伯氏疟原虫小亚单位Rrna在斯氏按蚊体内的转录类型和动态
刘延刚 宋关鸿 徐建农
摘 要 目的：观察伯氏疟原虫(P.berghei)小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)在斯氏按蚊体内的转录类型和动态。方法：应用RT-PCR方法，特异地扩增伯氏疟原虫A型和S型SSUrRNA，检测斯氏按蚊虫体内S型SSUrRNA的转录水平。结果：吸感染血的斯氏按蚊体内仅见S型SSUrRNA的条带。整体检测从第2天开始查见，第8天明显增强，第12～16天达到高峰。在蚊腹部S型SSUrRNA转录动态与整体检测结果相似。胸部于第12天查见该基因的转录。结论：斯氏按蚊体内伯氏疟原虫仅转录S型SSUrRNA，它的转录动态与疟原虫在蚊体内的发育密切相关。
关键词：按蚊，斯氏 疟原虫，伯氏 RNA，核糖体
伯氏疟原虫在生活史中转录两种期特异性小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)，分别为A型和S型[1]，这两型SSUrRNA的编码基因分别位于疟原虫第5，6，7和12染色体上，共有4个拷贝数[2]，这是生物界中很少见的特殊方式。到目前为止，人们已经发现在疟原虫生活史中存在3种期特异性转录的SSUrRNA，分别是A型，S型(早期称为C型)和O型[3]。A型SSUrRNA主要在红内期和红外期疟原虫中转录[1,4,5]，S型主要在子孢子中转录[1]，O型则于合子形成至卵囊成熟阶段的疟原虫中转录。其中O型SSUrRNA已在间日疟原虫和鸟疟原虫中得到证实[3]。这种期特异性转录的SSUrRNA与疟原虫不同生长阶段的发生发育密切相关。为此，我们应用RT-PCR扩增斯氏按蚊体内伯氏疟原虫孢子生殖阶段的S型SSUrRNA，研究其在蚊体内的转录水平及动态，探讨S型SSUrRNA与疟原虫在蚊体内发育的相互关系。
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1 材料和方法
1.1 材料 伯氏疟原虫由美国WalterReed陆军研究所昆虫学系馈赠;斯氏按蚊(Hor株)由中国预防医学科学院寄生虫病研究所引进,本教研室昆虫饲养室饲养繁殖，条件：温度(26±1)℃，相对湿度[RH，(80±5)%]，光照12h。
1.2 试剂 组织总RNA抽提试剂盒(里面包含W3液)、RNase-freeDNaseⅠ由上海华顺生物制品公司提供;Super-ScriptⅡ逆转录试剂盒由Gibco公司提供;Taq聚合酶(2U/μl)由加拿大ACGT公司提供。引物:逆转录引物Rp(5′-TTCTTGCTTGCG-CGAATACTCG-3′)；A型和S型SSUrRNA5′端共用引物Pu(5′-AGTGTGTATCAATCGAGT-TTCTGA-3′)；S型3端引物Ps(5′-CAACAAGGATAAAAGCAGTGACAG-3′)；A型3′端引物Pa(5′-AAGAAATCCCCGAAGGGAAATCTT-3′)，由上海生工公司合成。
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1.3 伯氏疟原虫感染斯氏按蚊 取5d龄斯氏按蚊成蚊,饥饿12h,于21℃叮咬原虫血症为5%的感染伯氏疟原虫BALB/c小鼠30min，取出饱血按蚊，于21℃，RH80%饲养。分别于饱血后第1，2h和第1，2，4，6，8，10，12，14，16，18天套取蚊虫各30只，置冷冻管于-80℃低温冰箱保存备用。
1.4 总RNA的抽提 参照组织总RNA抽提试剂盒说明书方法，分别抽提吸感染疟原虫鼠血后不同时间的斯氏按蚊整体、胸、腹部及感染疟原虫鼠血的总RNA。
1.5 总RNA中污染的基因组DNA的消除 取总RNA10μl，加RNase-freeDNaseⅠ1μl，25℃消化15min，65℃灭活DNase15min，冰浴1min，-80℃保存备用。
1.6 核糖体RNA的逆转录 参照Super-ScriptⅡ试剂盒说明书操作。
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1.7 cDNA的PCR扩增 反应体系各加入cDNA模板、分别加入S型3′端引物和5′端引物或A型3′端引物和5′端引物各1μl，反应条件94℃变性1.5min，然后94℃30s，55℃30s，70℃1min，35个循环。最后，70℃延伸7min。PCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳，置紫外灯下观察。
2 结 果
2.1 不同宿主体内SSUrRNA的转录类型 从感染鼠血扩增出S型和A型SSUrRNA两条带，其中A型条带很强而S型条带较弱。吸感染疟原虫鼠血的蚊虫仅扩增出S型SSUrRNA条带(图1)。
图1 感染伯氏疟原虫的鼠血和蚊虫总
RNA的RT-PCR电泳结果
Fig 1 Electrophoresis of total RNA of
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P. berghei from infected mice blood and
mosquitoes amplified with RT-PCR
1: Size marker; 2，3: S- and A-type SSUrRNA from the infected mice blood;
4,5: A- and S-type SSUrRNA from the infected mosquitoes
2.2 蚊体内S型SSUrRNA的转录动态
2.2.1 蚊整体检测S型SSUrRNA的转录动态 蚊虫吸感染疟原虫鼠血后，在第1,2h和第1天未见扩增条带，第2天开始出现S型条带，第2～6天条带较弱，第8天的条带明显增强,第12～16天条带强度达到高峰，第18天该条带明显减弱(图2)。上述时间内未见A型SSUrRNA的扩增条带。
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图2 疟原虫S 型SSUrRNA在蚊体内不同时间的转录动态
Fig 2 Transcription dynamics of the S-type
SSUrRNA of P. berghei in the infected mosquitoes
at different post engorgement times
1: Size marker; 2，3: Post-engorgement 1 and 2 h;
4～13: Post-engorgement 1,2, 4,6,8,10,12,14,16,18 d，respectively
2.2.2 蚊腹部S型SSUrRNA的转录动态 切除蚊胸部及头部后,抽提总RNA并RT-PCR扩增S型SSUrRNA。不同时期蚊腹部S型SSUrRNA的转录动态与蚊整体的结果相似,第2天可以检测到S型条带,第8天明显增强,第14天强度最大。
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2.2.3 蚊胸部S型SSUrRNA的转录动态 除去蚊虫头部和腹部,抽提总RNA并RT-PCR扩增S型SSUrRNA,从第12天起查见S型SSUrRNA扩增带,以后逐步增强,在第16天时最强(图3)。
图3 蚊胸部疟原虫S型SSUrRNA的转录动态
Fig 3 Transcription dynamics of the S-type
SSUrRNA of P. berghei in the infected mosquito
chests at different post-engorgement times
1: Size marker; 2～8: 6, 8, 10, 12,14, 16 and 18 d after engorgement，respectively
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2.3 S型SSUrRNA的序列测定 取吸感染疟原虫鼠血第4天蚊虫标本,抽提总RNA,RT-PCR扩增、纯化后,PCR测序,结果与文献报道的伯氏疟原虫S型SSUrRNA序列完全一致。
3 讨 论
我们用RT-PCR方法观察了伯氏疟原虫SSUrRNA在斯氏按蚊体内孢子生殖阶段的转录类型和动态变化，结果发现蚊体内疟原虫仅转录S型SSUrRNA，未见A型SSUrRNA的转录，和Gunderson等[1]观察的结果一致。Waters等[6]报道蚊体内疟原虫始终有微量的A型SSUrRNA转录，而本实验用RT-PCR方法未能发现。
伯氏疟原虫进入蚊体后48h内到达胃壁形成卵囊，开始孢子增殖，疟原虫的S型SSUrRNA开始少量转录。以后随着卵囊发育，S型SSUrRNA转录量逐渐增多。第8～14天卵囊内子孢子逐渐成熟并形成大量的子孢子，疟原虫需要大量的核糖体，因此S型SSUrRNA的转录量迅速增加。到感染后第16天卵囊内子孢子发育成熟从破溃的卵囊壁逸出，进入按蚊血淋巴腔。此时，S型SSUrRNA转录逐渐减少。第18天测得的S型SSUrRNA片段强度明显减弱。上述结果提示疟原虫S型SSUrRNA转录水平的变化，不仅反映了疟原虫数量的变化，而且与疟原虫在蚊体内生长发育状态的改变相吻合。我们用RT-PCR方法得到的伯氏疟原虫S型SSUrRNA转录起始时间与Waters等[6]用伯氏疟原虫ETS区特异探针观察到的SSUrRNA前体的转录时间一致。但本实验发现在血餐后18d的蚊虫体内仍可以检测到S型SSUrRNA的转录，与Waters等[6]报道在第14天以后它就逐渐消失有所不同。他们同时还报道在蚊虫吸血后12h即可检测到低水平的S型SSUrRNA前体，在本实验中未得到验证。
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我们将蚊虫胸部和腹部总RNA分别进行RT-PCR扩增，发现第12天解剖按蚊尚看不到子孢子进腺时，蚊胸部S型SSUrRNA已检测阳性，说明此时已有成熟子孢子随血淋巴移行到胸部。第16天蚊虫腹部卵囊内的绝大多数子孢子逸出，并侵入位于胸部的唾液腺。此时腹部的S型SSUrRNA转录明显下降，胸部达到高峰。
Li等[3]发现间日疟原虫(P.vivax)在按蚊血餐后第6天以前转录另一类O型SSUrRNA，并认为它主要在合子、动合子和早期卵囊中表达。伯氏疟原虫基因组rDNA共有4个编码单位，A和B单位已确定同为A基因，但是C和D单位的序列是否一致，目前尚不清楚，故暂定为S基因[1]。Waters等[6]怀疑伯氏疟原虫rDNAC和D单位中可能有一个是O基因。由于蚊体内伯氏疟原虫从第2～6天SSUrRNA的转录水平较第8天以后明显低，而且此期恰好对应于间日疟原虫O基因的转录时间[3]。我们检测按蚊血餐后第4天伯氏疟原虫早期卵囊发育阶段转录的SSUrRNA序列，与文献报道的S型SSUrRNA的序列一致[1]。推测伯氏疟原虫生活史中很可能没有O型SSUrRNA的转录。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号39580020
作者简介：刘延刚，男，1967年11月生，硕士生
作者单位 刘延刚 宋关鸿 徐建农 第二军医大学基础医学部寄生虫学教研室，上海，200433
参考文献
1 Gunderson JH,Sogin ML,Wollett G，et al. Structurally distinct,stage-specific ribosomes occur in Plasmodium. Science, 1987, 238(4829):933
2 Dame JB,McCutchan TF. The four ribosomal DNA units of the malaria parasite Plasmodium berghei: identification, restriction map and copy number analysis. J Biol Chem, 1983, 258(11):6984
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3 Li J,Gutell RR,Dameberg SH, et al. Regulation and trafficking of three distinct 18S ribosomal RNAs during development of the malaria parasite. J Mol Biol , 1997, 269(2):203
4 McCutchan TF, de La Cruz VF,Lal AA,et al. Primary sequences of two small subunit ribosomal RNA genes from Plasmodium falciparum. Mol Biol Parasitol, 1988, 28(1):63
5 Arreaza G, Corredor V, Zavala F. Plasmodium yoelii: quantification of the exoerythrocytic stages based on the use of ribosomal RNA probes.Exp Parasitol, 1991, 72(1):103
6 Waters AP, van Speaendonk PM, Ramesar J, et al. Species-specific reg ulat ion and switching of transcription between RNA genes in Plasmodium berghei. J Biol Chem, 1997, 272(6):3583, 百拇医药
摘 要 目的：观察伯氏疟原虫(P.berghei)小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)在斯氏按蚊体内的转录类型和动态。方法：应用RT-PCR方法，特异地扩增伯氏疟原虫A型和S型SSUrRNA，检测斯氏按蚊虫体内S型SSUrRNA的转录水平。结果：吸感染血的斯氏按蚊体内仅见S型SSUrRNA的条带。整体检测从第2天开始查见，第8天明显增强，第12～16天达到高峰。在蚊腹部S型SSUrRNA转录动态与整体检测结果相似。胸部于第12天查见该基因的转录。结论：斯氏按蚊体内伯氏疟原虫仅转录S型SSUrRNA，它的转录动态与疟原虫在蚊体内的发育密切相关。
关键词：按蚊，斯氏 疟原虫，伯氏 RNA，核糖体
伯氏疟原虫在生活史中转录两种期特异性小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)，分别为A型和S型[1]，这两型SSUrRNA的编码基因分别位于疟原虫第5，6，7和12染色体上，共有4个拷贝数[2]，这是生物界中很少见的特殊方式。到目前为止，人们已经发现在疟原虫生活史中存在3种期特异性转录的SSUrRNA，分别是A型，S型(早期称为C型)和O型[3]。A型SSUrRNA主要在红内期和红外期疟原虫中转录[1,4,5]，S型主要在子孢子中转录[1]，O型则于合子形成至卵囊成熟阶段的疟原虫中转录。其中O型SSUrRNA已在间日疟原虫和鸟疟原虫中得到证实[3]。这种期特异性转录的SSUrRNA与疟原虫不同生长阶段的发生发育密切相关。为此，我们应用RT-PCR扩增斯氏按蚊体内伯氏疟原虫孢子生殖阶段的S型SSUrRNA，研究其在蚊体内的转录水平及动态，探讨S型SSUrRNA与疟原虫在蚊体内发育的相互关系。
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1 材料和方法
1.1 材料 伯氏疟原虫由美国WalterReed陆军研究所昆虫学系馈赠;斯氏按蚊(Hor株)由中国预防医学科学院寄生虫病研究所引进,本教研室昆虫饲养室饲养繁殖，条件：温度(26±1)℃，相对湿度[RH，(80±5)%]，光照12h。
1.2 试剂 组织总RNA抽提试剂盒(里面包含W3液)、RNase-freeDNaseⅠ由上海华顺生物制品公司提供;Super-ScriptⅡ逆转录试剂盒由Gibco公司提供;Taq聚合酶(2U/μl)由加拿大ACGT公司提供。引物:逆转录引物Rp(5′-TTCTTGCTTGCG-CGAATACTCG-3′)；A型和S型SSUrRNA5′端共用引物Pu(5′-AGTGTGTATCAATCGAGT-TTCTGA-3′)；S型3端引物Ps(5′-CAACAAGGATAAAAGCAGTGACAG-3′)；A型3′端引物Pa(5′-AAGAAATCCCCGAAGGGAAATCTT-3′)，由上海生工公司合成。
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1.3 伯氏疟原虫感染斯氏按蚊 取5d龄斯氏按蚊成蚊,饥饿12h,于21℃叮咬原虫血症为5%的感染伯氏疟原虫BALB/c小鼠30min，取出饱血按蚊，于21℃，RH80%饲养。分别于饱血后第1，2h和第1，2，4，6，8，10，12，14，16，18天套取蚊虫各30只，置冷冻管于-80℃低温冰箱保存备用。
1.4 总RNA的抽提 参照组织总RNA抽提试剂盒说明书方法，分别抽提吸感染疟原虫鼠血后不同时间的斯氏按蚊整体、胸、腹部及感染疟原虫鼠血的总RNA。
1.5 总RNA中污染的基因组DNA的消除 取总RNA10μl，加RNase-freeDNaseⅠ1μl，25℃消化15min，65℃灭活DNase15min，冰浴1min，-80℃保存备用。
1.6 核糖体RNA的逆转录 参照Super-ScriptⅡ试剂盒说明书操作。
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1.7 cDNA的PCR扩增 反应体系各加入cDNA模板、分别加入S型3′端引物和5′端引物或A型3′端引物和5′端引物各1μl，反应条件94℃变性1.5min，然后94℃30s，55℃30s，70℃1min，35个循环。最后，70℃延伸7min。PCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳，置紫外灯下观察。
2 结 果
2.1 不同宿主体内SSUrRNA的转录类型 从感染鼠血扩增出S型和A型SSUrRNA两条带，其中A型条带很强而S型条带较弱。吸感染疟原虫鼠血的蚊虫仅扩增出S型SSUrRNA条带(图1)。
图1 感染伯氏疟原虫的鼠血和蚊虫总
RNA的RT-PCR电泳结果
Fig 1 Electrophoresis of total RNA of
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P. berghei from infected mice blood and
mosquitoes amplified with RT-PCR
1: Size marker; 2，3: S- and A-type SSUrRNA from the infected mice blood;
4,5: A- and S-type SSUrRNA from the infected mosquitoes
2.2 蚊体内S型SSUrRNA的转录动态
2.2.1 蚊整体检测S型SSUrRNA的转录动态 蚊虫吸感染疟原虫鼠血后，在第1,2h和第1天未见扩增条带，第2天开始出现S型条带，第2～6天条带较弱，第8天的条带明显增强,第12～16天条带强度达到高峰，第18天该条带明显减弱(图2)。上述时间内未见A型SSUrRNA的扩增条带。
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图2 疟原虫S 型SSUrRNA在蚊体内不同时间的转录动态
Fig 2 Transcription dynamics of the S-type
SSUrRNA of P. berghei in the infected mosquitoes
at different post engorgement times
1: Size marker; 2，3: Post-engorgement 1 and 2 h;
4～13: Post-engorgement 1,2, 4,6,8,10,12,14,16,18 d，respectively
2.2.2 蚊腹部S型SSUrRNA的转录动态 切除蚊胸部及头部后,抽提总RNA并RT-PCR扩增S型SSUrRNA。不同时期蚊腹部S型SSUrRNA的转录动态与蚊整体的结果相似,第2天可以检测到S型条带,第8天明显增强,第14天强度最大。
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2.2.3 蚊胸部S型SSUrRNA的转录动态 除去蚊虫头部和腹部,抽提总RNA并RT-PCR扩增S型SSUrRNA,从第12天起查见S型SSUrRNA扩增带,以后逐步增强,在第16天时最强(图3)。
图3 蚊胸部疟原虫S型SSUrRNA的转录动态
Fig 3 Transcription dynamics of the S-type
SSUrRNA of P. berghei in the infected mosquito
chests at different post-engorgement times
1: Size marker; 2～8: 6, 8, 10, 12,14, 16 and 18 d after engorgement，respectively
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2.3 S型SSUrRNA的序列测定 取吸感染疟原虫鼠血第4天蚊虫标本,抽提总RNA,RT-PCR扩增、纯化后,PCR测序,结果与文献报道的伯氏疟原虫S型SSUrRNA序列完全一致。
3 讨 论
我们用RT-PCR方法观察了伯氏疟原虫SSUrRNA在斯氏按蚊体内孢子生殖阶段的转录类型和动态变化，结果发现蚊体内疟原虫仅转录S型SSUrRNA，未见A型SSUrRNA的转录，和Gunderson等[1]观察的结果一致。Waters等[6]报道蚊体内疟原虫始终有微量的A型SSUrRNA转录，而本实验用RT-PCR方法未能发现。
伯氏疟原虫进入蚊体后48h内到达胃壁形成卵囊，开始孢子增殖，疟原虫的S型SSUrRNA开始少量转录。以后随着卵囊发育，S型SSUrRNA转录量逐渐增多。第8～14天卵囊内子孢子逐渐成熟并形成大量的子孢子，疟原虫需要大量的核糖体，因此S型SSUrRNA的转录量迅速增加。到感染后第16天卵囊内子孢子发育成熟从破溃的卵囊壁逸出，进入按蚊血淋巴腔。此时，S型SSUrRNA转录逐渐减少。第18天测得的S型SSUrRNA片段强度明显减弱。上述结果提示疟原虫S型SSUrRNA转录水平的变化，不仅反映了疟原虫数量的变化，而且与疟原虫在蚊体内生长发育状态的改变相吻合。我们用RT-PCR方法得到的伯氏疟原虫S型SSUrRNA转录起始时间与Waters等[6]用伯氏疟原虫ETS区特异探针观察到的SSUrRNA前体的转录时间一致。但本实验发现在血餐后18d的蚊虫体内仍可以检测到S型SSUrRNA的转录，与Waters等[6]报道在第14天以后它就逐渐消失有所不同。他们同时还报道在蚊虫吸血后12h即可检测到低水平的S型SSUrRNA前体，在本实验中未得到验证。
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我们将蚊虫胸部和腹部总RNA分别进行RT-PCR扩增，发现第12天解剖按蚊尚看不到子孢子进腺时，蚊胸部S型SSUrRNA已检测阳性，说明此时已有成熟子孢子随血淋巴移行到胸部。第16天蚊虫腹部卵囊内的绝大多数子孢子逸出，并侵入位于胸部的唾液腺。此时腹部的S型SSUrRNA转录明显下降，胸部达到高峰。
Li等[3]发现间日疟原虫(P.vivax)在按蚊血餐后第6天以前转录另一类O型SSUrRNA，并认为它主要在合子、动合子和早期卵囊中表达。伯氏疟原虫基因组rDNA共有4个编码单位，A和B单位已确定同为A基因，但是C和D单位的序列是否一致，目前尚不清楚，故暂定为S基因[1]。Waters等[6]怀疑伯氏疟原虫rDNAC和D单位中可能有一个是O基因。由于蚊体内伯氏疟原虫从第2～6天SSUrRNA的转录水平较第8天以后明显低，而且此期恰好对应于间日疟原虫O基因的转录时间[3]。我们检测按蚊血餐后第4天伯氏疟原虫早期卵囊发育阶段转录的SSUrRNA序列，与文献报道的S型SSUrRNA的序列一致[1]。推测伯氏疟原虫生活史中很可能没有O型SSUrRNA的转录。
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作者简介：刘延刚，男，1967年11月生，硕士生
作者单位 刘延刚 宋关鸿 徐建农 第二军医大学基础医学部寄生虫学教研室，上海，200433
参考文献
1 Gunderson JH,Sogin ML,Wollett G，et al. Structurally distinct,stage-specific ribosomes occur in Plasmodium. Science, 1987, 238(4829):933
2 Dame JB,McCutchan TF. The four ribosomal DNA units of the malaria parasite Plasmodium berghei: identification, restriction map and copy number analysis. J Biol Chem, 1983, 258(11):6984
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3 Li J,Gutell RR,Dameberg SH, et al. Regulation and trafficking of three distinct 18S ribosomal RNAs during development of the malaria parasite. J Mol Biol , 1997, 269(2):203
4 McCutchan TF, de La Cruz VF,Lal AA,et al. Primary sequences of two small subunit ribosomal RNA genes from Plasmodium falciparum. Mol Biol Parasitol, 1988, 28(1):63
5 Arreaza G, Corredor V, Zavala F. Plasmodium yoelii: quantification of the exoerythrocytic stages based on the use of ribosomal RNA probes.Exp Parasitol, 1991, 72(1):103
6 Waters AP, van Speaendonk PM, Ramesar J, et al. Species-specific reg ulat ion and switching of transcription between RNA genes in Plasmodium berghei. J Biol Chem, 1997, 272(6):3583, 百拇医药