人工培养蛹虫草多糖的研究
作者：宾文 于荣敏 白秀峰
单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：蛹虫草；组织培养；多糖；结构分析
沈阳药科大学学报000518 摘 要 以人工培养蛹虫草为原料,分离纯化得到蛹虫草多糖(CMPS),经紫外扫描测定其为糖蛋白.用凝胶过滤色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证了纯度.测定了多糖的分子质量、糖含量和糖醛酸含量、单糖组成及摩尔比、蛋白含量及氨基酸组成、苷键构型等.
分类号 Q538
Studies on Polysaccharide in the Tissue Cultures of Cordyceps Militaris
Bin Wen, Yu Rongmin, Bai Xiufeng
, http://www.100md.com
(Department of Pharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract Through the application of the conventional extraction methods and Sephadex chromatography separating, the polysaccharide constituent CMPS of Cordyceps militaris was obtained, and it was supposed to be a glucoprotein by the information of UV. The homogeneity was observed by gel permeation chromatography(GPC)and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The molecular weight, protein content, sugar and uronic acid content as well as sugar composition of CMPS were measured either. Connecting positions and configuration analysis of glycosidic linkage of CMPS were proposed preliminarily by periodate oxidation, Smith degradation and IR chromatography.
, http://www.100md.com
Key words Cordyceps militaris; tissue culture; polysaccharide；structural analysis
蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)又称北冬虫夏草,与冬虫夏草同属异种.前者有效成分的种类及含量与后者接近,而人工培养又较后者成功.因此,近年来,蛹虫草人工培养及其活性成分的研究尤为活跃.作者对蛹虫草人工培养的代谢产物蛹虫草多糖(CMPS)进行了研究.
1 材料
人工培养蛹虫草干品,由沈阳市东联食用菌厂罗刚提供;Sephadex G—75、Sephacryl S—300HR为瑞典Pharmacia公司生产和Sigma公司生产,上海化学试剂采购供应站分装；Dextran T10、T70、T100、T250,香港Farco chemical公司生产；葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖为上海化学试剂采购供应站生产；乙醇、正丁醇、氯仿、苯酚、硫酸、硼砂、过硫酸铵等试剂均为分析纯，由沈阳药科大学药品库提供.
, http://www.100md.com
ZFQ85A旋转蒸发器(上海医械专机厂)；LG—3型多用冷冻干燥机(宁波市生化仪器厂)；HSC—20R—A高速冷冻离心机(图门市离心机厂)；HL—2型恒流水泵(上海沪西仪器厂)；BJQ—74—2部分收集器(上海医疗器械十厂)；DYY—3电泳仪(北京六一仪器厂)；紫外-可见分光光度计(Shimaduz 2201)；毛细管气相色谱仪(Shimaduz GC—17A)；色谱数据处理仪(Shimaduz C—RTA)；付立叶红外分光光度计(Bruker TFS—55)；日立835—50型氨基酸自动分析仪(日本日立电器公司)；JMS—D300色质谱联用仪(日本日立电器公司).
2 方法
2.1 人工培养蛹虫草粗多糖的提取
干燥蛹虫草子座,粉碎,无水乙醇脱脂12 h后,70～75℃水浴提取(10 h/次,5次),过滤,合并滤液,减压浓缩,浓缩液以Sevag法除蛋白,透析48 h,乙醇沉淀至含醇量70%,离心(7 000 r/min,15 min),收集沉淀,真空干燥,得粗多糖.
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2.2 精多糖(CMPS)的分离纯化
粗多糖经Sephadex G—75柱层析;洗脱液为0.1 mol/L NaCl溶液;流速为0.8 mL/min;苯酚-硫酸法检测;收集吸收度较大部分,透析48 h,真空干燥,得精多糖.
2.3 CMPS的纯度验证
2.3.1 凝胶色谱法
凝胶Sephacryl S—300HR;洗脱液为0.1 mol/L NaCl溶液;流速20 mL/h;苯酚-硫酸法检测.
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法〔1〕
按表1配制凝胶.取样品2 mg,加入1 mL样品缓冲液,取20 μL上样.电压110 V,电泳2 h，染色.将凝胶置于基础液中固定2 h,再在氧化液中氧化1 h,然后置于还原液中还原1 h,染色液中浸染2 h,最后用基础液漂洗至背景颜色褪清.
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Tab.1 The compositions of separating gel and sealing gel for PAGE Stock
solution
Sealing
gel/mL
Separating
gel/mL
Buffer/mL
Acr∶Bis
1.25
4.00
Buffer
, 百拇医药
1.25
4.00
200
AP
0.30
1.00
Water
2.17
10.90
800
TEMED
0.03
0.10
, 百拇医药
2.4 CMPS的分子质量测定
凝胶过滤色谱法测定分子质量.凝胶采用Sephacryl S—300HR;0.1 mol/L NaCl溶液洗脱;流速20 mL/h;硫酸-苯酚法检测.用具标准分子质量的葡聚糖T10、T70、T100、T250分别上柱测得Ve值，另以蓝葡聚糖上柱，测得V0值,以Ve/V0对lg MW绘制标准曲线.样品在相同条件下上柱,测得其Ve值,代入标准曲线得分子质量.
2.5 糖含量分析
2.5.1 苯酚-硫酸法测定CMPS的糖含量〔2〕
精称干燥至恒重的葡萄糖20 mg,置100 mL容量瓶中,溶解,加水至刻度.分别取标准液1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 mL,置10 mL容量瓶中,加水至刻度.取该溶液各0.2 mL置于6支20 mL试管,另取一支试管加入0.2 mL水作空白.加入0.5%苯酚溶液0.4 mL,混合后,迅速加入2 mL浓硫酸,混匀后室温放置30 min,在波长490 nm处测定吸收度.以糖浓度对吸收度制作标准曲线.样品配制成80 μg/mL的多糖溶液,同前法操作,结果代入标准曲线,求出样品的糖含量.
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2.5.2 间苯二酚-硫酸法测定糖醛酸含量〔3，4〕
2.5.2.1 试剂
硫酸-硼酸盐溶液：称取四硼酸钠(Na2B4O7*10H2O)0.467 g,溶于100 mL浓硫酸中.15%间苯二酚溶液：0.15 g间苯二酚溶于0.5%的NaOH溶液中,定容至100 mL.
2.5.2.2 样品测定
称取干燥至恒重的半乳糖醛酸25 mg,置于25 mL容量瓶中,溶解,定容至25 mL作为标准液.分别取标准液0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL,置10 mL容量瓶中,稀释至刻度.然后各取上述溶液1 mL于6支20 mL试管中,另取1支试管加入1 mL水作为空白对照.冰水浴10 min,分别加入6 mL硫酸-硼酸盐溶液,振荡3次,每次30 s.将试管置于100℃水浴上加热5 min,然后立即放入冰水浴至冷,加入0.1 mL 0.15%间二苯酚溶液,对照加入0.1 mL 0.5%NaOH溶液,显色,再次充分振荡,静置20 min,波长520 nm处测定吸收度,以糖醛酸浓度对吸收度做图制备标准曲线.取两支试管,一支为样品,一支为空白,按前述操作,样品加入0.1 mL 0.15%间二苯酚溶液,空白加入0.1 mL 0.5%NaOH溶液,520 nm处比色测定,测得的吸收度值代入标准曲线,得到样品中糖醛酸的含量.
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2.6 CMPS的组成分析
2.6.1 酸水解
取多糖纯品10 mg,加入1 mol/L的H2SO4 2 mL,封管,100℃水解8 h,BaCO3中和,离心(12 000 r/min,20 min),上清液真空干燥.
2.6.2 标准单糖重量矫正因子的确定〔5〕
准确称取干燥至恒重的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖各250 mg，置于25 mL容量瓶中,溶解，定容至25 mL，分别取各标准单糖液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5支10 mL具塞刻度试管中；另取一支试管加各种标准单糖液0.1 mL,混合后真空干燥.各加入10 mg盐酸羟胺,再加入0.5 mL含内标肌醇六乙酰酯〔3〕的吡啶溶液,振荡混匀,90℃水浴反应10 min,取出,至室温时再加入0.5 mL醋酸酐,90℃反应30 min,真空干燥.加入0.2 mL氯仿溶解,参考文献进行GC测定〔5〕.
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重量矫正因子(f)=(Ws/Wi)/(As/Ai)(Ws:标准单糖重量;Wi:内标重量;As:标准单糖峰面积;Ai:内标峰面积).
2.6.3 CMPS中单糖组成的摩尔比测定
称取CMPS 10 mg,按“2.6.1”方法进行完全水解,以“2.6.2”方法乙酰化,与“2.6.2”相同色谱条件GC分析.
组成CMPS的各种单糖的摩尔比=(As/Ai*f1/M1):(As/Ai*f2/M2):…(Ms:为各标准单糖的分子质量).
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2.6.4 CMPS的结合蛋白含量及氨基酸组成分析
依据标准GB/T14965-94由中国科学院生态研究所测试中心生态环境测试部测定.
2.6.5 过碘酸氧化和Smith降解〔6〕
测得0.1 mmol的NaIO4溶液以及CMPS与0.1 mmol NaIO4混合溶液反应5 d的反应液的最大吸收波长均为220 nm.在220 nm处以吸收度对浓度做图，制备标准曲线.准确称取CMPS 20 mg,加入25 mL 0.015 mol/L的NaIO4溶液,4℃避光保存.每隔24 h取样30 μL,水定容至5 mL,在220 nm处测得吸收度,代入标准曲线,计算NaIO4消耗量.反应6 d后,NaIO4的浓度不再下降,即样品的过碘酸氧化完全.氧化完全的反应液，加入0.2 mL乙二醇分解未完全反应的NaIO4, 蒸馏水中透析24 h，溶液用NaBH4 20 mg室温还原12 h以上，至无醛基反应(菲林反应).用0.1 mol/L醋酸调pH至5.0,透析24 h,溶液减压浓缩，真空干燥.用20 mol/L的三氟乙酸100℃封管水解12 h.水解液真空干燥.加入甲醇反复蒸干，以除尽残留的三氟乙酸，水解后的样品分别进行纸色谱分析和气相色谱分析.
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2.6.5.1 纸色谱分析
展开系统：正丁醇-乙醇-水(体积比4∶1∶5,上相)；显色剂:氨制AgNO3溶液.样品用少量水溶解，上行法展开12 h.
2.6.5.2 气相色谱分析
水解样品蒸除三氟乙酸后，加入10 mg盐酸羟胺和0.5 mL含肌醇六乙酰酯(8 mg/mL)的吡啶液,振荡混匀,90℃水浴反应10 min,放至室温，加入0.5 mL醋酐,90℃水浴反应30 min,真空干燥.加入0.2 mL氯仿,进行GC测定.同时取10 mg/mL的甘油、赤藓醇、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等标准单糖溶液各0.1 mL混合,干燥,同上法乙酰化,进行GC分析.
3 结果
蛹虫草粗多糖的产率为5.07%.粗多糖用Sephadex G—75分离得到CMPS，经由Sephacryl S—300HR凝胶色谱验证CMPS的洗脱曲线呈一单峰,且对称;由PAGE法验证CMPS为一条谱带;可以认为CMPS为一纯品.CMPS的紫外扫描图谱没有明显的核酸吸收峰(260 nm)，但有蛋白质吸收峰(283 nm)，证明是糖蛋白，相对分子质量约为30 000，糖含量分析得纯糖含量为55.84%,糖醛酸含量为17.84%.
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多糖样品单糖组成的摩尔比为:鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖依次为1.00∶0.50∶51.99∶2.38∶36.50,GC图谱如图1.
结合蛋白含量为24.17%,结合蛋白的氨基酸组成见表2.Tab.2 The compositions of amino acids in CMPS/mmol.100g-1 ASP
THR
SER
GLU
GLY
TEU
TYP
PHE
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LYS
NH3
19.6
14.2
18.5
21.8
21.1
3.9
5.0
3.3
18.3
35.8
ALA
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CYS
VAL
MET
ILE
HIS
ARG
PRO
TRP
23.5
3.4
10.3
1.9
3.4
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2.6
6.6
12.6
—
CMPS的红外光谱可见：3 500～3 400 cm-1、2 924 cm-1、1 455 cm-1、1 648 cm-1、1 150～1 000 cm-1等都是多糖类的特征吸收峰，3 200～3 600 cm-1是O—H的伸缩振动，2 800～3 000 cm-1是C—H伸缩振动，1 200～1 400 cm-1是C—H的变角振动.1 648 cm-1及1 530 cm-1是羧基和乙酰基的特征吸收峰，说明有糖醛酸存在.1 000～1 100 cm-1表明单糖残基为吡喃型构型，890 cm-1处的吸收峰是吡喃β型C—H变角振动.960 cm-1是—CH3的摇摆振动，为鼠李糖的6位甲基或甲基化了的糖残基.810～870 cm-1表明多糖中有甘露糖.红外光谱数据与糖醛酸含量分析,与单糖组成分析结果一致.
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Fig.1 Gas chromatography of acetate derivatives
A—standard monosaccharides;B—products of hydrolysis of CMPS;1—Rha;2—Ara;3—Xyl;4—Man;5—Glc;6—Gal
Fig.2 Gas chromatographys of products of periodate oxidation/Smith degradation of CMPS
A—Standard；B—Sample；1—Gly;2—Ery;3—Rha;4—Xyl;5—Man;6—Glc;7—Gal
CMPS经过碘酸氧化,平均每摩尔脱水残基消耗85 mmol NaIO4.Smith降解产物有少量赤藓醇、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和大量的甘油.
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CMPS的过碘酸氧化、Smith 降解产物，经乙酰化后进行气相色谱分析，结果如图2所示.
4 讨论
综合上述分析结果：CMPS主要有1-2连接的Man残基，1-4或1-6连接的半乳糖残基，1-2分支的Gala,1-4连接的2或3位有分支的Glc残基或1-3连接的Glc残基.苷键构型主要为β型.目前对蛋白部分的连接方式还没有准确的测定方法.
从上述分析推测CMPS是含甘露半乳糖及半乳糖醛酸聚糖的糖蛋白.据文献〔7〕报道，细菌荚膜多糖一般由两部分组成，即具有各种聚合度的寡糖重复单位和非糖的取代基团.20世纪70年代初期，Troy等研究产气克氏杆菌(K.aeroyenes)的细胞外膜结构时，发现其荚膜多糖是半乳糖、甘露糖及糖醛酸等残基重复单位组成的多聚糖.但是荚膜多糖的化学结构是多样性的，显著地受到培养基的物理条件和营养条件的影响.荚膜多糖虽然不是细胞生长所必须的，但是对于细胞识别具有重要意义.根据本实验结果推断：主链可能主要为甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸的多聚糖链，另外寡糖链上还连有蛋白部分，显示CMPS很可能就是荚膜多糖.有关CMPS的进一步结构信息，需要通过甲基化物的GC-MS分析、部分酸水解、NMR光谱分析等加以确证.
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参考文献
1，赵永灵，王世林，李晓玉.兜唇石斛多糖的研究.云南植物研究，1994，1(4)：392～396
2，许益民，郭立伟，陈健伟.半枝莲多糖的分离、纯化及其理化性质.天然产物研究与开发，1992，4(1)：1～3
3，Kintner P K, Van Buren J P.Carbohydrate interference and it′s correction in dectin analysis using the m-hydroxydiphenyl method.J Food Sci，1982,47：756～759
4，Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G.New method for quantitative determination of uronic acids.Analy Biochem，1973,54：484～489
5，叶淳渠，方积年.竹黄多糖SB-Ⅰ及SB-Ⅱ的组成研究.药学学报，1981，16(7)：524～528
6，黄桂宽，李毅，谢荣仿.银杏叶多糖的分离纯化及鉴定.中国生化药物杂志,1996，17(4)：157～158
7，吴东儒.糖类的生物化学.北京：高等教育出版社：1987
收稿日期:2000-01-01, http://www.100md.com
单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：蛹虫草；组织培养；多糖；结构分析
沈阳药科大学学报000518 摘 要 以人工培养蛹虫草为原料,分离纯化得到蛹虫草多糖(CMPS),经紫外扫描测定其为糖蛋白.用凝胶过滤色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证了纯度.测定了多糖的分子质量、糖含量和糖醛酸含量、单糖组成及摩尔比、蛋白含量及氨基酸组成、苷键构型等.
分类号 Q538
Studies on Polysaccharide in the Tissue Cultures of Cordyceps Militaris
Bin Wen, Yu Rongmin, Bai Xiufeng
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Abstract Through the application of the conventional extraction methods and Sephadex chromatography separating, the polysaccharide constituent CMPS of Cordyceps militaris was obtained, and it was supposed to be a glucoprotein by the information of UV. The homogeneity was observed by gel permeation chromatography(GPC)and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The molecular weight, protein content, sugar and uronic acid content as well as sugar composition of CMPS were measured either. Connecting positions and configuration analysis of glycosidic linkage of CMPS were proposed preliminarily by periodate oxidation, Smith degradation and IR chromatography.
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Key words Cordyceps militaris; tissue culture; polysaccharide；structural analysis
蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)又称北冬虫夏草,与冬虫夏草同属异种.前者有效成分的种类及含量与后者接近,而人工培养又较后者成功.因此,近年来,蛹虫草人工培养及其活性成分的研究尤为活跃.作者对蛹虫草人工培养的代谢产物蛹虫草多糖(CMPS)进行了研究.
1 材料
人工培养蛹虫草干品,由沈阳市东联食用菌厂罗刚提供;Sephadex G—75、Sephacryl S—300HR为瑞典Pharmacia公司生产和Sigma公司生产,上海化学试剂采购供应站分装；Dextran T10、T70、T100、T250,香港Farco chemical公司生产；葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖为上海化学试剂采购供应站生产；乙醇、正丁醇、氯仿、苯酚、硫酸、硼砂、过硫酸铵等试剂均为分析纯，由沈阳药科大学药品库提供.
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ZFQ85A旋转蒸发器(上海医械专机厂)；LG—3型多用冷冻干燥机(宁波市生化仪器厂)；HSC—20R—A高速冷冻离心机(图门市离心机厂)；HL—2型恒流水泵(上海沪西仪器厂)；BJQ—74—2部分收集器(上海医疗器械十厂)；DYY—3电泳仪(北京六一仪器厂)；紫外-可见分光光度计(Shimaduz 2201)；毛细管气相色谱仪(Shimaduz GC—17A)；色谱数据处理仪(Shimaduz C—RTA)；付立叶红外分光光度计(Bruker TFS—55)；日立835—50型氨基酸自动分析仪(日本日立电器公司)；JMS—D300色质谱联用仪(日本日立电器公司).
2 方法
2.1 人工培养蛹虫草粗多糖的提取
干燥蛹虫草子座,粉碎,无水乙醇脱脂12 h后,70～75℃水浴提取(10 h/次,5次),过滤,合并滤液,减压浓缩,浓缩液以Sevag法除蛋白,透析48 h,乙醇沉淀至含醇量70%,离心(7 000 r/min,15 min),收集沉淀,真空干燥,得粗多糖.
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2.2 精多糖(CMPS)的分离纯化
粗多糖经Sephadex G—75柱层析;洗脱液为0.1 mol/L NaCl溶液;流速为0.8 mL/min;苯酚-硫酸法检测;收集吸收度较大部分,透析48 h,真空干燥,得精多糖.
2.3 CMPS的纯度验证
2.3.1 凝胶色谱法
凝胶Sephacryl S—300HR;洗脱液为0.1 mol/L NaCl溶液;流速20 mL/h;苯酚-硫酸法检测.
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法〔1〕
按表1配制凝胶.取样品2 mg,加入1 mL样品缓冲液,取20 μL上样.电压110 V,电泳2 h，染色.将凝胶置于基础液中固定2 h,再在氧化液中氧化1 h,然后置于还原液中还原1 h,染色液中浸染2 h,最后用基础液漂洗至背景颜色褪清.
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Tab.1 The compositions of separating gel and sealing gel for PAGE Stock
solution
Sealing
gel/mL
Separating
gel/mL
Buffer/mL
Acr∶Bis
1.25
4.00
Buffer
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1.25
4.00
200
AP
0.30
1.00
Water
2.17
10.90
800
TEMED
0.03
0.10
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2.4 CMPS的分子质量测定
凝胶过滤色谱法测定分子质量.凝胶采用Sephacryl S—300HR;0.1 mol/L NaCl溶液洗脱;流速20 mL/h;硫酸-苯酚法检测.用具标准分子质量的葡聚糖T10、T70、T100、T250分别上柱测得Ve值，另以蓝葡聚糖上柱，测得V0值,以Ve/V0对lg MW绘制标准曲线.样品在相同条件下上柱,测得其Ve值,代入标准曲线得分子质量.
2.5 糖含量分析
2.5.1 苯酚-硫酸法测定CMPS的糖含量〔2〕
精称干燥至恒重的葡萄糖20 mg,置100 mL容量瓶中,溶解,加水至刻度.分别取标准液1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 mL,置10 mL容量瓶中,加水至刻度.取该溶液各0.2 mL置于6支20 mL试管,另取一支试管加入0.2 mL水作空白.加入0.5%苯酚溶液0.4 mL,混合后,迅速加入2 mL浓硫酸,混匀后室温放置30 min,在波长490 nm处测定吸收度.以糖浓度对吸收度制作标准曲线.样品配制成80 μg/mL的多糖溶液,同前法操作,结果代入标准曲线,求出样品的糖含量.
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2.5.2 间苯二酚-硫酸法测定糖醛酸含量〔3，4〕
2.5.2.1 试剂
硫酸-硼酸盐溶液：称取四硼酸钠(Na2B4O7*10H2O)0.467 g,溶于100 mL浓硫酸中.15%间苯二酚溶液：0.15 g间苯二酚溶于0.5%的NaOH溶液中,定容至100 mL.
2.5.2.2 样品测定
称取干燥至恒重的半乳糖醛酸25 mg,置于25 mL容量瓶中,溶解,定容至25 mL作为标准液.分别取标准液0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL,置10 mL容量瓶中,稀释至刻度.然后各取上述溶液1 mL于6支20 mL试管中,另取1支试管加入1 mL水作为空白对照.冰水浴10 min,分别加入6 mL硫酸-硼酸盐溶液,振荡3次,每次30 s.将试管置于100℃水浴上加热5 min,然后立即放入冰水浴至冷,加入0.1 mL 0.15%间二苯酚溶液,对照加入0.1 mL 0.5%NaOH溶液,显色,再次充分振荡,静置20 min,波长520 nm处测定吸收度,以糖醛酸浓度对吸收度做图制备标准曲线.取两支试管,一支为样品,一支为空白,按前述操作,样品加入0.1 mL 0.15%间二苯酚溶液,空白加入0.1 mL 0.5%NaOH溶液,520 nm处比色测定,测得的吸收度值代入标准曲线,得到样品中糖醛酸的含量.
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2.6 CMPS的组成分析
2.6.1 酸水解
取多糖纯品10 mg,加入1 mol/L的H2SO4 2 mL,封管,100℃水解8 h,BaCO3中和,离心(12 000 r/min,20 min),上清液真空干燥.
2.6.2 标准单糖重量矫正因子的确定〔5〕
准确称取干燥至恒重的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖各250 mg，置于25 mL容量瓶中,溶解，定容至25 mL，分别取各标准单糖液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5支10 mL具塞刻度试管中；另取一支试管加各种标准单糖液0.1 mL,混合后真空干燥.各加入10 mg盐酸羟胺,再加入0.5 mL含内标肌醇六乙酰酯〔3〕的吡啶溶液,振荡混匀,90℃水浴反应10 min,取出,至室温时再加入0.5 mL醋酸酐,90℃反应30 min,真空干燥.加入0.2 mL氯仿溶解,参考文献进行GC测定〔5〕.
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重量矫正因子(f)=(Ws/Wi)/(As/Ai)(Ws:标准单糖重量;Wi:内标重量;As:标准单糖峰面积;Ai:内标峰面积).
2.6.3 CMPS中单糖组成的摩尔比测定
称取CMPS 10 mg,按“2.6.1”方法进行完全水解,以“2.6.2”方法乙酰化,与“2.6.2”相同色谱条件GC分析.
组成CMPS的各种单糖的摩尔比=(As/Ai*f1/M1):(As/Ai*f2/M2):…(Ms:为各标准单糖的分子质量).
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2.6.4 CMPS的结合蛋白含量及氨基酸组成分析
依据标准GB/T14965-94由中国科学院生态研究所测试中心生态环境测试部测定.
2.6.5 过碘酸氧化和Smith降解〔6〕
测得0.1 mmol的NaIO4溶液以及CMPS与0.1 mmol NaIO4混合溶液反应5 d的反应液的最大吸收波长均为220 nm.在220 nm处以吸收度对浓度做图，制备标准曲线.准确称取CMPS 20 mg,加入25 mL 0.015 mol/L的NaIO4溶液,4℃避光保存.每隔24 h取样30 μL,水定容至5 mL,在220 nm处测得吸收度,代入标准曲线,计算NaIO4消耗量.反应6 d后,NaIO4的浓度不再下降,即样品的过碘酸氧化完全.氧化完全的反应液，加入0.2 mL乙二醇分解未完全反应的NaIO4, 蒸馏水中透析24 h，溶液用NaBH4 20 mg室温还原12 h以上，至无醛基反应(菲林反应).用0.1 mol/L醋酸调pH至5.0,透析24 h,溶液减压浓缩，真空干燥.用20 mol/L的三氟乙酸100℃封管水解12 h.水解液真空干燥.加入甲醇反复蒸干，以除尽残留的三氟乙酸，水解后的样品分别进行纸色谱分析和气相色谱分析.
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2.6.5.1 纸色谱分析
展开系统：正丁醇-乙醇-水(体积比4∶1∶5,上相)；显色剂:氨制AgNO3溶液.样品用少量水溶解，上行法展开12 h.
2.6.5.2 气相色谱分析
水解样品蒸除三氟乙酸后，加入10 mg盐酸羟胺和0.5 mL含肌醇六乙酰酯(8 mg/mL)的吡啶液,振荡混匀,90℃水浴反应10 min,放至室温，加入0.5 mL醋酐,90℃水浴反应30 min,真空干燥.加入0.2 mL氯仿,进行GC测定.同时取10 mg/mL的甘油、赤藓醇、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等标准单糖溶液各0.1 mL混合,干燥,同上法乙酰化,进行GC分析.
3 结果
蛹虫草粗多糖的产率为5.07%.粗多糖用Sephadex G—75分离得到CMPS，经由Sephacryl S—300HR凝胶色谱验证CMPS的洗脱曲线呈一单峰,且对称;由PAGE法验证CMPS为一条谱带;可以认为CMPS为一纯品.CMPS的紫外扫描图谱没有明显的核酸吸收峰(260 nm)，但有蛋白质吸收峰(283 nm)，证明是糖蛋白，相对分子质量约为30 000，糖含量分析得纯糖含量为55.84%,糖醛酸含量为17.84%.
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多糖样品单糖组成的摩尔比为:鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖依次为1.00∶0.50∶51.99∶2.38∶36.50,GC图谱如图1.
结合蛋白含量为24.17%,结合蛋白的氨基酸组成见表2.Tab.2 The compositions of amino acids in CMPS/mmol.100g-1 ASP
THR
SER
GLU
GLY
TEU
TYP
PHE
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LYS
NH3
19.6
14.2
18.5
21.8
21.1
3.9
5.0
3.3
18.3
35.8
ALA
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CYS
VAL
MET
ILE
HIS
ARG
PRO
TRP
23.5
3.4
10.3
1.9
3.4
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2.6
6.6
12.6
—
CMPS的红外光谱可见：3 500～3 400 cm-1、2 924 cm-1、1 455 cm-1、1 648 cm-1、1 150～1 000 cm-1等都是多糖类的特征吸收峰，3 200～3 600 cm-1是O—H的伸缩振动，2 800～3 000 cm-1是C—H伸缩振动，1 200～1 400 cm-1是C—H的变角振动.1 648 cm-1及1 530 cm-1是羧基和乙酰基的特征吸收峰，说明有糖醛酸存在.1 000～1 100 cm-1表明单糖残基为吡喃型构型，890 cm-1处的吸收峰是吡喃β型C—H变角振动.960 cm-1是—CH3的摇摆振动，为鼠李糖的6位甲基或甲基化了的糖残基.810～870 cm-1表明多糖中有甘露糖.红外光谱数据与糖醛酸含量分析,与单糖组成分析结果一致.
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Fig.1 Gas chromatography of acetate derivatives
A—standard monosaccharides;B—products of hydrolysis of CMPS;1—Rha;2—Ara;3—Xyl;4—Man;5—Glc;6—Gal
Fig.2 Gas chromatographys of products of periodate oxidation/Smith degradation of CMPS
A—Standard；B—Sample；1—Gly;2—Ery;3—Rha;4—Xyl;5—Man;6—Glc;7—Gal
CMPS经过碘酸氧化,平均每摩尔脱水残基消耗85 mmol NaIO4.Smith降解产物有少量赤藓醇、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和大量的甘油.
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CMPS的过碘酸氧化、Smith 降解产物，经乙酰化后进行气相色谱分析，结果如图2所示.
4 讨论
综合上述分析结果：CMPS主要有1-2连接的Man残基，1-4或1-6连接的半乳糖残基，1-2分支的Gala,1-4连接的2或3位有分支的Glc残基或1-3连接的Glc残基.苷键构型主要为β型.目前对蛋白部分的连接方式还没有准确的测定方法.
从上述分析推测CMPS是含甘露半乳糖及半乳糖醛酸聚糖的糖蛋白.据文献〔7〕报道，细菌荚膜多糖一般由两部分组成，即具有各种聚合度的寡糖重复单位和非糖的取代基团.20世纪70年代初期，Troy等研究产气克氏杆菌(K.aeroyenes)的细胞外膜结构时，发现其荚膜多糖是半乳糖、甘露糖及糖醛酸等残基重复单位组成的多聚糖.但是荚膜多糖的化学结构是多样性的，显著地受到培养基的物理条件和营养条件的影响.荚膜多糖虽然不是细胞生长所必须的，但是对于细胞识别具有重要意义.根据本实验结果推断：主链可能主要为甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸的多聚糖链，另外寡糖链上还连有蛋白部分，显示CMPS很可能就是荚膜多糖.有关CMPS的进一步结构信息，需要通过甲基化物的GC-MS分析、部分酸水解、NMR光谱分析等加以确证.
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参考文献
1，赵永灵，王世林，李晓玉.兜唇石斛多糖的研究.云南植物研究，1994，1(4)：392～396
2，许益民，郭立伟，陈健伟.半枝莲多糖的分离、纯化及其理化性质.天然产物研究与开发，1992，4(1)：1～3
3，Kintner P K, Van Buren J P.Carbohydrate interference and it′s correction in dectin analysis using the m-hydroxydiphenyl method.J Food Sci，1982,47：756～759
4，Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G.New method for quantitative determination of uronic acids.Analy Biochem，1973,54：484～489
5，叶淳渠，方积年.竹黄多糖SB-Ⅰ及SB-Ⅱ的组成研究.药学学报，1981，16(7)：524～528
6，黄桂宽，李毅，谢荣仿.银杏叶多糖的分离纯化及鉴定.中国生化药物杂志,1996，17(4)：157～158
7，吴东儒.糖类的生物化学.北京：高等教育出版社：1987
收稿日期:2000-01-01, http://www.100md.com