壳多糖及其衍生物在动物细胞培养中应用研究进展
作者：王绪敏 刘万顺 贺君 陈西广 刘成圣 刘心同
单位：王绪敏 刘万顺 贺君 陈西广 刘成圣 刘心同(青岛海洋大学海洋生命学院生化室，青岛 266003)
关键词：壳多糖及其衍生物，细胞培养
中国海洋药物000512 摘 要 壳多糖作为一种碱性天然多糖，由于其无毒且具有良好的生物及组织相容性而备受人们的重视，本文综述了壳多糖及其衍生物作为细胞培养微载体材料、生物微胶囊材料、基因转移载体、细胞培养生物因子及作为药物吸收促进因子5个方面的研究进展。
THE ADVANCE OF APPLIED RESEARCH OF CHITOSAN AND ITS DERIVATIVES IN ANIMAL CELL CULTURE
Wang Xumin Liu Wanshun Huo Jun
, 百拇医药
(Ocean University of Qingdao,Qingdao 266003)
ABSTRACT As a cationic natural polysaccharide, chitosan has attracted much attention in the area of cell culture for its good biocompatibility, good histocompatility and little toxicity. In this paper, the progress of study of chitosan and its derivatives are reviewed for they are used in microcarrier, biomicroencapsulation, gene delivery system, biological factor and drug absorption enhancer.
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KEY WORDS Chitosan and its derivatives, Cell culture
细胞培养(Cell culture)是人工模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下培养单个细胞或细胞群，并使其存活和生长繁殖保持其结构或功能的方法。细胞培养被广泛用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作，也被用于生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品。壳多糖在近几年被广泛应用于细胞培养，这是由于壳多糖来源广泛、价格便宜、无毒、生物相容性好、可生物降解。并且壳多糖的单糖体上存在易于被修饰的O，N，所以经不同集团修饰可得到性质各不相同的衍生物，本文就近几年来壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究进展作以综述。
1 壳多糖(Chitosan)
甲壳质(Chitin)是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键形式连接而成的多糖，壳多糖是甲壳质经氨基上脱去乙酰基后得到的衍生物，壳多糖不能溶于水但能溶于低浓度无机酸或有机酸。壳多糖分子链上有许多游离氨基，在酸性溶液中能结合1个氢质子，而成为带正电荷的聚电解质。
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甲壳质和壳多糖的糖残基上带有羟基，能和各种酸及其衍生物酯化，从而获得各种有机、无机酸的酯类化合物，如：硫酸酯、磷酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯、氰乙酯等，这些酯类化合物有广泛的用途，例如：Wolfrom报道壳多糖硫酸酯的抗凝活性比肝素好。甲壳质和壳多糖的糖残基上的羟基可进行羟基化反应生成各种醚类，例如：甲基醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、羧甲基等，壳多糖的氨基属于一级氨基，氮上的氢比较活泼，能发生许多取代反应，例如：壳多糖在中性介质中与醛反应生成西佛碱；与羧酸酐高温下反应生成N-酰化衍生物，及获得N-烷基化产物等[1]。这些衍生物与壳多糖相比有了新的特性，此外细胞载体和医用生物功能新材料具有广阔的用途。
2 细胞培养载体
2.1 细胞培养微载体(microcarrier)
哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的主要方法之一，目前采用的微载体培养是一种工业化高密度培养动物细胞的有效体系[2]，根据生产所需生物制品的不同，选择不同种类的细胞，目前常用于微载体培养的细胞主要有杂交瘤细胞、CHO细胞、成纤维细胞、Vero细胞、BHK细胞等60多种[3]。用于动物细胞培养的微载体由传统的固体小颗粒微载体发展到现在的多孔微载体，多孔微载体用于高密度动物细胞培养是1985年由Verax公司开创的，最初用于流化床生物反应器生产单抗[4]。与传统微载体相比多孔微载体有许多优点[4]：(1)细胞容易固定，可以很好的培养贴壁依赖型动物细胞和悬浮细胞，可以使细胞在载体内部生长(2)保护细胞免受外界剪切力的损伤(3)适用于固定床、流化床、气升式及普通搅拌式等多种生物反应器(4)比表面积大，为细胞提供充分生长空间(5)可以长期固定培养细胞从而稳定获取细胞分泌产物。而细胞贴壁的好坏取决于微载体的材料，所以微载体材料的选择十分重要，通常把这些材料分成两大类：一类是非生物材料，包括塑料和玻璃等；另一类是生物材料，包括葡聚糖、琼脂糖以及纤连蛋白(fibronetin)、层粘连蛋白(laminin)等[5、6]。作为海洋生物材料的壳多糖，由于具有很好的粘连性、生物组织相容性以及无毒、可生物降解等优点[7、8]，近年来越来越多的被用于制备多孔微载体并用在动物细胞培养上。
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丁明等[8]利用液体石蜡作有机分散界质，甲醛、戊二醛作交联剂通过反向悬液交联法制备了微米级壳多糖微载体，可用于固定细胞。陈西广等利用自制壳多糖微载体培养Vero细胞发现，Vero细胞在壳多糖微载体上生长良好，Vero细胞在壳多糖载体上生长快、密度高，在1g*L-1微载体浓度条件下，培养Vero细胞120h，细胞密度每毫升可达7.15×105个，且具有良好形态。Kim等[9]用壳多糖/海藻酸钠微载体包埋杂交瘤细胞，取得了很好的实验结果，用它培养细胞密度可高于悬浮培养细胞密度两个数量级，产生的单抗浓度是悬浮培养的20倍。Scholz M等[10]利用卡拉胶/甲壳胺混合凝胶包埋动物细胞，并且在生物反应器上培养，由于卡拉胶/壳多糖包被细胞后，只允许小分子物质通过，而大分子物质不能通过，这样就便于收集生物反应器上所需的生物制品，Yagi K等[11]利用果糖修饰的壳多糖包裹的微载体悬浮培养鼠的肝脏细胞，肝脏细胞在微载体表面生长良好，且在4d培养过程中保持一些肝脏特有的功能。
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壳多糖资源丰富价格低，具有多种生物功能性和生物可降解性，因此壳多糖制备细胞培养多孔微载体将有广阔的应用前景。
2.2 生物微胶囊
生物微胶囊是利用半渗透性生物高分子薄膜固定活体组织或细胞的微型胶囊，有人把这种生物微胶囊叫做人工细胞。
1980年加拿大多伦多大学的F.Lim和A.Sun发明了海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊并用于包埋猪胰岛细胞取得成功，后来又包埋成功肝细胞[12]。但是这种微胶囊中聚赖氨酸价格较高而使成本提高，后来人们又发现来源广泛价格便宜的壳多糖也可和海藻酸钠混合用于包埋细胞。
孙多先等利用海藻酸纳-壳多糖-海藻酸钠对肝细胞进行包埋，微胶囊化的肝细胞在PPMI 1640培养液中保持活性，且能合成并释放低分子蛋白质，这种结构有利于肝细胞微胶囊植入体内后发挥功能而不被宿主免疫系统所排斥。用这种包埋材料还可以包埋胰腺胸腺和甲状腺等分泌腺细胞[12、13]。
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Matthew HW等[14]利用羧甲基纤维素、硫酸软骨素A、壳多糖、多聚半乳糖混合制得的微胶囊培养兔的肝细胞，结果证明这种微胶囊可以很好地支持肝脏内皮细胞，并且优于海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠制备的微胶囊。
Chandy T等[15]实验了海藻酸钠-壳多糖-聚乙二醇(PEG)微胶囊，应用扫描电镜检测发现它的机械稳定性和蛋白扩散性能良好，用此胶囊包埋血红细胞并观察血红蛋白的释放，没有溶血现象且稳定性和生物相容性很好。
聚乙烯醇/壳多糖生物微胶囊用于包埋细胞，可以允许代谢产物及其他小分子物质自由运输，Li RH等[17]成功运用这种生物微胶囊包埋PC12细胞，发现这种微胶囊可以改变细胞生长的微环境，从而提高了儿茶酚胺的分泌效率，并且由于微胶囊半径很小而提高其分散性。
Zielinski等[16]分别利用壳多糖微胶囊成功培养PC12，R208F和R208N.8细胞。
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以上说明利用壳多糖微胶囊可成功包埋培养胰脏细胞、肝脏细胞、PC12细胞等，这些在医学上有重要的价值。利用这项技术也可以制造人工器官，例如，利用包埋培养胰脏细胞壳多糖微胶囊生产胰岛素或移植到患者体内，可以治疗胰岛素依赖型糖尿病患者；PC12细胞可生产多巴胺，而帕金森氏(Parkinson's)病正是由于缺乏多巴胺。壳多糖是一种典型的PC12细胞生长基质，微胶囊化的细胞在体外可测得释放达到生理活性浓度达数月之久，所以用它来培养PC12细胞可用来生产多巴胺或用于移植到患者体内，而用于治疗帕金森氏病。
2.3 细胞生长骨架系统
Elcin等[18]报道，在修饰的壳多糖三维骨架上培养新鲜分离的胎猪肝细胞(FPH)并移植到小鼠身上，再经免疫组化分析，光镜及扫描电镜检测发现，FPH在壳多糖骨架上贴壁后形态学未发生变化，并且分泌肝细胞专一性细胞角蛋白。这是由于壳多糖的结构属糖胺聚糖，而糖胺聚糖在细胞贴壁、分化及形态发生过程中起着重要作用，所以壳多糖能很好的被细胞贴壁。
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Kawase等[19]用戊二醛交联壳多糖作肝细胞吸附的骨架系统，加上戊二醛交联后可以克服壳多糖凝胶发脆的缺点，肝细胞可很好的贴附于其表面，并保持类似于体内的圆形，经5d培养，仅能释放少量乳酸脱氢酶，并保持较高的脲合成的特性，表现出肝特有的功能。作为对照在胶原表面培养的肝细胞，其形状扁平，释放的乳酸脱氢酶多得多，脲合成的能力弱得多。这一结果表明肝细胞在戊二醛交联后的壳多糖微胶囊上能很好的生长，壳多糖作为肝细胞贴附骨架系统，可以用于人工肝脏的支持系统。
Lee YM, Park YJ等[20、21]制得壳多糖/磷酸三钙海绵，这种海绵是一种三维骨架系统，将分离培养的骨成纤维细胞接种于这种海绵上，培养56d，结果显示骨成纤维细胞的生长、分化良好，碱性磷酸酶活性高，矿物质沉积多，光学显微镜及电子显微镜检查均显示骨成纤维细胞在这种海绵基质上能很好的贴附、分化，壳多糖/磷酸三钙海绵可作为一种三维骨架材料用于骨再生位点的移植。在壳多糖海绵中加入血小板衍生生长因子，并在这种海绵上培养骨成纤维细胞，可很好的诱导新骨的生成。
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Sechriest VF等[22]用壳多糖和硫酸软骨素A混合制得的水凝胶，在其中接种上牛的关节软骨细胞，细胞能很好的贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，包括细胞呈圆形，有限的有丝分裂，能生成II型胶原及蛋白聚糖。这些结果证实硫酸软骨素A-壳多糖可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架。
Mariappan等[23]分别用卡拉胶、卡拉胶-壳多糖和卡拉胶-壳多糖硫酸酯作基质培养人皮肤成纤维细胞，并观察在这些材料上的贴附性，结果显示与非硫酸化的材料相比，硫酸化的壳多糖能更好的促进皮肤纤维细胞的贴附。
从以上研究可以知道壳多糖是一种很好的细胞生长的“脚手架”，可以用作人工器官的骨架。
2.4 用作细胞贴附剂
壳多糖做成的膜能耐碱，交联后还具有耐酸性，有很高的脱水率，有很高的机械强度，尤其是抗张强度，且不宜繁殖微生物，这也就扩大了它的使用范围，可用作反渗透膜，近年来主要是以壳多糖做成膜作为支持物用作细胞培养，谢大鹤等[24]以壳多糖膜进行原代培养鼠胚脊髓神经元，结果证明壳多糖膜和培养细胞之间有较强的相容性，能使神经元和胶原细胞比较充分的展示出多种组织结构的形态特点。壳多糖膜的组织相容性和可塑性使其在修复神经和神经移植中得到广泛应用。
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焦勇等[25]用甲壳质和壳多糖做成膜后培养雪旺氏细胞，培养7d后进行细胞计数，发现膜上雪旺氏细胞占94%，成纤维细胞占6%，而对照组分别为71%和29%，说明壳多糖对雪旺氏细胞有很好的组织相容性，而且可以抑制成纤维细胞的生长。
Chuang WY等[26]报道了用聚乙烯醇(PVA)/壳多糖混合膜体外培养成纤维细胞，并以扫描电镜观察，发现PVA/壳多糖在成膜过程中其表面及内部空间发生很多变化。以DSC分析发现PVA和壳多糖这两种多聚物之间相容性不太好，而用ESCA分析发现其膜表面富集了很多氮原子。这些都反映了PVA膜经壳多糖修饰，可影响混合膜的生物相容性。以混合膜培养成纤维细胞，用扫描电镜进行形态学分析，并以MTT法计数，发现PVA/壳多糖混合膜的细胞比单纯PVA膜更适于细胞生长，培养于PVA/壳多糖混合膜的细胞与单纯PVA膜细胞相比，能更好的扩散，更平整，更紧凑。这些结果都表明PVA/壳多糖混合膜可以促进细胞贴附和生长，PVA/壳多糖混合膜将是一种很有前途的细胞培养生物材料。
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Koyano T等[27]观察成纤维细胞在PVA/壳多糖混合水凝胶上的贴壁和生长情况，成纤维细胞在其上能很好的保持形态并增生。在含40%壳多糖的PVA水凝膜上生长和贴壁要优于PVA/卡拉胶(广泛应用于细胞培养的基质)。在壳多糖含量低的PVA/壳多糖混合凝胶上成纤维细胞为圆形，但当高于15%时，针形细胞随壳多糖成分增多而增加。
Elcin等[28]将鼠及胎猪肝脏细胞接种于卡拉胶、明胶、或白蛋白涂过的壳多糖膜上，检测脲生成量及分泌蛋白的量，结果显示鼠肝脏细胞在卡拉胶-壳多糖膜上吸附和生长良好，而胎猪肝脏细胞在白蛋白-壳多糖膜上可以至少存活14d。Eser Elcin A等[29]也利用几种膜培养牛嗜铬细胞，发现这种细胞在卡拉胶-壳多糖膜上至少能生长两周。Madihally SV等[30]利用阳离子的壳多糖固定多种糖胺多糖并做成膜培养CD34+白细胞。
3 转基因载体
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Alexakis等[31]将包埋有小牛胸腺DNA的壳多糖/海藻酸纳微胶囊通过管饲法注入小鼠体内，经检测小鼠粪便发现微胶囊通过小鼠消化系统吸收。表明：壳多糖/海藻酸纳微胶囊有一定强度，可用作DNA保护屏障。壳多糖可用作转基因载体不仅仅是由于壳多糖和细胞之间存在离子相互作用，而且壳多糖的糖骨架在转染过程也起非常重要作用。
Leong KW等[32]利用壳多糖微球做为转基因载体，DNA-微球大小在200～750nm间时可以转染各种细胞系，并且转染后β-半乳糖苷酶在BALB/C鼠肌肉中表达要高于用裸DNA和脂转染胺试剂(lipofectamine)复合物的效果，这种转基因系统显示出许多有吸引力的特征：(1)壳多糖微球与配体结合后能刺激受体介导的内吞作用 (2)壳多糖微球能够减少DNA在内吞体和溶酶体中的降解
(3)壳多糖微球能够将其他生物活性物质或很多种质粒包埋 (4)由于壳多糖骨架系统保护DNA不被核酸酶降解，从而提高DNA的生物利用率 (5)壳多糖微球可以用于低压冷冻干燥保存，而不减少其生物活性。
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Lee KY, Kwon IC等[33]制得壳多糖微球用做转基因系统，并用于转染COS-l细胞。
Erbacher P等[34]用荧光素酶基因和壳多糖的复合物转染HeLa细胞，这些复合物直径在50～100nm之间，转染后培养，在24～96h之间，基因的表达逐渐增加，且壳多糖介导的转染依赖于细胞的形态。Venkatesh S, Smith TJ等[35、36]也用壳多糖成功转染HeLa细胞。
Richardson等[37]利用低分子壳多糖作为DNA转移系统，分别使用高度纯化的3种分子量的壳多糖，N1样品MW<5000 Daldon,N2样品MW5000～10000 Dalton,N3样品MW>10000 Dalton,在培养CCRF-CEM，L132细胞过程中，都没有细胞毒性，也无溶血现象。并且它们都有与DNA混合的能力，保护DNA不被核酸酶降解能力随壳多糖分子量降低而增加。
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4 用作细胞生长生物因子
4.1 对细胞生长的抑制作用
早在1986年Sosuzuki等[38]就利用实验证明壳多糖及其衍生物有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。壳多糖具有直接抑制肿瘤细胞的作用。这是由于肿瘤细胞表面比正常细胞表面具有更多的负电荷，而壳多糖带阳离子电荷，从而抑制了肿瘤细胞的生长和转移。Sirica报道壳多糖对L1210白血病癌细胞有选择性聚集作用，而对正常骨细胞却无此作用。黄亦武等[39]用壳多糖用于成纤维细胞培养，发现壳多糖对人成纤维细胞有抑制作用。
Nishimura SI等[40]研究发现壳多糖的硫酸酯有抗HIV-l活性的功能，这是由于这些可溶性壳多糖衍生物是合成一系列硫酸多糖的非常有用的中间体，2-乙酰胺-2-脱氧3-0-磺基(1-4)-β-D-葡萄糖胺(3-S)和(1-4)-2-脱氧-2-硫酰胺-3-0-磺基-(1-4)-β-葡萄糖胺(2，3-S)，这些化合物具有：(1)在体外抑制HIV-l的复制 (2)抗凝血活性，实验结果显示2位氧和3位氧硫酸化的壳多糖在体外抑制艾滋病病毒的效率比6位氧硫酸衍生物的高，2，3-S在0.28g*L-1浓度条件下可以完全抑制艾滋病病毒感染，而且不显示任何的细胞毒性。就抗凝血活性而言6位的硫酸衍生物显示较强的抗凝血活性，而2位的硫酸衍生物和3位的硫酸衍生物几乎无抗凝血活性，这一结果显示不同类型的甲壳质硫酸酯对艾滋病病毒的抑制作用依赖于其硫酸化的位点的不同。
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Mori T, Okumura M等[41]使用甲壳质及其衍生物培养成纤维细胞，并观察了它们对成纤维细胞的分化及细胞因子生成量的影响。甲壳质及其衍生物对成纤维细胞无加速分化的影响，相反，D-葡萄糖胺在高浓度(500g*L-1)时培养L929成纤维细胞，无论在培养基中加或不加10%的小牛血清都能显著(P<0.05)降低L929或纤维细胞的分化。高浓度壳多糖在加了10%的小牛血清的培养基中能显著(P<0.05)降低L929成纤维细胞的分化率，而在不加小牛血清的培养基中培养时则无这种抑制现象。在原代培养小鼠皮肤成纤维细胞时，加入甲壳质及其衍生物能刺激诱导IL-8生成，这些实验结果证明甲壳质及其衍生物能间接抑制细胞分化。
Guminska等[42]实验研究了壳多糖对艾氏腹水瘤(EAT)细胞的抑制作用，发现无论对完整的EAT细胞或EAT细胞碎片，壳多糖都能削弱其糖酵解的作用，而壳多糖对于鼠正常肝脏及肌肉细胞则无抑制糖酵解的作用。壳多糖是通过抑制肿瘤细胞特殊变异的丙酮酸激酶来降低肿瘤细胞的糖酵解作用及ATP水平。
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Krause TJ等[43]实验证明N，O-羧甲基壳多糖(NOCC)对细胞分化有抑制作用。Sato M, Onishi H等[44]发现N-琥珀酰-壳多糖-谷氨酸-丝裂酶素C的混合体有十分强烈的抗癌细胞生长的作用。
陈西广、王真等[45]实验证明，6-0-羧甲基壳多糖(6-0-CM-Ch)可以明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长，且抑制作用随6-0-CM-Ch浓度增加而加强，小分子量6-0-CM-Ch对瘢痕疙瘩成纤维细胞抑制作用最强，且随时间增加抑制作用增强。
4.2 对细胞生长的促进作用
壳聚糖及其衍生物不仅能特异抑制某些细胞的生长，而且还可促进许多细胞的生长。刘万顺等[46、47]利用6-0-CM-Ch培养人胚胃成纤维细胞，实验结果表明，6-0-CM-Ch可明显促进成纤维细胞的生长。
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陈西广、王真等[45]用自制6-0-CM-Ch培养正常皮肤成纤维细胞，发现6-0-CM-Ch能促进正常皮肤成纤维细胞生长。
Hwang SW,Chen CY等[48]利用甲壳质及其衍生物对RAW264.7巨噬细胞的培养实验探讨了甲壳材料用于促伤口愈合及用作人造皮肤的机理，在伤口愈合的炎症反应中一氧化氮(NO)显示出对细胞增生的细胞毒性，而甲壳质及其衍生物可以通过对巨噬细胞的刺激作用而抑制NO的生成。分别做了甲南及其衍生物的实验发现，甲壳质和壳多糖具有较强的抑制NO产量的作用。
Mori T,Irie Y等[49]，用甲壳质及70%脱乙酰度的壳多糖的硫酸酯(S-DAC70)培养人的脐静脉上皮细胞(HUVECs)，发现S-DAC70可增加HUVECs对白细胞介素I-β，白细胞介素-6，白细胞介素-8以及肿瘤坏死因子(TNF)-2的生成量，而不能影响HUVECs的分化。Usami Y,Okamoto Y等[50]悬浮培养犬牙多形核细胞，并加入壳多糖和甲壳质，壳多糖和甲壳质可以刺激犬牙多形核细胞释放白三烯和前列腺素。
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Hoffman J等[51]研究发现壳多糖及甲壳寡糖在体外对头肾白细胞等有促生长作用，蛋白质-甲壳寡糖复合物对它们也有促进作用。脱乙酰度似乎与促进作用强弱无关，但高浓度80%脱乙酰度的壳多糖/甲壳寡糖则对白细胞有毒性作用。
Klokkevold PR等[52、53]用6孔培养板培养见充质干细胞，并加入2g*L-1的壳多糖0.2%醋酸溶液，结果显示壳多糖可以刺激骨原细胞的分化及骨的形成。
5 作为药物吸收促进因子
许多研究都证实壳多糖可用做药物跨粘膜运输释放的增强因子，Dodane V等[54]通过实验研究了壳多糖对上皮细胞通透性的影响，证明壳多糖是通过影响上皮细胞胞内及胞外通道来提高细胞的通透性。Kotze AF等[55]也利用两种壳多糖衍生物做了肠上皮细胞(Caco-2)细胞通透性及跨膜运输的实验研究，壳多糖盐酸盐、壳多糖谷氨酸盐(W/V0.5%～1.5%)在酸性条件下均可增进肠上皮细胞(Caco-2)的通透性且提高跨膜运输的能力。
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Schipper NG等[56]在细胞水平做了不同分子量、不同乙酰度的壳多糖对促进药物吸收及细胞毒性实验，他们培养单层肠上皮细胞(Caco-2)，分子量为31KD，乙酰度为1%的壳多糖显示剂量依赖性的吸收促进作用，但显示细胞毒性。而分子量为170KD，乙酰度为35%的壳多糖不显示剂量依赖性的吸收促进作用，也不显示细胞毒性。
N-三甲基壳多糖可以打开肠上皮细胞的粘连而促进物质的跨膜转运，Kotze AF等[57～59]研究不同季铵化度的N-三甲基壳多糖氯化物对肠上皮细胞(Caco-2)渗透性的影响，结果发现高季铵化度的产品(19.9%)比低季铵化度的产品(12.6%)在同样浓度下(1.5%～2.5%W/V)能更强刺激物质跨上皮转运，季铵化度是影响跨肠上皮细胞转运吸收增强因子能力的1个非常重要因素。
6 小结
近年来壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究有了很大的发展，由于壳多糖及其衍生物具有特殊性质，越来越多地引起科研人员的兴趣和关注。通过壳多糖微载体培养技术，可以规模生产生物制品；通过壳多糖的组织和细胞包埋技术，以解决医学上的某些疑难疾病的治疗；通过壳多糖制造的骨架材料以解决人工器官的制造问题；壳多糖及其衍生物对肿瘤细胞及HIV病毒有较强烈的抑制作用，使人们有可能从中找到较为理想的抗肿瘤抗艾滋病药物；壳多糖及其衍生物也能促进某些细胞的生长，所以壳多糖及其衍生物也将越来越多地被用作保健药品及化妆品；壳多糖及其衍生物可用作药物吸收促进因子；近年来也有报道称壳多糖有抗基因毒性的作用[60]。总之，壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究将会越来越引起重视，并且具有广阔的应用前景，是更好的开发利用壳多糖的有效途径。
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单位：王绪敏 刘万顺 贺君 陈西广 刘成圣 刘心同(青岛海洋大学海洋生命学院生化室，青岛 266003)
关键词：壳多糖及其衍生物，细胞培养
中国海洋药物000512 摘 要 壳多糖作为一种碱性天然多糖，由于其无毒且具有良好的生物及组织相容性而备受人们的重视，本文综述了壳多糖及其衍生物作为细胞培养微载体材料、生物微胶囊材料、基因转移载体、细胞培养生物因子及作为药物吸收促进因子5个方面的研究进展。
THE ADVANCE OF APPLIED RESEARCH OF CHITOSAN AND ITS DERIVATIVES IN ANIMAL CELL CULTURE
Wang Xumin Liu Wanshun Huo Jun
, 百拇医药
(Ocean University of Qingdao,Qingdao 266003)
ABSTRACT As a cationic natural polysaccharide, chitosan has attracted much attention in the area of cell culture for its good biocompatibility, good histocompatility and little toxicity. In this paper, the progress of study of chitosan and its derivatives are reviewed for they are used in microcarrier, biomicroencapsulation, gene delivery system, biological factor and drug absorption enhancer.
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KEY WORDS Chitosan and its derivatives, Cell culture
细胞培养(Cell culture)是人工模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下培养单个细胞或细胞群，并使其存活和生长繁殖保持其结构或功能的方法。细胞培养被广泛用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作，也被用于生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品。壳多糖在近几年被广泛应用于细胞培养，这是由于壳多糖来源广泛、价格便宜、无毒、生物相容性好、可生物降解。并且壳多糖的单糖体上存在易于被修饰的O，N，所以经不同集团修饰可得到性质各不相同的衍生物，本文就近几年来壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究进展作以综述。
1 壳多糖(Chitosan)
甲壳质(Chitin)是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键形式连接而成的多糖，壳多糖是甲壳质经氨基上脱去乙酰基后得到的衍生物，壳多糖不能溶于水但能溶于低浓度无机酸或有机酸。壳多糖分子链上有许多游离氨基，在酸性溶液中能结合1个氢质子，而成为带正电荷的聚电解质。
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甲壳质和壳多糖的糖残基上带有羟基，能和各种酸及其衍生物酯化，从而获得各种有机、无机酸的酯类化合物，如：硫酸酯、磷酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯、氰乙酯等，这些酯类化合物有广泛的用途，例如：Wolfrom报道壳多糖硫酸酯的抗凝活性比肝素好。甲壳质和壳多糖的糖残基上的羟基可进行羟基化反应生成各种醚类，例如：甲基醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、羧甲基等，壳多糖的氨基属于一级氨基，氮上的氢比较活泼，能发生许多取代反应，例如：壳多糖在中性介质中与醛反应生成西佛碱；与羧酸酐高温下反应生成N-酰化衍生物，及获得N-烷基化产物等[1]。这些衍生物与壳多糖相比有了新的特性，此外细胞载体和医用生物功能新材料具有广阔的用途。
2 细胞培养载体
2.1 细胞培养微载体(microcarrier)
哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的主要方法之一，目前采用的微载体培养是一种工业化高密度培养动物细胞的有效体系[2]，根据生产所需生物制品的不同，选择不同种类的细胞，目前常用于微载体培养的细胞主要有杂交瘤细胞、CHO细胞、成纤维细胞、Vero细胞、BHK细胞等60多种[3]。用于动物细胞培养的微载体由传统的固体小颗粒微载体发展到现在的多孔微载体，多孔微载体用于高密度动物细胞培养是1985年由Verax公司开创的，最初用于流化床生物反应器生产单抗[4]。与传统微载体相比多孔微载体有许多优点[4]：(1)细胞容易固定，可以很好的培养贴壁依赖型动物细胞和悬浮细胞，可以使细胞在载体内部生长(2)保护细胞免受外界剪切力的损伤(3)适用于固定床、流化床、气升式及普通搅拌式等多种生物反应器(4)比表面积大，为细胞提供充分生长空间(5)可以长期固定培养细胞从而稳定获取细胞分泌产物。而细胞贴壁的好坏取决于微载体的材料，所以微载体材料的选择十分重要，通常把这些材料分成两大类：一类是非生物材料，包括塑料和玻璃等；另一类是生物材料，包括葡聚糖、琼脂糖以及纤连蛋白(fibronetin)、层粘连蛋白(laminin)等[5、6]。作为海洋生物材料的壳多糖，由于具有很好的粘连性、生物组织相容性以及无毒、可生物降解等优点[7、8]，近年来越来越多的被用于制备多孔微载体并用在动物细胞培养上。
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丁明等[8]利用液体石蜡作有机分散界质，甲醛、戊二醛作交联剂通过反向悬液交联法制备了微米级壳多糖微载体，可用于固定细胞。陈西广等利用自制壳多糖微载体培养Vero细胞发现，Vero细胞在壳多糖微载体上生长良好，Vero细胞在壳多糖载体上生长快、密度高，在1g*L-1微载体浓度条件下，培养Vero细胞120h，细胞密度每毫升可达7.15×105个，且具有良好形态。Kim等[9]用壳多糖/海藻酸钠微载体包埋杂交瘤细胞，取得了很好的实验结果，用它培养细胞密度可高于悬浮培养细胞密度两个数量级，产生的单抗浓度是悬浮培养的20倍。Scholz M等[10]利用卡拉胶/甲壳胺混合凝胶包埋动物细胞，并且在生物反应器上培养，由于卡拉胶/壳多糖包被细胞后，只允许小分子物质通过，而大分子物质不能通过，这样就便于收集生物反应器上所需的生物制品，Yagi K等[11]利用果糖修饰的壳多糖包裹的微载体悬浮培养鼠的肝脏细胞，肝脏细胞在微载体表面生长良好，且在4d培养过程中保持一些肝脏特有的功能。
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壳多糖资源丰富价格低，具有多种生物功能性和生物可降解性，因此壳多糖制备细胞培养多孔微载体将有广阔的应用前景。
2.2 生物微胶囊
生物微胶囊是利用半渗透性生物高分子薄膜固定活体组织或细胞的微型胶囊，有人把这种生物微胶囊叫做人工细胞。
1980年加拿大多伦多大学的F.Lim和A.Sun发明了海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊并用于包埋猪胰岛细胞取得成功，后来又包埋成功肝细胞[12]。但是这种微胶囊中聚赖氨酸价格较高而使成本提高，后来人们又发现来源广泛价格便宜的壳多糖也可和海藻酸钠混合用于包埋细胞。
孙多先等利用海藻酸纳-壳多糖-海藻酸钠对肝细胞进行包埋，微胶囊化的肝细胞在PPMI 1640培养液中保持活性，且能合成并释放低分子蛋白质，这种结构有利于肝细胞微胶囊植入体内后发挥功能而不被宿主免疫系统所排斥。用这种包埋材料还可以包埋胰腺胸腺和甲状腺等分泌腺细胞[12、13]。
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Matthew HW等[14]利用羧甲基纤维素、硫酸软骨素A、壳多糖、多聚半乳糖混合制得的微胶囊培养兔的肝细胞，结果证明这种微胶囊可以很好地支持肝脏内皮细胞，并且优于海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠制备的微胶囊。
Chandy T等[15]实验了海藻酸钠-壳多糖-聚乙二醇(PEG)微胶囊，应用扫描电镜检测发现它的机械稳定性和蛋白扩散性能良好，用此胶囊包埋血红细胞并观察血红蛋白的释放，没有溶血现象且稳定性和生物相容性很好。
聚乙烯醇/壳多糖生物微胶囊用于包埋细胞，可以允许代谢产物及其他小分子物质自由运输，Li RH等[17]成功运用这种生物微胶囊包埋PC12细胞，发现这种微胶囊可以改变细胞生长的微环境，从而提高了儿茶酚胺的分泌效率，并且由于微胶囊半径很小而提高其分散性。
Zielinski等[16]分别利用壳多糖微胶囊成功培养PC12，R208F和R208N.8细胞。
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以上说明利用壳多糖微胶囊可成功包埋培养胰脏细胞、肝脏细胞、PC12细胞等，这些在医学上有重要的价值。利用这项技术也可以制造人工器官，例如，利用包埋培养胰脏细胞壳多糖微胶囊生产胰岛素或移植到患者体内，可以治疗胰岛素依赖型糖尿病患者；PC12细胞可生产多巴胺，而帕金森氏(Parkinson's)病正是由于缺乏多巴胺。壳多糖是一种典型的PC12细胞生长基质，微胶囊化的细胞在体外可测得释放达到生理活性浓度达数月之久，所以用它来培养PC12细胞可用来生产多巴胺或用于移植到患者体内，而用于治疗帕金森氏病。
2.3 细胞生长骨架系统
Elcin等[18]报道，在修饰的壳多糖三维骨架上培养新鲜分离的胎猪肝细胞(FPH)并移植到小鼠身上，再经免疫组化分析，光镜及扫描电镜检测发现，FPH在壳多糖骨架上贴壁后形态学未发生变化，并且分泌肝细胞专一性细胞角蛋白。这是由于壳多糖的结构属糖胺聚糖，而糖胺聚糖在细胞贴壁、分化及形态发生过程中起着重要作用，所以壳多糖能很好的被细胞贴壁。
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Kawase等[19]用戊二醛交联壳多糖作肝细胞吸附的骨架系统，加上戊二醛交联后可以克服壳多糖凝胶发脆的缺点，肝细胞可很好的贴附于其表面，并保持类似于体内的圆形，经5d培养，仅能释放少量乳酸脱氢酶，并保持较高的脲合成的特性，表现出肝特有的功能。作为对照在胶原表面培养的肝细胞，其形状扁平，释放的乳酸脱氢酶多得多，脲合成的能力弱得多。这一结果表明肝细胞在戊二醛交联后的壳多糖微胶囊上能很好的生长，壳多糖作为肝细胞贴附骨架系统，可以用于人工肝脏的支持系统。
Lee YM, Park YJ等[20、21]制得壳多糖/磷酸三钙海绵，这种海绵是一种三维骨架系统，将分离培养的骨成纤维细胞接种于这种海绵上，培养56d，结果显示骨成纤维细胞的生长、分化良好，碱性磷酸酶活性高，矿物质沉积多，光学显微镜及电子显微镜检查均显示骨成纤维细胞在这种海绵基质上能很好的贴附、分化，壳多糖/磷酸三钙海绵可作为一种三维骨架材料用于骨再生位点的移植。在壳多糖海绵中加入血小板衍生生长因子，并在这种海绵上培养骨成纤维细胞，可很好的诱导新骨的生成。
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Sechriest VF等[22]用壳多糖和硫酸软骨素A混合制得的水凝胶，在其中接种上牛的关节软骨细胞，细胞能很好的贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，包括细胞呈圆形，有限的有丝分裂，能生成II型胶原及蛋白聚糖。这些结果证实硫酸软骨素A-壳多糖可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架。
Mariappan等[23]分别用卡拉胶、卡拉胶-壳多糖和卡拉胶-壳多糖硫酸酯作基质培养人皮肤成纤维细胞，并观察在这些材料上的贴附性，结果显示与非硫酸化的材料相比，硫酸化的壳多糖能更好的促进皮肤纤维细胞的贴附。
从以上研究可以知道壳多糖是一种很好的细胞生长的“脚手架”，可以用作人工器官的骨架。
2.4 用作细胞贴附剂
壳多糖做成的膜能耐碱，交联后还具有耐酸性，有很高的脱水率，有很高的机械强度，尤其是抗张强度，且不宜繁殖微生物，这也就扩大了它的使用范围，可用作反渗透膜，近年来主要是以壳多糖做成膜作为支持物用作细胞培养，谢大鹤等[24]以壳多糖膜进行原代培养鼠胚脊髓神经元，结果证明壳多糖膜和培养细胞之间有较强的相容性，能使神经元和胶原细胞比较充分的展示出多种组织结构的形态特点。壳多糖膜的组织相容性和可塑性使其在修复神经和神经移植中得到广泛应用。
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焦勇等[25]用甲壳质和壳多糖做成膜后培养雪旺氏细胞，培养7d后进行细胞计数，发现膜上雪旺氏细胞占94%，成纤维细胞占6%，而对照组分别为71%和29%，说明壳多糖对雪旺氏细胞有很好的组织相容性，而且可以抑制成纤维细胞的生长。
Chuang WY等[26]报道了用聚乙烯醇(PVA)/壳多糖混合膜体外培养成纤维细胞，并以扫描电镜观察，发现PVA/壳多糖在成膜过程中其表面及内部空间发生很多变化。以DSC分析发现PVA和壳多糖这两种多聚物之间相容性不太好，而用ESCA分析发现其膜表面富集了很多氮原子。这些都反映了PVA膜经壳多糖修饰，可影响混合膜的生物相容性。以混合膜培养成纤维细胞，用扫描电镜进行形态学分析，并以MTT法计数，发现PVA/壳多糖混合膜的细胞比单纯PVA膜更适于细胞生长，培养于PVA/壳多糖混合膜的细胞与单纯PVA膜细胞相比，能更好的扩散，更平整，更紧凑。这些结果都表明PVA/壳多糖混合膜可以促进细胞贴附和生长，PVA/壳多糖混合膜将是一种很有前途的细胞培养生物材料。
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Koyano T等[27]观察成纤维细胞在PVA/壳多糖混合水凝胶上的贴壁和生长情况，成纤维细胞在其上能很好的保持形态并增生。在含40%壳多糖的PVA水凝膜上生长和贴壁要优于PVA/卡拉胶(广泛应用于细胞培养的基质)。在壳多糖含量低的PVA/壳多糖混合凝胶上成纤维细胞为圆形，但当高于15%时，针形细胞随壳多糖成分增多而增加。
Elcin等[28]将鼠及胎猪肝脏细胞接种于卡拉胶、明胶、或白蛋白涂过的壳多糖膜上，检测脲生成量及分泌蛋白的量，结果显示鼠肝脏细胞在卡拉胶-壳多糖膜上吸附和生长良好，而胎猪肝脏细胞在白蛋白-壳多糖膜上可以至少存活14d。Eser Elcin A等[29]也利用几种膜培养牛嗜铬细胞，发现这种细胞在卡拉胶-壳多糖膜上至少能生长两周。Madihally SV等[30]利用阳离子的壳多糖固定多种糖胺多糖并做成膜培养CD34+白细胞。
3 转基因载体
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Alexakis等[31]将包埋有小牛胸腺DNA的壳多糖/海藻酸纳微胶囊通过管饲法注入小鼠体内，经检测小鼠粪便发现微胶囊通过小鼠消化系统吸收。表明：壳多糖/海藻酸纳微胶囊有一定强度，可用作DNA保护屏障。壳多糖可用作转基因载体不仅仅是由于壳多糖和细胞之间存在离子相互作用，而且壳多糖的糖骨架在转染过程也起非常重要作用。
Leong KW等[32]利用壳多糖微球做为转基因载体，DNA-微球大小在200～750nm间时可以转染各种细胞系，并且转染后β-半乳糖苷酶在BALB/C鼠肌肉中表达要高于用裸DNA和脂转染胺试剂(lipofectamine)复合物的效果，这种转基因系统显示出许多有吸引力的特征：(1)壳多糖微球与配体结合后能刺激受体介导的内吞作用 (2)壳多糖微球能够减少DNA在内吞体和溶酶体中的降解
(3)壳多糖微球能够将其他生物活性物质或很多种质粒包埋 (4)由于壳多糖骨架系统保护DNA不被核酸酶降解，从而提高DNA的生物利用率 (5)壳多糖微球可以用于低压冷冻干燥保存，而不减少其生物活性。
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Lee KY, Kwon IC等[33]制得壳多糖微球用做转基因系统，并用于转染COS-l细胞。
Erbacher P等[34]用荧光素酶基因和壳多糖的复合物转染HeLa细胞，这些复合物直径在50～100nm之间，转染后培养，在24～96h之间，基因的表达逐渐增加，且壳多糖介导的转染依赖于细胞的形态。Venkatesh S, Smith TJ等[35、36]也用壳多糖成功转染HeLa细胞。
Richardson等[37]利用低分子壳多糖作为DNA转移系统，分别使用高度纯化的3种分子量的壳多糖，N1样品MW<5000 Daldon,N2样品MW5000～10000 Dalton,N3样品MW>10000 Dalton,在培养CCRF-CEM，L132细胞过程中，都没有细胞毒性，也无溶血现象。并且它们都有与DNA混合的能力，保护DNA不被核酸酶降解能力随壳多糖分子量降低而增加。
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4 用作细胞生长生物因子
4.1 对细胞生长的抑制作用
早在1986年Sosuzuki等[38]就利用实验证明壳多糖及其衍生物有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。壳多糖具有直接抑制肿瘤细胞的作用。这是由于肿瘤细胞表面比正常细胞表面具有更多的负电荷，而壳多糖带阳离子电荷，从而抑制了肿瘤细胞的生长和转移。Sirica报道壳多糖对L1210白血病癌细胞有选择性聚集作用，而对正常骨细胞却无此作用。黄亦武等[39]用壳多糖用于成纤维细胞培养，发现壳多糖对人成纤维细胞有抑制作用。
Nishimura SI等[40]研究发现壳多糖的硫酸酯有抗HIV-l活性的功能，这是由于这些可溶性壳多糖衍生物是合成一系列硫酸多糖的非常有用的中间体，2-乙酰胺-2-脱氧3-0-磺基(1-4)-β-D-葡萄糖胺(3-S)和(1-4)-2-脱氧-2-硫酰胺-3-0-磺基-(1-4)-β-葡萄糖胺(2，3-S)，这些化合物具有：(1)在体外抑制HIV-l的复制 (2)抗凝血活性，实验结果显示2位氧和3位氧硫酸化的壳多糖在体外抑制艾滋病病毒的效率比6位氧硫酸衍生物的高，2，3-S在0.28g*L-1浓度条件下可以完全抑制艾滋病病毒感染，而且不显示任何的细胞毒性。就抗凝血活性而言6位的硫酸衍生物显示较强的抗凝血活性，而2位的硫酸衍生物和3位的硫酸衍生物几乎无抗凝血活性，这一结果显示不同类型的甲壳质硫酸酯对艾滋病病毒的抑制作用依赖于其硫酸化的位点的不同。
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Mori T, Okumura M等[41]使用甲壳质及其衍生物培养成纤维细胞，并观察了它们对成纤维细胞的分化及细胞因子生成量的影响。甲壳质及其衍生物对成纤维细胞无加速分化的影响，相反，D-葡萄糖胺在高浓度(500g*L-1)时培养L929成纤维细胞，无论在培养基中加或不加10%的小牛血清都能显著(P<0.05)降低L929或纤维细胞的分化。高浓度壳多糖在加了10%的小牛血清的培养基中能显著(P<0.05)降低L929成纤维细胞的分化率，而在不加小牛血清的培养基中培养时则无这种抑制现象。在原代培养小鼠皮肤成纤维细胞时，加入甲壳质及其衍生物能刺激诱导IL-8生成，这些实验结果证明甲壳质及其衍生物能间接抑制细胞分化。
Guminska等[42]实验研究了壳多糖对艾氏腹水瘤(EAT)细胞的抑制作用，发现无论对完整的EAT细胞或EAT细胞碎片，壳多糖都能削弱其糖酵解的作用，而壳多糖对于鼠正常肝脏及肌肉细胞则无抑制糖酵解的作用。壳多糖是通过抑制肿瘤细胞特殊变异的丙酮酸激酶来降低肿瘤细胞的糖酵解作用及ATP水平。
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Krause TJ等[43]实验证明N，O-羧甲基壳多糖(NOCC)对细胞分化有抑制作用。Sato M, Onishi H等[44]发现N-琥珀酰-壳多糖-谷氨酸-丝裂酶素C的混合体有十分强烈的抗癌细胞生长的作用。
陈西广、王真等[45]实验证明，6-0-羧甲基壳多糖(6-0-CM-Ch)可以明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长，且抑制作用随6-0-CM-Ch浓度增加而加强，小分子量6-0-CM-Ch对瘢痕疙瘩成纤维细胞抑制作用最强，且随时间增加抑制作用增强。
4.2 对细胞生长的促进作用
壳聚糖及其衍生物不仅能特异抑制某些细胞的生长，而且还可促进许多细胞的生长。刘万顺等[46、47]利用6-0-CM-Ch培养人胚胃成纤维细胞，实验结果表明，6-0-CM-Ch可明显促进成纤维细胞的生长。
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陈西广、王真等[45]用自制6-0-CM-Ch培养正常皮肤成纤维细胞，发现6-0-CM-Ch能促进正常皮肤成纤维细胞生长。
Hwang SW,Chen CY等[48]利用甲壳质及其衍生物对RAW264.7巨噬细胞的培养实验探讨了甲壳材料用于促伤口愈合及用作人造皮肤的机理，在伤口愈合的炎症反应中一氧化氮(NO)显示出对细胞增生的细胞毒性，而甲壳质及其衍生物可以通过对巨噬细胞的刺激作用而抑制NO的生成。分别做了甲南及其衍生物的实验发现，甲壳质和壳多糖具有较强的抑制NO产量的作用。
Mori T,Irie Y等[49]，用甲壳质及70%脱乙酰度的壳多糖的硫酸酯(S-DAC70)培养人的脐静脉上皮细胞(HUVECs)，发现S-DAC70可增加HUVECs对白细胞介素I-β，白细胞介素-6，白细胞介素-8以及肿瘤坏死因子(TNF)-2的生成量，而不能影响HUVECs的分化。Usami Y,Okamoto Y等[50]悬浮培养犬牙多形核细胞，并加入壳多糖和甲壳质，壳多糖和甲壳质可以刺激犬牙多形核细胞释放白三烯和前列腺素。
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Hoffman J等[51]研究发现壳多糖及甲壳寡糖在体外对头肾白细胞等有促生长作用，蛋白质-甲壳寡糖复合物对它们也有促进作用。脱乙酰度似乎与促进作用强弱无关，但高浓度80%脱乙酰度的壳多糖/甲壳寡糖则对白细胞有毒性作用。
Klokkevold PR等[52、53]用6孔培养板培养见充质干细胞，并加入2g*L-1的壳多糖0.2%醋酸溶液，结果显示壳多糖可以刺激骨原细胞的分化及骨的形成。
5 作为药物吸收促进因子
许多研究都证实壳多糖可用做药物跨粘膜运输释放的增强因子，Dodane V等[54]通过实验研究了壳多糖对上皮细胞通透性的影响，证明壳多糖是通过影响上皮细胞胞内及胞外通道来提高细胞的通透性。Kotze AF等[55]也利用两种壳多糖衍生物做了肠上皮细胞(Caco-2)细胞通透性及跨膜运输的实验研究，壳多糖盐酸盐、壳多糖谷氨酸盐(W/V0.5%～1.5%)在酸性条件下均可增进肠上皮细胞(Caco-2)的通透性且提高跨膜运输的能力。
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Schipper NG等[56]在细胞水平做了不同分子量、不同乙酰度的壳多糖对促进药物吸收及细胞毒性实验，他们培养单层肠上皮细胞(Caco-2)，分子量为31KD，乙酰度为1%的壳多糖显示剂量依赖性的吸收促进作用，但显示细胞毒性。而分子量为170KD，乙酰度为35%的壳多糖不显示剂量依赖性的吸收促进作用，也不显示细胞毒性。
N-三甲基壳多糖可以打开肠上皮细胞的粘连而促进物质的跨膜转运，Kotze AF等[57～59]研究不同季铵化度的N-三甲基壳多糖氯化物对肠上皮细胞(Caco-2)渗透性的影响，结果发现高季铵化度的产品(19.9%)比低季铵化度的产品(12.6%)在同样浓度下(1.5%～2.5%W/V)能更强刺激物质跨上皮转运，季铵化度是影响跨肠上皮细胞转运吸收增强因子能力的1个非常重要因素。
6 小结
近年来壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究有了很大的发展，由于壳多糖及其衍生物具有特殊性质，越来越多地引起科研人员的兴趣和关注。通过壳多糖微载体培养技术，可以规模生产生物制品；通过壳多糖的组织和细胞包埋技术，以解决医学上的某些疑难疾病的治疗；通过壳多糖制造的骨架材料以解决人工器官的制造问题；壳多糖及其衍生物对肿瘤细胞及HIV病毒有较强烈的抑制作用，使人们有可能从中找到较为理想的抗肿瘤抗艾滋病药物；壳多糖及其衍生物也能促进某些细胞的生长，所以壳多糖及其衍生物也将越来越多地被用作保健药品及化妆品；壳多糖及其衍生物可用作药物吸收促进因子；近年来也有报道称壳多糖有抗基因毒性的作用[60]。总之，壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究将会越来越引起重视，并且具有广阔的应用前景，是更好的开发利用壳多糖的有效途径。
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