用高效液相色谱方法测定人血浆中美洛昔康浓度
作者：徐海燕 李雪庆 孙璐 钟大放
单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015
关键词：美洛昔康；高效液相色谱法；血浆样品
沈阳药科大学学报000516 摘 要 建立了测定人血浆中美洛昔康浓度的HPLC-UV检测法.以吡罗昔康为内标物，血浆样品经液-液萃取处理后进行HPLC检测.线性范围为20.0～2 000.0 ng/mL，最低定量限为20.0 ng/mL.
分类号 R963
Determination of the Concentration of Meloxicam in Human Plasma by HPLC
Xu Haiyan, Li Xueqing, Sun Lu, Zhong Dafang
, 百拇医药
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract A specific, sensitive and rapid HPLC method with ultraviolet detection was developed and validated to determine meloxicam in human plasma. The pretreatment of the plasma sample was based on single liquid-liquid extraction, using piroxicam as the internal standard. The analytes were determined by ultraviolet detection at 361 nm. A good linearity was achieved in the range of 20.0～2 000.0 ng/mL of meloxicam in human plasma with correlation coefficients of about 0.998. The limit of quantification was 20.0 ng/mL and assay accuracy within±1.9%. Within-day and between-day precisions were within 5.5% and 7.7%, respectively. The method has been successfully applied to the determination of the plasma concentration of meloxicam after an oral dose of 15 mg meloxicam in 20 healthy volunteers(more than 500 samples).
, 百拇医药
Key words meloxicam;HPLC;plasma concentration
美洛昔康(meloxicam)是一种新型烯醇酸类非甾体抗炎药，它通过抑制环氧化酶-2(COX-2)，进而阻断前列腺素(PGs)的合成而发挥抗炎作用.因其胃肠道副作用弱于其他非甾体抗炎药如双氯灭痛、吡罗昔康、吲哚美辛等〔1〕，许多国家已采用美洛昔康代替其他非甾体抗炎药用于治疗风湿性关节炎和骨关节炎. 国外有文献〔2，3〕报道采用柱切换法测定生物样品中美洛昔康的浓度，国内尚未见相关报道.作者旨在建立准确、灵敏、简便的液-液萃取HPLC-UV检测法，并用于测定人血浆中美洛昔康的浓度.下图为美洛昔康和内标物吡罗昔康的结构式.
1 仪器与试剂、药品
1.1 仪器
高效液相色谱系统包括LC—10AT泵，SPD—10A紫外检测器，C—R6A积分仪(日本岛津公司).
, 百拇医药
1.2 药品与试剂
美洛昔康与吡罗昔康对照品由沈阳药科大学药剂教研室提供；Mobic(美洛昔康片剂)由德国Boehringer Ingelheim药厂生产，规格：每片含美洛昔康7.5 mg，批号：80678202；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；人空白血浆由沈阳市中心血站提供.
配制0.5 mg/mL的美洛昔康甲醇溶液作为贮备液.再用甲醇依次稀释得0.2、0.5、1.5、5、10、15 μg/mL的标准系列溶液，于4℃冰箱中保存.
内标溶液为8 μg/mL吡罗昔康甲醇溶液.
2 血浆样品的分析方法
2.1 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18，5 μm，150 mm×5.0 mm I.D.(大连依利特公司)；流动相为乙腈-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液-三乙胺(体积比22∶6∶64∶0.04)；流速为1.0 mL/min；检测波长为361 nm；柱温为室温、纸速为2 mm/min.
, 百拇医药
2.2 血浆样品的测定
取血浆0.5 mL于10 mL具塞试管中，依次加入内标溶液50 μL、3.0 mol/L的磷酸溶液100 μL、正己烷-二氯甲烷-异丙醇(体积比300∶150∶15)提取溶剂2 mL，漩涡混合1 min，振荡10 min，离心(3 000 r/min)10 min.分离上层有机相，40℃氮气流下吹干.残留物加流动相200 μL溶解，取20 μL进样，记录色谱图.
3 结果
3.1 方法专属性
分别取10名受试者的空白血浆0.5 mL，按“血浆样品的测定”项下操作(不加内标)，色谱图如图1A；将一定浓度的美洛昔康标准溶液加到空白血浆中，依同法操作，色谱图如图1B，其中美洛昔康和内标物的保留时间分别为6.6 min和5.1 min；取健康受试者给药后采集的血浆样品0.5 mL，依同法操作，色谱图如图1C.结果表明，血浆中内源性物质不干扰美洛昔康和内标物的测定，且二者的峰形与分离度(R=1.8)较好.
, 百拇医药
Fig.1 HPLC chromatograms of meloxicam and I.S.(piroxicam)in human plasma samples
A—Blank plasma;B—Blank plasma spiked with meloxicam(I.S.peak 1 and meloxicam peak 2)；C—Plasma sample 48 hours after an oral dose of 15 mg meloxicam to a volunteer
3.2 标准曲线与线性范围
取人空白血浆0.5 mL，分别加入美洛昔康标准系列溶液50 μL，使相应血浆浓度分别为20.0、50.0、100.0、500.0、1 000.0、2 000.0 ng/mL，按“血浆样品的测定”项下操作；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰高比值为纵坐标，用加权最小二乘法〔4〕进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线.本方法在20.0～2 000.0 ng/mL范围内线性良好.典型的线性回归方程Y=-0.003 79+0.001 38X，r=0.998 3.最低定量限为20.0 ng/mL.
, 百拇医药
3.3 精密度与准确度
取空白血浆0.5 mL，按“标准曲线”项下方法配制低、中、高3个浓度(分别为20.0、500.0、2 000.0 ng/mL)的质量控制(QC)样品，进行6样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行，计算QC样品的浓度.精密度与准确度结果见表1.数据结果符合目前生物分析方法有关国际规范的要求〔5〕.
3.4 提取回收率与样品稳定性
分别取如前所述低、中、高3种浓度的标准系列溶液，按“血浆样品的测定”项下操作，以提取后的色谱峰高度与提取前的色谱峰高度之比，考察样品的提取回收率.每一浓度进行6样本分析.3种浓度下样品的提取回收率分别为89.1%、91.3%、90.6%.
Tab.1 Accuracy and precision of the HPLC method to determine meloxicam in human plasma
, 百拇医药
Nominal concentration/ng*mL-1
Concentration found/ng*mL-1
RE/%
RSD/%
Intra-day\+a
20.0
19.8
-1.1
5.5
500.0
495.3
, http://www.100md.com
-0.9
2.3
2 000.0
2 000.3
0.2
1.2
Inter-dayb
20.0
20.1
0.6
7.7
500.0
490.4
, 百拇医药
-1.9
4.0
2 000.0
2 009.8
0.5
2.4
a—Six replicates of each sample were analysed;b—Replicates were analysed on three consecutive days 作者初步考察了美洛昔康在不同溶剂中的稳定性.美洛昔康水溶液在4℃下可稳定24 h(4℃下，24 h后，高、中、低3种浓度QC样品的RE%均值分别为-0.1%、-1.9%和-1.1%)，1周后约降解30%；其甲醇溶液相对较稳定，4℃下可稳定1周.
, http://www.100md.com 3.5 方法应用
20名健康男性受试者禁食12 h后，口服15 mg美洛昔康(Mobic 2片).于服药前和服药后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、13.0、24.0、48.0、72.0 h由肘正中静脉取血4 mL并立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5 min后，离心15 min(3 000 r/min)，分离血浆.用本法测定各时间点的血浆样品，代入当日的标准曲线计算美洛昔康的浓度，同时测定QC样本(3个浓度，双样本)以保证结果的可靠性.20名受试者口服15 mg美洛昔康后的平均药-时曲线见图2.
4 讨论
文献中采用柱切换技术测定美洛昔康的血浆药物浓度，由于这种技术需要特殊的仪器设备，且操作难度较大，不易推广.作者采用液-液萃取方法对血浆样品进行预处理，由于检测波长较长，故血浆中的内源性物质不干扰样品的测定.该法简便易行、准确可靠.
, 百拇医药
Fig.2 Profile(mean±s)of plasma concentration of meloxicam versus time after an oral dose of 15 mg meloxicam to 20 healthy volunteers
作者对选用的有机溶剂进行了考察，测定了在不同组成及不同配比的有机溶剂中美洛昔康的提取回收率.结果发现使用正己烷、乙醚和异丙醇混合溶剂时，提取率较低.而使用正己烷、二氯甲烷和异丙醇混合溶剂时，提取率显著提高.另外，考察了正己烷-二氯甲烷-异丙醇配比(体积)分别为100∶50∶5和50∶50∶5时的情况.前者的提取回收率较为理想，且提取稳定.
由于美洛昔康为弱酸性药物,流动相pH值的改变对其保留时间影响较大,因此选用0.05 mol/mL磷酸二氢铵缓冲盐作为流动相的组成部分,使流动相pH保持稳定.此外流动相中加入微量三乙胺可改善色谱峰拖尾现象.
, http://www.100md.com
在应用本法进行的美洛昔康制剂的生物等效性实验中，发现该药在中国健康受试者体内存在代谢多态性现象，有关结果将另文报道〔6〕.
国家自然科学基金资助项目,No.39930180
参考文献
1，Tuerck D, Busch U, Heinzel G, et al. Clinical pharmacokinetics of meloxicam. Arzneim- Forsch/Drug Res, 1997,47:253～258
2，Boulton-Jones JM, Geddes CG, Heinzel G, et al. Melo-xicam pharmacokinetics in renal impairment. Br J Clin Pharmacol, 1997,43:35～40
, 百拇医药
3，Schmid J, Busch U, Heinzel G, et al. Meloxicam. Pha-rmacokinetics and metabolic pattern after intravenous infusion and oral administration to healthy subjects. Drug Metab Dispos, 1995,23:1206～1213
4，钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志,1996,16: 306～312
5，Shah VP, Midha KK, Dighe S, et al. Analytical methods validation:bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies. J Pharm Sci, 1992,81:309～312
6，徐海燕,钟大放,肇丽梅，等.美洛昔康在中国健康受试者体内的药物动力学研究.药学学报.待发表
收稿日期:2000-03-31
, 百拇医药
单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015
关键词：美洛昔康；高效液相色谱法；血浆样品
沈阳药科大学学报000516 摘 要 建立了测定人血浆中美洛昔康浓度的HPLC-UV检测法.以吡罗昔康为内标物，血浆样品经液-液萃取处理后进行HPLC检测.线性范围为20.0～2 000.0 ng/mL，最低定量限为20.0 ng/mL.
分类号 R963
Determination of the Concentration of Meloxicam in Human Plasma by HPLC
Xu Haiyan, Li Xueqing, Sun Lu, Zhong Dafang
, 百拇医药
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract A specific, sensitive and rapid HPLC method with ultraviolet detection was developed and validated to determine meloxicam in human plasma. The pretreatment of the plasma sample was based on single liquid-liquid extraction, using piroxicam as the internal standard. The analytes were determined by ultraviolet detection at 361 nm. A good linearity was achieved in the range of 20.0～2 000.0 ng/mL of meloxicam in human plasma with correlation coefficients of about 0.998. The limit of quantification was 20.0 ng/mL and assay accuracy within±1.9%. Within-day and between-day precisions were within 5.5% and 7.7%, respectively. The method has been successfully applied to the determination of the plasma concentration of meloxicam after an oral dose of 15 mg meloxicam in 20 healthy volunteers(more than 500 samples).
, 百拇医药
Key words meloxicam;HPLC;plasma concentration
美洛昔康(meloxicam)是一种新型烯醇酸类非甾体抗炎药，它通过抑制环氧化酶-2(COX-2)，进而阻断前列腺素(PGs)的合成而发挥抗炎作用.因其胃肠道副作用弱于其他非甾体抗炎药如双氯灭痛、吡罗昔康、吲哚美辛等〔1〕，许多国家已采用美洛昔康代替其他非甾体抗炎药用于治疗风湿性关节炎和骨关节炎. 国外有文献〔2，3〕报道采用柱切换法测定生物样品中美洛昔康的浓度，国内尚未见相关报道.作者旨在建立准确、灵敏、简便的液-液萃取HPLC-UV检测法，并用于测定人血浆中美洛昔康的浓度.下图为美洛昔康和内标物吡罗昔康的结构式.
1 仪器与试剂、药品
1.1 仪器
高效液相色谱系统包括LC—10AT泵，SPD—10A紫外检测器，C—R6A积分仪(日本岛津公司).
, 百拇医药
1.2 药品与试剂
美洛昔康与吡罗昔康对照品由沈阳药科大学药剂教研室提供；Mobic(美洛昔康片剂)由德国Boehringer Ingelheim药厂生产，规格：每片含美洛昔康7.5 mg，批号：80678202；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；人空白血浆由沈阳市中心血站提供.
配制0.5 mg/mL的美洛昔康甲醇溶液作为贮备液.再用甲醇依次稀释得0.2、0.5、1.5、5、10、15 μg/mL的标准系列溶液，于4℃冰箱中保存.
内标溶液为8 μg/mL吡罗昔康甲醇溶液.
2 血浆样品的分析方法
2.1 色谱条件
色谱柱为Hypersil C18，5 μm，150 mm×5.0 mm I.D.(大连依利特公司)；流动相为乙腈-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液-三乙胺(体积比22∶6∶64∶0.04)；流速为1.0 mL/min；检测波长为361 nm；柱温为室温、纸速为2 mm/min.
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2.2 血浆样品的测定
取血浆0.5 mL于10 mL具塞试管中，依次加入内标溶液50 μL、3.0 mol/L的磷酸溶液100 μL、正己烷-二氯甲烷-异丙醇(体积比300∶150∶15)提取溶剂2 mL，漩涡混合1 min，振荡10 min，离心(3 000 r/min)10 min.分离上层有机相，40℃氮气流下吹干.残留物加流动相200 μL溶解，取20 μL进样，记录色谱图.
3 结果
3.1 方法专属性
分别取10名受试者的空白血浆0.5 mL，按“血浆样品的测定”项下操作(不加内标)，色谱图如图1A；将一定浓度的美洛昔康标准溶液加到空白血浆中，依同法操作，色谱图如图1B，其中美洛昔康和内标物的保留时间分别为6.6 min和5.1 min；取健康受试者给药后采集的血浆样品0.5 mL，依同法操作，色谱图如图1C.结果表明，血浆中内源性物质不干扰美洛昔康和内标物的测定，且二者的峰形与分离度(R=1.8)较好.
, 百拇医药
Fig.1 HPLC chromatograms of meloxicam and I.S.(piroxicam)in human plasma samples
A—Blank plasma;B—Blank plasma spiked with meloxicam(I.S.peak 1 and meloxicam peak 2)；C—Plasma sample 48 hours after an oral dose of 15 mg meloxicam to a volunteer
3.2 标准曲线与线性范围
取人空白血浆0.5 mL，分别加入美洛昔康标准系列溶液50 μL，使相应血浆浓度分别为20.0、50.0、100.0、500.0、1 000.0、2 000.0 ng/mL，按“血浆样品的测定”项下操作；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰高比值为纵坐标，用加权最小二乘法〔4〕进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线.本方法在20.0～2 000.0 ng/mL范围内线性良好.典型的线性回归方程Y=-0.003 79+0.001 38X，r=0.998 3.最低定量限为20.0 ng/mL.
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3.3 精密度与准确度
取空白血浆0.5 mL，按“标准曲线”项下方法配制低、中、高3个浓度(分别为20.0、500.0、2 000.0 ng/mL)的质量控制(QC)样品，进行6样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行，计算QC样品的浓度.精密度与准确度结果见表1.数据结果符合目前生物分析方法有关国际规范的要求〔5〕.
3.4 提取回收率与样品稳定性
分别取如前所述低、中、高3种浓度的标准系列溶液，按“血浆样品的测定”项下操作，以提取后的色谱峰高度与提取前的色谱峰高度之比，考察样品的提取回收率.每一浓度进行6样本分析.3种浓度下样品的提取回收率分别为89.1%、91.3%、90.6%.
Tab.1 Accuracy and precision of the HPLC method to determine meloxicam in human plasma
, 百拇医药
Nominal concentration/ng*mL-1
Concentration found/ng*mL-1
RE/%
RSD/%
Intra-day\+a
20.0
19.8
-1.1
5.5
500.0
495.3
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-0.9
2.3
2 000.0
2 000.3
0.2
1.2
Inter-dayb
20.0
20.1
0.6
7.7
500.0
490.4
, 百拇医药
-1.9
4.0
2 000.0
2 009.8
0.5
2.4
a—Six replicates of each sample were analysed;b—Replicates were analysed on three consecutive days 作者初步考察了美洛昔康在不同溶剂中的稳定性.美洛昔康水溶液在4℃下可稳定24 h(4℃下，24 h后，高、中、低3种浓度QC样品的RE%均值分别为-0.1%、-1.9%和-1.1%)，1周后约降解30%；其甲醇溶液相对较稳定，4℃下可稳定1周.
, http://www.100md.com 3.5 方法应用
20名健康男性受试者禁食12 h后，口服15 mg美洛昔康(Mobic 2片).于服药前和服药后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、13.0、24.0、48.0、72.0 h由肘正中静脉取血4 mL并立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5 min后，离心15 min(3 000 r/min)，分离血浆.用本法测定各时间点的血浆样品，代入当日的标准曲线计算美洛昔康的浓度，同时测定QC样本(3个浓度，双样本)以保证结果的可靠性.20名受试者口服15 mg美洛昔康后的平均药-时曲线见图2.
4 讨论
文献中采用柱切换技术测定美洛昔康的血浆药物浓度，由于这种技术需要特殊的仪器设备，且操作难度较大，不易推广.作者采用液-液萃取方法对血浆样品进行预处理，由于检测波长较长，故血浆中的内源性物质不干扰样品的测定.该法简便易行、准确可靠.
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Fig.2 Profile(mean±s)of plasma concentration of meloxicam versus time after an oral dose of 15 mg meloxicam to 20 healthy volunteers
作者对选用的有机溶剂进行了考察，测定了在不同组成及不同配比的有机溶剂中美洛昔康的提取回收率.结果发现使用正己烷、乙醚和异丙醇混合溶剂时，提取率较低.而使用正己烷、二氯甲烷和异丙醇混合溶剂时，提取率显著提高.另外，考察了正己烷-二氯甲烷-异丙醇配比(体积)分别为100∶50∶5和50∶50∶5时的情况.前者的提取回收率较为理想，且提取稳定.
由于美洛昔康为弱酸性药物,流动相pH值的改变对其保留时间影响较大,因此选用0.05 mol/mL磷酸二氢铵缓冲盐作为流动相的组成部分,使流动相pH保持稳定.此外流动相中加入微量三乙胺可改善色谱峰拖尾现象.
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在应用本法进行的美洛昔康制剂的生物等效性实验中，发现该药在中国健康受试者体内存在代谢多态性现象，有关结果将另文报道〔6〕.
国家自然科学基金资助项目,No.39930180
参考文献
1，Tuerck D, Busch U, Heinzel G, et al. Clinical pharmacokinetics of meloxicam. Arzneim- Forsch/Drug Res, 1997,47:253～258
2，Boulton-Jones JM, Geddes CG, Heinzel G, et al. Melo-xicam pharmacokinetics in renal impairment. Br J Clin Pharmacol, 1997,43:35～40
, 百拇医药
3，Schmid J, Busch U, Heinzel G, et al. Meloxicam. Pha-rmacokinetics and metabolic pattern after intravenous infusion and oral administration to healthy subjects. Drug Metab Dispos, 1995,23:1206～1213
4，钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志,1996,16: 306～312
5，Shah VP, Midha KK, Dighe S, et al. Analytical methods validation:bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies. J Pharm Sci, 1992,81:309～312
6，徐海燕,钟大放,肇丽梅，等.美洛昔康在中国健康受试者体内的药物动力学研究.药学学报.待发表
收稿日期:2000-03-31
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