用高效液相色谱-紫外检测法测定赖氨酸注射液中赖氨酸含量
作者：凌笑梅 刘养清 杜鸣 徐秉玖
单位：凌笑梅(北京医科大学药学院,北京 100083)；刘养清(山西师范大学化学系,临汾 041004)；杜鸣 徐秉玖(北京医科大学药学院,北京 100083)
关键词：赖氨酸；邻苯二醛衍生化；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报000514 摘 要 研究了采用高效液相色谱-紫外检测法对盐酸赖氨酸注射液中赖氨酸含量的测定.作者在AminoQuant方法的基础上，改为仅采用邻苯二醛(OPA)衍生化，省略了原方法衍生化试剂中的不稳定成分，而采用优化的反应条件提高紫外测定的灵敏度；又对这个组成较简单的样品改用恒定组成的流动相淋洗,手动方法测定避免了对该试样不必要的梯度淋洗，较原AminoQuant氨基酸分析法简便、快速，结果峰面积与浓度相关系数\{r=0.999 8\}，回收率为99.7%(RSD为1.0%～1.5%).在采用紫外检测法时，最小检出量为5.3×10-8(S/N=3)与原方法相近.
, 百拇医药
分类号 R914
Determination of Lysine Content in a Lysine Hydrochloride Injection by HPLC-UV
Ling Xiaomei， Liu Yangqing， Du Ming， Xu Bingjiu
(School of Pharmaceutical Science, Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract Determination of lysine content in a lysine hydrochloride injection by the HPLC-UV method was studied. The authors proposed to derivatize lysine with o-phthalaldehyde(OPA)only, leaving out the unstable component(2-mercaptoethanol or 3-mercaptopropionic acid)in derivatizing reagent used in AminoQuant method for amino acid measurement. By optimizing reaction conditions, the sensitivity of lysine measurement can be increased significantly. Considering the simple composition of the sample, the authors proposed to analyze the derivatized sample with isocratic elution, simpler, manually operated instruments could thus be used for the measurement, thereby avoiding using gradient elution while unnecessary. The modified method was simpler and more rapid than the AminoQuant technique, whereas exact and precise results were obtained(linear correlation coefficient between peak area and concentration was 0.999 8, recovery 99.7%, within-day and between-day RSD was 1.0%～1.5%).If the UV detection was used, the sensitivity of the proposed method was found to be comparable with that by the AminoQuant method.
, 百拇医药
Key words lysine;OPA derivatization;HPLC
AminoQuant氨基酸分析法是目前广泛应用的氨基酸分析法〔1～4〕.这种方法着眼于多种氨基酸的全分析，因此采用梯度淋洗，在衍生化时，除了邻苯二醛(OPA)外，还加入了巯基乙醇或巯基丙酸.据文献称，这种方法具有快速、准确、灵敏和重现性好等特点.但在使用中也存在不适于手动或其他机械方法操作〔1〕，衍生化试剂中巯基乙醇或巯基丙酸易变质以及由于样品中存在大量硼酸钠缓冲剂，只能用梯度淋洗法分析等问题.作者在AminoQuant氨基酸分析法的基础上，针对注射液组成较简单的具体情况，研究了采用高效液相色谱-紫外检测法测定赖氨酸注射液中赖氨酸含量.
1 仪器、试剂与药品
仪器：Spectro Physics Iso—Chrom泵、SP 8450紫外可见检测器;色谱柱：Waters Bondapak C18柱，4.6 mm×20 cm；流动相：甲醇-水、0.1%TEA(体积比50∶50);流速：1 mL/min，检测波长：326 nm，色谱数据处理采用东西电子公司的A4800工作站.
, 百拇医药
药品：L-赖氨酸盐酸盐(Lys.HCL)：生化试剂，上海康达氨基酸厂出品，邻苯二醛(OPA)：化学纯，上海亚太精细化工公司出品，测定氨基酸衍生化试剂(OPA+巯基丙酸)惠普公司提供.
0.15% OPA溶液的配制：取适量的OPA溶于少量甲醇中，用水稀释至所需浓度.
外标溶液的配制：取100 mL量瓶6个，分别准确称取盐酸赖氨酸标准品20、40、60、80、100、120 mg，用少量水溶解，以70%(体积比)乙醇(事先用三乙胺调节pH至10.7)稀释至刻度，得盐酸赖氨酸200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL标准液.
样品的配制：量取赖氨酸盐酸盐注射液适量(应使所得测定液的浓度在400～500 μg/mL范围内)，用与上述相同的70%乙醇稀释至刻度，混匀.
2 方法与结果
, 百拇医药
2.1 注射液中赖氨酸浓度的测定
量取0.15%OPA溶液2 mL置于具塞玻璃反应管内，加0.5 mL按上述方法配制的测定液，密塞后混匀管内液体，将反应管置于沸水浴中加热1 min，取出后立即冷却至室温，进样10 μL至液相色谱仪中，在326 nm下检测.
2.2 不同衍生化条件下生成物吸光系数的比较
分别量取1 000 μg/mL赖氨酸标准溶液0.05 mL、足够过量的0.15% OPA溶液(0.2 mL)于具塞玻璃反应管内，混匀，将胶塞塞紧后在沸水浴上加热1 min，冷却，稀释50倍，以同样倍数稀释的衍生化试剂为对照，得紫外光谱(图1a).再分别取同上浓度和体积的赖氨酸标准溶液与惠普公司提供的OPA-巯基丙酸衍生化试剂0.2 mL，在AminoQuant氨基酸分析法推荐的条件下(40℃加热5 s)反应后冷却，同样稀释50倍，以同样倍数稀释的衍生化试剂为对照，得紫外光谱(图1b).由图可见，在320～330 nm范围内，两种衍生化方法所得产物吸光度值相当接近.
, 百拇医药
如上所述,将1 000 μg/mL赖氨酸标准溶液与0.15% OPA溶液在具塞的玻璃反应管内混匀，置于不同温度的恒温水浴中保持不同时间，取反应管内液体分别向液相色谱仪中进样10 μL，分别求得赖氨酸衍生化反应产物的峰面积(图2).由图2可见，在相同温度下，赖氨酸与OPA衍生化反应吸光度值总是开始随时间增加而增加，当达到极大值后又逐渐减少；高温下达到吸光度极大值的时间短，所达到的极大值也较大.
Fig.1 UV spectrograms of lysine derivates
a—Derivatizing with OPA only;
b—With AminoQuant reagent
Fig.2 HPLC peak area of lysine-OPA derivate obtained at different reaction temperatures as functions of derivatizing times
, 百拇医药
1—100℃；2—80℃；3—60℃；4—40℃；5—25℃
2.3 赖氨酸注射液中赖氨酸含量的测定结果
按注射液中赖氨酸浓度测定方法测得7批次样品中盐酸赖氨酸百分含量分别为32.4(1.2%)、32.2(2.1%)、32.0(0.9%)、32.6(1.1%)、32.5(0.6%)、33.1(1.5%)和30.8(1.1%)，括号中为每个样品4次测定结果的相对标准偏差.
2.4 线性关系考察
按上述方法分别测得200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL(重量与体积比)标准溶液中赖氨酸峰面积，求得峰面积-浓度关系，得回归方程：y=-118 544+3 817.5x，r=0.999 8，其中x为浓度(μg/mL)，y为峰面积.
, 百拇医药 2.5 精密度试验
取1 000 μg/mL赖氨酸盐酸盐标准溶液按“2.1”项下方法连续进样6次，所得峰面积值为3 716 086、3 780 451、3 748 446、3 741 196、3 690 563、3 652 782,这些值的平均值为3 721 588,RSD为1.2%.
2.6 回收率试验
配制足量的约400 μg/mL盐酸赖氨酸样品溶液，多次测定其浓度，求得平均值为458.9 μg/mL.分别在5个25 mL容量瓶中加入约25 mg盐酸赖氨酸标准品并准确称量，用上述盐酸赖氨酸样品溶液溶解、混匀，用前述样品测定方法，测得标准品加入后的样品溶液中盐酸赖氨酸的含量，求出加入标准品前后盐酸赖氨酸含量的增量，与加入的盐酸赖氨酸量相比，计算回收率,结果见表1.
Tab.1 The recovery test No.
, 百拇医药
Lys.HCl added/μg.mL-1
Lys.HCl found/μg.mL-1
Lys.HCl recovery/%
Mean/%
RSD/%
1
1 036
1 042
100.6
2
, 百拇医药
1 048
1 026
97.9
3
1 004
1 007
100.3
99.7
2.4
4
1 072
1 103
102.9
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5
1 048
1 050
96.9
3 讨论
AminoQuant方法通过衍生化极大地提高了测定氨基酸的灵敏度，其准确度与精密度也好，但其衍生化反应是在pH=10.4硼酸钠缓冲体系下进行的，如果采用溶剂强度较大的流动相淋洗，样品进入液相色谱仪中会导致硼酸钠析出，使色谱柱堵塞，因此只能从较低的溶剂强度开始作梯度淋洗.但在所分析样品比较简单的情况下，如果采用固定组成流动相淋洗，可以选择合适的溶剂强度，使欲分析组分出峰时间减至最短；比较采用梯度淋洗，至少省下了使溶剂强度恢复到初始状态并使柱达到平衡状态的时间.在一个典型的AminoQuant分析程序中，完成一个全分析费时25 min〔1〕，赖氨酸衍生物的流出时间为14 min；而在本实验条件下，一次赖氨酸分析费时6 min.
, 百拇医药
AminoQuant方法另一个问题是衍生化试剂中的巯基丙酸不易保存、价格较贵.在安瓿中封存的衍生化试剂能保存3个月，打开后只能维持几天内有效.建议仅用衍生化试剂OPA与赖氨酸反应，选择合适反应条件，用紫外检测器检测时，也能达到AminoQuant氨基酸分析法相应的灵敏度.由图2可见，选择OPA与赖氨酸在沸水浴中反应1 min后测定生成的赖氨酸衍生物，可以达到较高的灵敏度，反应条件也好控制.
在本实验中配制样品溶液和外标溶液时，都是取适量的样品和标准品，用少量水溶解，以70%(体积比)乙醇(事先用三乙胺调节pH至10.7)在容量瓶中稀释至刻度。盐酸赖氨酸标准液的浓度为200～1 200 μg/mL(重量与体积比).采用70%乙醇溶解样品，可以防止在环境温度较高时，赖氨酸受细菌作用变质，导致其浓度发生变化.
在上述色谱条件下，将标准的和欲测浓度的赖氨酸盐酸盐溶液经衍生化后进样分析,赖氨酸衍生物的色谱峰的保留时间约为6.2 min.除注射OPA溶液时也出现的一些小峰外，未见其他峰.所得色谱图见图3.对赖氨酸衍生物峰测得的柱效约为10 000/m.
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在本实验中发现，OPA与氨基酸反应产生的紫外吸收或荧光物质的归属仍然存在一些疑问.最早提出用OPA作氨基酸的衍生化试剂的Roth〔2〕指出，如果在衍生化时先在氨基酸中加入OPA，最后加入巯基乙醇，产生的荧光强度比在OPA和巯基乙醇的混合溶液中加入氨基酸溶液减少许多，他认为这提示在巯基乙醇不存在时，OPA会与氨基酸生成非荧光的产物.这种产物(很可能是Schiff碱)不能进一步与巯基化合物生成荧光化合物.Roth还指出，已经生成的衍生物置于pH6.0～11.5条件下时，其荧光强度不变；赖氨酸在衍生化时最佳的条件是pH6.0～7.0.作者发现，只有存在硼酸钠缓冲剂时，OPA、巯基乙醇才能与赖氨酸生成在338 nm波长处有较强吸收的产物；并且当上述产物与加有0.1% TEA的流动相等量混合时，这种吸收消失，提示可能发生了某种反应，反应产物与原产物的紫外图谱不同，见图4.说明AmionQuant方法衍生化的产物是复杂的，在一些条件下能产生有紫外吸收的产物，即使已经产生，在pH等条件发生变化的情况下也会分解；而在衍生化产生紫外吸收物质的同时又会产生不相同的荧光化合物，这个(或这些)荧光化合物在pH7.5～12范围内相当稳定.
, 百拇医药
Fig.3 HPLC Chromatograms of lysine hydrochloride injection samples after derivatization.
Fig.4 Change of UV spectrograms of lysine-AminoQuant reagent derivate in media with different pH
a—In normal basic media；b—In media with lower pH
从图2可以看出，赖氨酸与OPA产生紫外吸收物质的反应比较缓慢并且产物不稳定，在各个温度下反应产物的时间-吸光度曲线都是先上升，到达一个峰值后再下降.在较低温度下，经过较长时间可以达到一个吸光度相对稳定的阶段，但最后吸收值还会下降.在高温下这种趋势可以看得很清楚，在较短的时间内吸光度已经达到了峰值，并且可能是由于吸光物质的分解速度并不随着成比例地增加，高温下达到的峰值也较大.这样从衍生化反应的耗时和测定的灵敏度两个角度考虑，都应在高温下进行衍生化反应.实验结果证明，如果严格地把衍生化反应的时间控制在1 min，可以得到非常准确和精密的测定结果.
, 百拇医药
参考文献
1，Godel H,Seitz P,Verhoef M. OPA-FMOC联用全自动柱前衍生氨基酸分析——AminoQuant氨基酸分析法. 氨基酸应用专集,1995,(5):1～7
2，Roth M.Fluorescence reaction for amino acids. Anal Chem,1971,43:880
3，Georgi G, Pietsch C, Sawatzki G. High performance liquid chromatographic determination of amino acids in protein hydrosates and in plasma using automated pre-column derivatization with o-phthaldialdehyde and 2-mercaptoethanol. J Chromatogr, 1993,613:35
4，Dorresteijn RC, Berwald LG, Zomer G. Determination of amino acids using o-phthalaldehyde-2-mercaptoethanol derivatization, Effects of reaction conditions.J Chromatogr, 1996,724:159
收稿日期:2000-03-20, http://www.100md.com
单位：凌笑梅(北京医科大学药学院,北京 100083)；刘养清(山西师范大学化学系,临汾 041004)；杜鸣 徐秉玖(北京医科大学药学院,北京 100083)
关键词：赖氨酸；邻苯二醛衍生化；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报000514 摘 要 研究了采用高效液相色谱-紫外检测法对盐酸赖氨酸注射液中赖氨酸含量的测定.作者在AminoQuant方法的基础上，改为仅采用邻苯二醛(OPA)衍生化，省略了原方法衍生化试剂中的不稳定成分，而采用优化的反应条件提高紫外测定的灵敏度；又对这个组成较简单的样品改用恒定组成的流动相淋洗,手动方法测定避免了对该试样不必要的梯度淋洗，较原AminoQuant氨基酸分析法简便、快速，结果峰面积与浓度相关系数\{r=0.999 8\}，回收率为99.7%(RSD为1.0%～1.5%).在采用紫外检测法时，最小检出量为5.3×10-8(S/N=3)与原方法相近.
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分类号 R914
Determination of Lysine Content in a Lysine Hydrochloride Injection by HPLC-UV
Ling Xiaomei， Liu Yangqing， Du Ming， Xu Bingjiu
(School of Pharmaceutical Science, Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract Determination of lysine content in a lysine hydrochloride injection by the HPLC-UV method was studied. The authors proposed to derivatize lysine with o-phthalaldehyde(OPA)only, leaving out the unstable component(2-mercaptoethanol or 3-mercaptopropionic acid)in derivatizing reagent used in AminoQuant method for amino acid measurement. By optimizing reaction conditions, the sensitivity of lysine measurement can be increased significantly. Considering the simple composition of the sample, the authors proposed to analyze the derivatized sample with isocratic elution, simpler, manually operated instruments could thus be used for the measurement, thereby avoiding using gradient elution while unnecessary. The modified method was simpler and more rapid than the AminoQuant technique, whereas exact and precise results were obtained(linear correlation coefficient between peak area and concentration was 0.999 8, recovery 99.7%, within-day and between-day RSD was 1.0%～1.5%).If the UV detection was used, the sensitivity of the proposed method was found to be comparable with that by the AminoQuant method.
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Key words lysine;OPA derivatization;HPLC
AminoQuant氨基酸分析法是目前广泛应用的氨基酸分析法〔1～4〕.这种方法着眼于多种氨基酸的全分析，因此采用梯度淋洗，在衍生化时，除了邻苯二醛(OPA)外，还加入了巯基乙醇或巯基丙酸.据文献称，这种方法具有快速、准确、灵敏和重现性好等特点.但在使用中也存在不适于手动或其他机械方法操作〔1〕，衍生化试剂中巯基乙醇或巯基丙酸易变质以及由于样品中存在大量硼酸钠缓冲剂，只能用梯度淋洗法分析等问题.作者在AminoQuant氨基酸分析法的基础上，针对注射液组成较简单的具体情况，研究了采用高效液相色谱-紫外检测法测定赖氨酸注射液中赖氨酸含量.
1 仪器、试剂与药品
仪器：Spectro Physics Iso—Chrom泵、SP 8450紫外可见检测器;色谱柱：Waters Bondapak C18柱，4.6 mm×20 cm；流动相：甲醇-水、0.1%TEA(体积比50∶50);流速：1 mL/min，检测波长：326 nm，色谱数据处理采用东西电子公司的A4800工作站.
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药品：L-赖氨酸盐酸盐(Lys.HCL)：生化试剂，上海康达氨基酸厂出品，邻苯二醛(OPA)：化学纯，上海亚太精细化工公司出品，测定氨基酸衍生化试剂(OPA+巯基丙酸)惠普公司提供.
0.15% OPA溶液的配制：取适量的OPA溶于少量甲醇中，用水稀释至所需浓度.
外标溶液的配制：取100 mL量瓶6个，分别准确称取盐酸赖氨酸标准品20、40、60、80、100、120 mg，用少量水溶解，以70%(体积比)乙醇(事先用三乙胺调节pH至10.7)稀释至刻度，得盐酸赖氨酸200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL标准液.
样品的配制：量取赖氨酸盐酸盐注射液适量(应使所得测定液的浓度在400～500 μg/mL范围内)，用与上述相同的70%乙醇稀释至刻度，混匀.
2 方法与结果
, 百拇医药
2.1 注射液中赖氨酸浓度的测定
量取0.15%OPA溶液2 mL置于具塞玻璃反应管内，加0.5 mL按上述方法配制的测定液，密塞后混匀管内液体，将反应管置于沸水浴中加热1 min，取出后立即冷却至室温，进样10 μL至液相色谱仪中，在326 nm下检测.
2.2 不同衍生化条件下生成物吸光系数的比较
分别量取1 000 μg/mL赖氨酸标准溶液0.05 mL、足够过量的0.15% OPA溶液(0.2 mL)于具塞玻璃反应管内，混匀，将胶塞塞紧后在沸水浴上加热1 min，冷却，稀释50倍，以同样倍数稀释的衍生化试剂为对照，得紫外光谱(图1a).再分别取同上浓度和体积的赖氨酸标准溶液与惠普公司提供的OPA-巯基丙酸衍生化试剂0.2 mL，在AminoQuant氨基酸分析法推荐的条件下(40℃加热5 s)反应后冷却，同样稀释50倍，以同样倍数稀释的衍生化试剂为对照，得紫外光谱(图1b).由图可见，在320～330 nm范围内，两种衍生化方法所得产物吸光度值相当接近.
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如上所述,将1 000 μg/mL赖氨酸标准溶液与0.15% OPA溶液在具塞的玻璃反应管内混匀，置于不同温度的恒温水浴中保持不同时间，取反应管内液体分别向液相色谱仪中进样10 μL，分别求得赖氨酸衍生化反应产物的峰面积(图2).由图2可见，在相同温度下，赖氨酸与OPA衍生化反应吸光度值总是开始随时间增加而增加，当达到极大值后又逐渐减少；高温下达到吸光度极大值的时间短，所达到的极大值也较大.
Fig.1 UV spectrograms of lysine derivates
a—Derivatizing with OPA only;
b—With AminoQuant reagent
Fig.2 HPLC peak area of lysine-OPA derivate obtained at different reaction temperatures as functions of derivatizing times
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1—100℃；2—80℃；3—60℃；4—40℃；5—25℃
2.3 赖氨酸注射液中赖氨酸含量的测定结果
按注射液中赖氨酸浓度测定方法测得7批次样品中盐酸赖氨酸百分含量分别为32.4(1.2%)、32.2(2.1%)、32.0(0.9%)、32.6(1.1%)、32.5(0.6%)、33.1(1.5%)和30.8(1.1%)，括号中为每个样品4次测定结果的相对标准偏差.
2.4 线性关系考察
按上述方法分别测得200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL(重量与体积比)标准溶液中赖氨酸峰面积，求得峰面积-浓度关系，得回归方程：y=-118 544+3 817.5x，r=0.999 8，其中x为浓度(μg/mL)，y为峰面积.
, 百拇医药 2.5 精密度试验
取1 000 μg/mL赖氨酸盐酸盐标准溶液按“2.1”项下方法连续进样6次，所得峰面积值为3 716 086、3 780 451、3 748 446、3 741 196、3 690 563、3 652 782,这些值的平均值为3 721 588,RSD为1.2%.
2.6 回收率试验
配制足量的约400 μg/mL盐酸赖氨酸样品溶液，多次测定其浓度，求得平均值为458.9 μg/mL.分别在5个25 mL容量瓶中加入约25 mg盐酸赖氨酸标准品并准确称量，用上述盐酸赖氨酸样品溶液溶解、混匀，用前述样品测定方法，测得标准品加入后的样品溶液中盐酸赖氨酸的含量，求出加入标准品前后盐酸赖氨酸含量的增量，与加入的盐酸赖氨酸量相比，计算回收率,结果见表1.
Tab.1 The recovery test No.
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Lys.HCl added/μg.mL-1
Lys.HCl found/μg.mL-1
Lys.HCl recovery/%
Mean/%
RSD/%
1
1 036
1 042
100.6
2
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1 048
1 026
97.9
3
1 004
1 007
100.3
99.7
2.4
4
1 072
1 103
102.9
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5
1 048
1 050
96.9
3 讨论
AminoQuant方法通过衍生化极大地提高了测定氨基酸的灵敏度，其准确度与精密度也好，但其衍生化反应是在pH=10.4硼酸钠缓冲体系下进行的，如果采用溶剂强度较大的流动相淋洗，样品进入液相色谱仪中会导致硼酸钠析出，使色谱柱堵塞，因此只能从较低的溶剂强度开始作梯度淋洗.但在所分析样品比较简单的情况下，如果采用固定组成流动相淋洗，可以选择合适的溶剂强度，使欲分析组分出峰时间减至最短；比较采用梯度淋洗，至少省下了使溶剂强度恢复到初始状态并使柱达到平衡状态的时间.在一个典型的AminoQuant分析程序中，完成一个全分析费时25 min〔1〕，赖氨酸衍生物的流出时间为14 min；而在本实验条件下，一次赖氨酸分析费时6 min.
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AminoQuant方法另一个问题是衍生化试剂中的巯基丙酸不易保存、价格较贵.在安瓿中封存的衍生化试剂能保存3个月，打开后只能维持几天内有效.建议仅用衍生化试剂OPA与赖氨酸反应，选择合适反应条件，用紫外检测器检测时，也能达到AminoQuant氨基酸分析法相应的灵敏度.由图2可见，选择OPA与赖氨酸在沸水浴中反应1 min后测定生成的赖氨酸衍生物，可以达到较高的灵敏度，反应条件也好控制.
在本实验中配制样品溶液和外标溶液时，都是取适量的样品和标准品，用少量水溶解，以70%(体积比)乙醇(事先用三乙胺调节pH至10.7)在容量瓶中稀释至刻度。盐酸赖氨酸标准液的浓度为200～1 200 μg/mL(重量与体积比).采用70%乙醇溶解样品，可以防止在环境温度较高时，赖氨酸受细菌作用变质，导致其浓度发生变化.
在上述色谱条件下，将标准的和欲测浓度的赖氨酸盐酸盐溶液经衍生化后进样分析,赖氨酸衍生物的色谱峰的保留时间约为6.2 min.除注射OPA溶液时也出现的一些小峰外，未见其他峰.所得色谱图见图3.对赖氨酸衍生物峰测得的柱效约为10 000/m.
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在本实验中发现，OPA与氨基酸反应产生的紫外吸收或荧光物质的归属仍然存在一些疑问.最早提出用OPA作氨基酸的衍生化试剂的Roth〔2〕指出，如果在衍生化时先在氨基酸中加入OPA，最后加入巯基乙醇，产生的荧光强度比在OPA和巯基乙醇的混合溶液中加入氨基酸溶液减少许多，他认为这提示在巯基乙醇不存在时，OPA会与氨基酸生成非荧光的产物.这种产物(很可能是Schiff碱)不能进一步与巯基化合物生成荧光化合物.Roth还指出，已经生成的衍生物置于pH6.0～11.5条件下时，其荧光强度不变；赖氨酸在衍生化时最佳的条件是pH6.0～7.0.作者发现，只有存在硼酸钠缓冲剂时，OPA、巯基乙醇才能与赖氨酸生成在338 nm波长处有较强吸收的产物；并且当上述产物与加有0.1% TEA的流动相等量混合时，这种吸收消失，提示可能发生了某种反应，反应产物与原产物的紫外图谱不同，见图4.说明AmionQuant方法衍生化的产物是复杂的，在一些条件下能产生有紫外吸收的产物，即使已经产生，在pH等条件发生变化的情况下也会分解；而在衍生化产生紫外吸收物质的同时又会产生不相同的荧光化合物，这个(或这些)荧光化合物在pH7.5～12范围内相当稳定.
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Fig.3 HPLC Chromatograms of lysine hydrochloride injection samples after derivatization.
Fig.4 Change of UV spectrograms of lysine-AminoQuant reagent derivate in media with different pH
a—In normal basic media；b—In media with lower pH
从图2可以看出，赖氨酸与OPA产生紫外吸收物质的反应比较缓慢并且产物不稳定，在各个温度下反应产物的时间-吸光度曲线都是先上升，到达一个峰值后再下降.在较低温度下，经过较长时间可以达到一个吸光度相对稳定的阶段，但最后吸收值还会下降.在高温下这种趋势可以看得很清楚，在较短的时间内吸光度已经达到了峰值，并且可能是由于吸光物质的分解速度并不随着成比例地增加，高温下达到的峰值也较大.这样从衍生化反应的耗时和测定的灵敏度两个角度考虑，都应在高温下进行衍生化反应.实验结果证明，如果严格地把衍生化反应的时间控制在1 min，可以得到非常准确和精密的测定结果.
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参考文献
1，Godel H,Seitz P,Verhoef M. OPA-FMOC联用全自动柱前衍生氨基酸分析——AminoQuant氨基酸分析法. 氨基酸应用专集,1995,(5):1～7
2，Roth M.Fluorescence reaction for amino acids. Anal Chem,1971,43:880
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收稿日期:2000-03-20, http://www.100md.com