用双波长分光光度法测定大鼠小肠循环液中酚红的含量
作者：吴刚 何勇 王红梅
单位：吴刚 何勇(佳木斯大学药学系，佳木斯 154003)；王红梅(佳木斯市中心医院)
关键词：酚红；双波长分光光度法；小肠循环液
沈阳药科大学学报000511 摘 要 采用双波长分光光度法测定了大鼠小肠循环液中酚红的含量，方法的线性范围为1～8 mg/L，回收率为99.88%～99.99%(n=5)，日内RSD为0.51%～1.27%(n=4)，日间RSD为0.58%～2.29%(n=4).
分类号 R914.4
Determination of the Content Phenol Red in the Rat′s Small Intestine Circulation Solution by Dual Wavelength Spectrophotometry
, http://www.100md.com
Wu Gang，He Yong, Wang Hongmei
(Department of Pharmacy, Jiamusi University,Jiamusi 154003)
Abstract A spectrophotometric method has been developed for the determination of phenol red in rat′s small intestine circulation solution. Dual wavelength spectrophotometry was used at 558 nm and 570 nm. 0.1 mol/L NaOH was selected as the solvent.The calibration curve was linear in the range from 1 to 8 mg/L. The recoveries were 99.88%～99.99%. The within day precision was 0.51%～1.27% and the day to day precision was 0.58%～2.29%. This method can be used to determine phenol red in rat′s small intestine circulation.
, 百拇医药
Key words phenol red;dual wavelength spectrophotometry;small intestine circulation solution
在对药物小肠吸收研究中，通常用酚红来标示在体小肠吸收模型中循环液的体积变化〔1〕，对其在大鼠小肠循环液中的测定，采用的是可见分光光度法〔2〕.基于这一方法存在着吸光度稳定性差，测定波长不在吸收峰处以及小肠循环液有干扰等问题，作者采用了双波长分光光度法.
1 材料
1.1 仪器、试药与动物
UV—VIS 756型分光光度计(上海分析仪器三厂)；RDB—Ⅱ蠕动泵(沙洲仪器仪表厂)；酚红和其他试剂均为分析纯；Wister大鼠(雄性200～300 g，佳木斯大学动物室提供).
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1.2 试液
酚红母液：精密称取酚红100 mg置200 mL容量瓶中，加适量水微热使其溶解，放置至室温后，加水至刻度.
酚红标准液：精密吸取酚红母液1、3、4、5、6、8 mL分别置50 mL容量瓶中，加Krebs-Ringer营养液至刻度，配制系列浓度酚红溶液.
空白肠循环液：按大鼠在体回流实验方法和要求〔3，4〕,装好循环装置加50 mL Krebs-Ringer营养液，加搅拌子搅拌，水浴(37±0.5)℃保温，进行循环.分别于1、2、3、4 h后取样.
肠循环液：精密吸取酚红母液1、4、8 mL分别置50 mL 量瓶中，加Krebs-Ringer营养液至刻度，置大鼠小肠循环装置中，于搅拌、保温条件下，循环4 h后取样.
, 百拇医药 2 方法与结果
2.1 方法
精密吸取待测液0.50 mL，置具塞试管中，精密加入0.1 mol/L NaOH溶液4.50 mL混匀，以0.1 mol/L NaOH溶液为参比，在仪器上于558 nm和570 nm处测定吸光度，代入工作方程进行计算.
2.2 吸收光谱
酚红、空白肠循环液的可见吸收光谱(图1)表明：酚红的最大吸收波长为558 nm,空白肠循环液在可见光区有一定的吸收，在558 nm附近的吸收近似一水平直线，在558 nm和570 nm具有等吸收.
2.3 吸光度稳定性
于不同时间测定酚红在558 nm和570 nm的吸光度.结果显示，酚红在0.1 mol/L NaOH溶液中吸光度2 h 内无改变.
, 百拇医药
Fig.1 Absorption of phenol red and intestinal circulation solutions in 0.1 mol/L NaOH
1—Phenol red(4 μg/mL)；2—Intestinal circulation solution
2.4 干扰试验
在测定的条件下，不同鼠的空白肠循环液在4 h内的△A558-570均可视为零，未发现对测定有干扰.
2.5 线性范围
由酚红的标准溶液测定得，在1～8 mg/L浓度范围内，酚红的吸光度差值△A558-570与浓度C的线性关系良好.回归方程为：C=-0.096 1+22.74△A，r=0.999 9(n=6).
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2.6 回收率
分别取酚红母液适量，用空白肠循环液制备高中低3种浓度溶液各5份，进行测定，由工作方程求算回收率，结果见表1.
Tab.1 The recoveries of phenol red Added/mg.L-1
Found/mg.L-1
Recovery/%
RSD/%
1.013
1.012
99.88
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1.58
4.052
4.047
99.88
1.36
8.108
8.017
99.99
0.45
2.7 精密度
取高中低3种浓度的肠循环液各4份，按上述方法测定，计算日内精密度和日间精密度，结果见表2.Tab.2 The results of precision phenol red Added/
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mg.L-1
Within day
Day to day
Found/
mg.L-1
RSD/
%
Found/
mg.L-1
RSD/
%
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1.013
1.001
1.27
0.995 4
2.29
4.052
4.043
1.32
4.037
1.25
8.108
7.097
0.51
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7.064
0.58
3 讨论
在570 nm附近空白肠循环液吸光度变化较小，且酚红在558 nm和570 nm的吸光度在0.2～0.8之间，吸光度差值(△A558-570)较大，故选取570 nm作为参比波长.
b.在碱性溶液中酚红的最大吸收波长为558 nm，而不是550 nm，与文献〔5〕报道相符.酚红的pKa为7.8，在558 nm处的吸收随着pH的增大而升高.实验中发现，酚红在1 mol/L NaOH中的吸收虽较大，但不稳定，在0.5、1.0、1.5、2.0 h吸光度同0 h的吸光度相比分别降低6%、11%、17%、25%；当NaOH的浓度为0.2 mol/L时亦不稳定，吸光度分别降低1%、2%、3%、4%.综合考察吸光度值的大小和吸光度的稳定性，当选取0.1 mol/L NaOH为测定溶剂时，即可保证吸光度比较稳定又有较大的值.
, 百拇医药
参考文献
1，陆彬.药剂学试验.北京：人民卫生出版社，1994.132～133
2，毛凤斐，屠锡德，朱家壁，等.黄芩甙大鼠吸收的研究.南京药学院学报，1984,15(1):61～65
3，崔景斌，吴文惠，胡晋.拉马宁碱大鼠小肠吸收的研究.沈阳药学院学报，1994,11(2):79～82
4，村田敏郎，有田隆一.生物药剂学.朱家壁等译.北京：人民卫生出版社，1979.50～51
5，田村文造.pH指示药の吸光度比とその容量分析ヘの利用.分析化学(日)，1967,16:193～205
收稿日期:2000-01-12
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单位：吴刚 何勇(佳木斯大学药学系，佳木斯 154003)；王红梅(佳木斯市中心医院)
关键词：酚红；双波长分光光度法；小肠循环液
沈阳药科大学学报000511 摘 要 采用双波长分光光度法测定了大鼠小肠循环液中酚红的含量，方法的线性范围为1～8 mg/L，回收率为99.88%～99.99%(n=5)，日内RSD为0.51%～1.27%(n=4)，日间RSD为0.58%～2.29%(n=4).
分类号 R914.4
Determination of the Content Phenol Red in the Rat′s Small Intestine Circulation Solution by Dual Wavelength Spectrophotometry
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Wu Gang，He Yong, Wang Hongmei
(Department of Pharmacy, Jiamusi University,Jiamusi 154003)
Abstract A spectrophotometric method has been developed for the determination of phenol red in rat′s small intestine circulation solution. Dual wavelength spectrophotometry was used at 558 nm and 570 nm. 0.1 mol/L NaOH was selected as the solvent.The calibration curve was linear in the range from 1 to 8 mg/L. The recoveries were 99.88%～99.99%. The within day precision was 0.51%～1.27% and the day to day precision was 0.58%～2.29%. This method can be used to determine phenol red in rat′s small intestine circulation.
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Key words phenol red;dual wavelength spectrophotometry;small intestine circulation solution
在对药物小肠吸收研究中，通常用酚红来标示在体小肠吸收模型中循环液的体积变化〔1〕，对其在大鼠小肠循环液中的测定，采用的是可见分光光度法〔2〕.基于这一方法存在着吸光度稳定性差，测定波长不在吸收峰处以及小肠循环液有干扰等问题，作者采用了双波长分光光度法.
1 材料
1.1 仪器、试药与动物
UV—VIS 756型分光光度计(上海分析仪器三厂)；RDB—Ⅱ蠕动泵(沙洲仪器仪表厂)；酚红和其他试剂均为分析纯；Wister大鼠(雄性200～300 g，佳木斯大学动物室提供).
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1.2 试液
酚红母液：精密称取酚红100 mg置200 mL容量瓶中，加适量水微热使其溶解，放置至室温后，加水至刻度.
酚红标准液：精密吸取酚红母液1、3、4、5、6、8 mL分别置50 mL容量瓶中，加Krebs-Ringer营养液至刻度，配制系列浓度酚红溶液.
空白肠循环液：按大鼠在体回流实验方法和要求〔3，4〕,装好循环装置加50 mL Krebs-Ringer营养液，加搅拌子搅拌，水浴(37±0.5)℃保温，进行循环.分别于1、2、3、4 h后取样.
肠循环液：精密吸取酚红母液1、4、8 mL分别置50 mL 量瓶中，加Krebs-Ringer营养液至刻度，置大鼠小肠循环装置中，于搅拌、保温条件下，循环4 h后取样.
, 百拇医药 2 方法与结果
2.1 方法
精密吸取待测液0.50 mL，置具塞试管中，精密加入0.1 mol/L NaOH溶液4.50 mL混匀，以0.1 mol/L NaOH溶液为参比，在仪器上于558 nm和570 nm处测定吸光度，代入工作方程进行计算.
2.2 吸收光谱
酚红、空白肠循环液的可见吸收光谱(图1)表明：酚红的最大吸收波长为558 nm,空白肠循环液在可见光区有一定的吸收，在558 nm附近的吸收近似一水平直线，在558 nm和570 nm具有等吸收.
2.3 吸光度稳定性
于不同时间测定酚红在558 nm和570 nm的吸光度.结果显示，酚红在0.1 mol/L NaOH溶液中吸光度2 h 内无改变.
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Fig.1 Absorption of phenol red and intestinal circulation solutions in 0.1 mol/L NaOH
1—Phenol red(4 μg/mL)；2—Intestinal circulation solution
2.4 干扰试验
在测定的条件下，不同鼠的空白肠循环液在4 h内的△A558-570均可视为零，未发现对测定有干扰.
2.5 线性范围
由酚红的标准溶液测定得，在1～8 mg/L浓度范围内，酚红的吸光度差值△A558-570与浓度C的线性关系良好.回归方程为：C=-0.096 1+22.74△A，r=0.999 9(n=6).
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2.6 回收率
分别取酚红母液适量，用空白肠循环液制备高中低3种浓度溶液各5份，进行测定，由工作方程求算回收率，结果见表1.
Tab.1 The recoveries of phenol red Added/mg.L-1
Found/mg.L-1
Recovery/%
RSD/%
1.013
1.012
99.88
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1.58
4.052
4.047
99.88
1.36
8.108
8.017
99.99
0.45
2.7 精密度
取高中低3种浓度的肠循环液各4份，按上述方法测定，计算日内精密度和日间精密度，结果见表2.Tab.2 The results of precision phenol red Added/
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mg.L-1
Within day
Day to day
Found/
mg.L-1
RSD/
%
Found/
mg.L-1
RSD/
%
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1.013
1.001
1.27
0.995 4
2.29
4.052
4.043
1.32
4.037
1.25
8.108
7.097
0.51
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7.064
0.58
3 讨论
在570 nm附近空白肠循环液吸光度变化较小，且酚红在558 nm和570 nm的吸光度在0.2～0.8之间，吸光度差值(△A558-570)较大，故选取570 nm作为参比波长.
b.在碱性溶液中酚红的最大吸收波长为558 nm，而不是550 nm，与文献〔5〕报道相符.酚红的pKa为7.8，在558 nm处的吸收随着pH的增大而升高.实验中发现，酚红在1 mol/L NaOH中的吸收虽较大，但不稳定，在0.5、1.0、1.5、2.0 h吸光度同0 h的吸光度相比分别降低6%、11%、17%、25%；当NaOH的浓度为0.2 mol/L时亦不稳定，吸光度分别降低1%、2%、3%、4%.综合考察吸光度值的大小和吸光度的稳定性，当选取0.1 mol/L NaOH为测定溶剂时，即可保证吸光度比较稳定又有较大的值.
, 百拇医药
参考文献
1，陆彬.药剂学试验.北京：人民卫生出版社，1994.132～133
2，毛凤斐，屠锡德，朱家壁，等.黄芩甙大鼠吸收的研究.南京药学院学报，1984,15(1):61～65
3，崔景斌，吴文惠，胡晋.拉马宁碱大鼠小肠吸收的研究.沈阳药学院学报，1994,11(2):79～82
4，村田敏郎，有田隆一.生物药剂学.朱家壁等译.北京：人民卫生出版社，1979.50～51
5，田村文造.pH指示药の吸光度比とその容量分析ヘの利用.分析化学(日)，1967,16:193～205
收稿日期:2000-01-12
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