mean D value of PLATE and RIM group(n=8,X±s,D)
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Group
Grayscale value
D
14 d
21 d
28 d
RIM
16 094.00±3 422.96*
56 873.00±4 385.02*
31 580.50±1 749.37*
22 356.63±1 900.97*
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PLATE
13 267.00±4 135.69
48 380.00±1 448.49
26 691.25±3 221.23
19 613.13±3 606.94
* P<0.05 vs PLATE group 3 讨 论
本实验所用的计算机图像分析系统为WDL-I型癌细胞DNA分析系统加免疫组化定量分析专用软件构成，是一种以图像分析方法来测量细胞内物质含量的新技术，称为图像细胞分析术(Image cytometry，ICM),国外病理学界普遍认为是显微分光光度仪的替代产品，能与流式细胞分析术(flow cytometry， FCM)相媲美。ICM具有方法简便，实用而且准确性高等特点。本实验图像分析采用波长为560 nm，免疫组化定量为相对定量，选用同一标准，因而具有可比性。
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骨痂含量与骨折断端间活动有关。骨折一期愈合为放射学上未见骨痂的愈合。临床和实验表明，接骨板刚度越高，骨折愈合时外骨痂越少。骨痂形成可能与骨折周围出现大量介质或因子，如炎症介质，成纤维细胞生长因子(FGF)，骨形态生成蛋白(BMP)，转化生长因子(TGFβ)[5]等，这些物质的产生或数量影响骨折愈合。近年来研究表明骨折断端间微动[6,9]能刺激骨痂生长，促进骨折愈合，增加愈合后骨强度和刚度。Sarmiento的功能支具疗法使骨折段间存在微动，也是促进BMP释放的一种机制。其机制可能与微动刺激局部前列腺素E2(PGE2)释放有关。体外实验表明,当体外培养骨细胞处于周期性应力下时，DNA合成量明显增加，细胞繁殖加速，并且这一现象至少部分受PGE2调节[7]。
微动刺激BMP分泌可能与细微运动能增加骨折区的创伤反应，延长炎症期，并激发炎症和较大的血管反应，因而刺激释放较多的与炎症修复有关的因子，其中包括BMP；微动还可促进PGE2释放量增加，PGE2刺激DNA合成，使血管扩张渗透增加，刺激细胞增殖[7]。BMP分泌可能受多种因素的影响，本实验至少部分提示不同固定方式也是其中的一种影响因子，应力与BMP分泌更明确的关系则需要严格的离体实验来证实。有待于进一步研究。骨折愈合过程中，自血肿内第3天即可检测到BMP分泌，且14 d时骨痂中BMP最为丰富[3,4]，这与本实验结果相似。14 d以后，阳性着色的细胞逐渐减少，细胞内着色的BMP平均积分光密度值逐渐减少，表明BMP分泌具有时像性。Andrew等[8]在骨折后10 d的骨痂中方可观察到成骨细胞、早期成软骨细胞中有BMP2 mRNA表达。矩形髓内钉内固定组成骨细胞内BMP含量显著高于钢板组，这与矩形髓内钉允许骨折端间的微动可能有直接关系。
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通过本实验结果可初步表明,矩形髓内钉内固定后，骨折以二期愈合方式愈合，愈合骨痂丰富，且骨折愈合骨痂中成骨细胞内BMP含量丰富。其BMP分泌旺盛的原因有待于进一步探讨。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39670728
作者简介：王文良，男，1968年4月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院骨科，上海，200433
参考文献
1 吴岳嵩. 矩形髓内钉的设计及其临床应用[J].中华骨科杂志，1991,11(6)：405
2 Wu YS.The treatment of tibial and fibular fractures with a rectangle shaped intramedullary nail[J]. Contempo Orthop, 1993, 26(3):279
, 百拇医药
3 金 岩. 颌骨骨肉瘤中骨形成蛋白的免疫组化定量分析[J]. 中华口腔医学杂志,1991,26(5): 275
4 王茅强. X线图像的数字化增强处理对显示胃壁的实验研究[J]. 中国生物医学工程学报, 1991,11(1):23
5 Iwasaki M,Nakahara H,Nakata k, et al.Regulation of proliferation and osteochodrogenic differentiation of periosteum-derived cells by transforming growth factor-β and basic fibroblast growth factor[J].J Bone Joint Surg Am, 1995,77(4):543
6 张建国, 夏家骝，李华滢，等. 周期性载荷对实验性骨折愈合影响的图像分析[J]. 中华骨科杂志，1995，15(4):220
, http://www.100md.com
7 Brighton CT, Strafford B,Gross SB, et al. The proliferative and synthetic response of isolated calvavial bone cells rats to cyclic biaxial mechanical strain[J]. J Bone Joint Surg Am, 1991,73(3):320
8 Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, et al. Demonstration of TGF-beta 1 mRNA by in situ hybridization in normal human fracture healing[J].Calcif Tissue Int, 1993, 52(2):74
9 江建明，狄勋元，张跃旋. 骨折段细微运动对长骨干骨折愈合的影响[J]. 中华骨科杂志，1996，16(4): 249, 百拇医药
摘 要 目的：探讨钢板和矩形髓内钉固定对兔胫腓骨骨折骨痂含量和成骨细胞内骨形态生成蛋白(BMP)含量的影响。方法：第1部分实验用新西兰兔24只，对同一动物的两侧下肢分别用矩形髓内钉和4孔不锈钢板固定，并分3批于固定后14，21，28 d处死。用免疫组化方法检测骨痂中成骨细胞中BMP的分布，用计算机图像分析系统将结果进行定量分析。第2部分实验用新西兰兔8只，同法制作动物实验模型,于术后56 d摄双侧胫骨X线片，将X线片经计算机图像分析处理系统对骨折处骨痂图像进行定量分析。结果：矩形髓内钉组术后56 d骨痂含量和术后14，21，28 d骨痂中成骨细胞内BMP含量均高于钢板组(P<0.05)。结论:矩形髓内钉内固定胫骨有利于骨折愈合。
关键词：矩形髓内钉 骨折 骨形态生成蛋白
矩形髓内钉是一种可屈性髓内钉[1,2]，主要用于胫腓骨骨折的内固定。长期临床应用和生物力学研究表明，该钉不仅疗效优良，而且具有良好的力学优势，本实验为进一步研究矩形髓内钉内固定对胫骨骨折愈合的影响，探讨了可屈性髓内钉固定与坚强接骨板固定后骨折愈合的不同过程及其机制。
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1 材料和方法
1.1 动物 健康新西兰兔32只，体质量1.8～2.2 kg，购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 仪器和器械 (1) 30 mA X线摄片机。(2)IMS 图像分析处理系统，包括:光源部分；CCD摄像机；计算机图象分析系统；灰度密度分析专用软件。 (3)兔胫骨矩形髓内钉(宽2.2～3.0 mm，厚0.8～0.9 mm，上海钢研所订制)。(4) 4孔钢板，上海浦卫医疗器械厂生产。
1.3 试剂 (1)一抗：BMP-Ab 购自第四军医大学口腔医学院病理科。工作浓度1∶100。(2)二抗：Biotinylated Second antibody goat anti-(Mouse, Rabbit,Guinea Pig and Rat)IgG，为Wak医学化学公司产品，由长海医院病理科免疫室提供。 (3)三抗：Streptoavidin-peroxidase-conjugate，为Wak医学化学公司产品。(4)过氧化氢酶阻断剂(Peroxidase blocking reagent)含有0.03%过氧化氢，Dako公司产品。 (5)10%正常羊血清，为Wak医学化学公司产品。(6)0.01 mol/L PBS，由长海医院病理科免疫室提供。
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1.4 动物模型 动物1%戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位，双上肢固定，双下肢取双膝中段前外侧切口，线锯造成骨折。左膝下0.3 cm，胫前两侧倒“八”字切口，暴露上段胫骨，各打入矩形髓内钉1根(矩形髓内钉组)，右胫骨骨折处用钢板内固定(钢板组)，逐层缝合伤口。术前术后常规80万U青霉素肌注。
1.5 取材 内固定14，21，28 d处死动物(每时间点8只)后,立即取双侧胫骨骨痂标本-80℃冰箱中保存。10%中性缓冲甲醛固定8 h，石蜡包埋。常温下连续切片，切片厚6 μm。
1.6 测定项目 (1)采用金岩等[3]检测骨形态生成蛋白方法，(2)灰度密度积分：细胞染色中出现棕色为阳性反应，每次染色均作对照，用PBS代替BMP-Ab,其结果为阴性。将免疫组化片经图象处理系统，分别于每个标本中手选10个细胞，用密度积分法算出每个细胞平均积分光密度，代表该标本中单个细胞BMP含量。(3)摄片:术后56 d(8只动物)摄取双胫骨X线片，为减少图像误差，将双胫骨放在同一张X线片上摄片，电压65 kV，时间1 s，电流30～40 mA，球管距标本距离35 cm。骨折X线片骨痂区图像，经摄像机输入到图像处理系统，用光标定出实验侧和对照侧骨痂区相同面积(6 mm2)，用积分法算出双侧灰度密度积分。
, 百拇医药
1.7 统计学处理 数据以X±s表示，用未配对资料t检验。
2 结 果
2.1 骨痂量比较 矩形髓内钉组骨折处骨痂灰度密度积分值显著高于钢板固定组(P<0.05,表1)。
2.2 成骨细胞内BMP比较 结果表明，术后14，21，28 d时，矩形髓内钉组间每个细胞平均积分光密度均显著高于钢板组(P<0.05，表1)。
表 1 矩形髓内钉组(RIM)与钢板组(PLATE)术后骨痂灰度密度值(术后56 d)与成骨细胞内BMP平均积分光密度值比较
Fig 1 Comparison of Grayscale value and mean D value of PLATE and RIM group(n=8,X±s,D)
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Group
Grayscale value
D
14 d
21 d
28 d
RIM
16 094.00±3 422.96*
56 873.00±4 385.02*
31 580.50±1 749.37*
22 356.63±1 900.97*
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PLATE
13 267.00±4 135.69
48 380.00±1 448.49
26 691.25±3 221.23
19 613.13±3 606.94
* P<0.05 vs PLATE group 3 讨 论
本实验所用的计算机图像分析系统为WDL-I型癌细胞DNA分析系统加免疫组化定量分析专用软件构成，是一种以图像分析方法来测量细胞内物质含量的新技术，称为图像细胞分析术(Image cytometry，ICM),国外病理学界普遍认为是显微分光光度仪的替代产品，能与流式细胞分析术(flow cytometry， FCM)相媲美。ICM具有方法简便，实用而且准确性高等特点。本实验图像分析采用波长为560 nm，免疫组化定量为相对定量，选用同一标准，因而具有可比性。
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骨痂含量与骨折断端间活动有关。骨折一期愈合为放射学上未见骨痂的愈合。临床和实验表明，接骨板刚度越高，骨折愈合时外骨痂越少。骨痂形成可能与骨折周围出现大量介质或因子，如炎症介质，成纤维细胞生长因子(FGF)，骨形态生成蛋白(BMP)，转化生长因子(TGFβ)[5]等，这些物质的产生或数量影响骨折愈合。近年来研究表明骨折断端间微动[6,9]能刺激骨痂生长，促进骨折愈合，增加愈合后骨强度和刚度。Sarmiento的功能支具疗法使骨折段间存在微动，也是促进BMP释放的一种机制。其机制可能与微动刺激局部前列腺素E2(PGE2)释放有关。体外实验表明,当体外培养骨细胞处于周期性应力下时，DNA合成量明显增加，细胞繁殖加速，并且这一现象至少部分受PGE2调节[7]。
微动刺激BMP分泌可能与细微运动能增加骨折区的创伤反应，延长炎症期，并激发炎症和较大的血管反应，因而刺激释放较多的与炎症修复有关的因子，其中包括BMP；微动还可促进PGE2释放量增加，PGE2刺激DNA合成，使血管扩张渗透增加，刺激细胞增殖[7]。BMP分泌可能受多种因素的影响，本实验至少部分提示不同固定方式也是其中的一种影响因子，应力与BMP分泌更明确的关系则需要严格的离体实验来证实。有待于进一步研究。骨折愈合过程中，自血肿内第3天即可检测到BMP分泌，且14 d时骨痂中BMP最为丰富[3,4]，这与本实验结果相似。14 d以后，阳性着色的细胞逐渐减少，细胞内着色的BMP平均积分光密度值逐渐减少，表明BMP分泌具有时像性。Andrew等[8]在骨折后10 d的骨痂中方可观察到成骨细胞、早期成软骨细胞中有BMP2 mRNA表达。矩形髓内钉内固定组成骨细胞内BMP含量显著高于钢板组，这与矩形髓内钉允许骨折端间的微动可能有直接关系。
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通过本实验结果可初步表明,矩形髓内钉内固定后，骨折以二期愈合方式愈合，愈合骨痂丰富，且骨折愈合骨痂中成骨细胞内BMP含量丰富。其BMP分泌旺盛的原因有待于进一步探讨。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39670728
作者简介：王文良，男，1968年4月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院骨科，上海，200433
参考文献
1 吴岳嵩. 矩形髓内钉的设计及其临床应用[J].中华骨科杂志，1991,11(6)：405
2 Wu YS.The treatment of tibial and fibular fractures with a rectangle shaped intramedullary nail[J]. Contempo Orthop, 1993, 26(3):279
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3 金 岩. 颌骨骨肉瘤中骨形成蛋白的免疫组化定量分析[J]. 中华口腔医学杂志,1991,26(5): 275
4 王茅强. X线图像的数字化增强处理对显示胃壁的实验研究[J]. 中国生物医学工程学报, 1991,11(1):23
5 Iwasaki M,Nakahara H,Nakata k, et al.Regulation of proliferation and osteochodrogenic differentiation of periosteum-derived cells by transforming growth factor-β and basic fibroblast growth factor[J].J Bone Joint Surg Am, 1995,77(4):543
6 张建国, 夏家骝，李华滢，等. 周期性载荷对实验性骨折愈合影响的图像分析[J]. 中华骨科杂志，1995，15(4):220
, http://www.100md.com
7 Brighton CT, Strafford B,Gross SB, et al. The proliferative and synthetic response of isolated calvavial bone cells rats to cyclic biaxial mechanical strain[J]. J Bone Joint Surg Am, 1991,73(3):320
8 Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, et al. Demonstration of TGF-beta 1 mRNA by in situ hybridization in normal human fracture healing[J].Calcif Tissue Int, 1993, 52(2):74
9 江建明，狄勋元，张跃旋. 骨折段细微运动对长骨干骨折愈合的影响[J]. 中华骨科杂志，1996，16(4): 249, 百拇医药