全身辐射对小鼠小肠上皮内淋巴细胞功能影响的实验研究
徐辉 程天民 粟永萍 林远
摘要 目的：探讨辐射对粘膜免疫的影响。方法：小鼠全身照射，吸收剂量为3、8、12Gy，然后分离培养全小肠上皮内淋巴细胞(IEL)，并对其数量、细胞增殖活力、细胞毒力、TNF-α和TGF-β分泌水平进行检测。结果：①全身照射后使IEL数量减少，3种剂量均呈现出伤后8小时下降，48～72小时达最低值，7天回升，至15天尚未恢复正常水平；各剂量组间差异无显著性，但8Gy组较3Gy组恢复慢，12Gy组未待回升动物已死亡；②全身照射后IEL功能受抑，表现为增殖活力和细胞毒力下降，其变化过程和数量减少相一致；③全身照射后IEL分泌TNF-α和TGF-β增多，也呈现为8小时升高，48～72小时达高峰，15天仍未下降至正常值的过程。结论：放射损伤导致IEL数量减少及功能降低，造成肠粘膜免疫功能的下降，从而共同导致肠道屏障功能的削弱。
关键词：辐射 粘膜免疫 小肠上皮内淋巴细胞
, 百拇医药 肠粘膜免疫是肠屏障的关键环节，它由肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissues,简称GALT)构成，包括Peyer's patches(PP)\,肠系膜淋巴结和散在于固有层和上皮层内的淋巴细胞。在GALT中，上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,简称IEL)是整个免疫系统中与肠腔抗原最接近的免疫细胞，同时IEL和上皮细胞毗邻，与肠上皮细胞间存在双向的免疫生理调节，这使其在粘膜免疫中发挥着独特的作用[1]。包括放射损伤在内的多类损伤和粘膜疾病都能够引起粘膜免疫功能的损害，导致肠源性感染的发生。目前有关放射损伤时小肠粘膜免疫功能状态的变化还不清楚。本研究以小鼠3种剂量全身辐射为模型，了解射线对IEL的数量和功能的影响。
材料和方法
1.动物分组及照射：由本校动物中心提供的健康昆明种小鼠，体重20～25g，随机分为对照组，3、8、12Gy照射组。小鼠装入特制的有机玻璃盒内，放在距源心1.5米处，用60Coγ射线进行一次性全身照射，吸收剂量率0.589Gy/min。照后自由进水、食。各剂量组分别于照后8小时、1、2、3、7和15天共6个时相点活杀，取全小肠。
, 百拇医药
2.小肠IEL计数[2]：HE染色的小肠横截面在光镜下观察，计数整个横截面绒毛及隐窝上皮细胞数，同时计数其间的IEL数，取百分比，即IEL/100个肠上皮细胞。
3.小鼠全小肠IEL的分离培养：参照Mosley法[3]并加以改进，主要分三个步骤进行，即分离肠组织、粘膜层细胞的分离、将IEL从肠上皮细胞中分离。按上述方法分离正常小鼠全小肠IEL，并用RPMI 1640调为2×106/ml的细胞悬液。
4.IEL增殖活力和细胞毒力的检测[4,5]：将2×106/ml IEL 100μl加入96孔平底培养板内，重复三孔，rhIL-2 2 500U/ml+PMA 5ng/ml刺激培养，每孔总体积200μl。在37℃ 5% CO2孵箱内培养72小时，培养结束前18小时每孔加入3.7×104Bq3H-TdR，对照组不加刺激物。用多头细胞样品收集器将细胞收集到49号玻璃纤维滤膜上，80 ℃烤干30分钟，放入闪烁瓶，加5 ml闪烁液，稳定过夜后，用液闪仪测每分钟计数(.min-1)。结果以每孔每分钟计数来表示IEL受刺激后的增殖活力。
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将各组分离的IEL调整到2×106/ml后加入Anti-CD3(1μg/ml)诱导培养48小时。在96孔平底培养板上每孔加靶细胞100μl(含Raji细胞1×104个/孔)，按效靶比(10～50)：1的比例加100μl IEL细胞悬液，重复三孔。加完将培养板放在37℃ 5% CO2培养箱中孵育4.5小时，最大释放孔加入100μl含2% Triton X-100的培养基，自发释放孔加入100μl培养基代替。反应结束后，培养板在250g离心10分钟将细胞沉淀，每孔吸上清100μl转入另一96孔板中，采用LDH测定来反映细胞毒力，LDH试剂盒购自宝灵曼公司，按说明书操作。
5.IEL培养上清内TNF-α和TGF-β含量的测定：同时收集(PMA 5ng+rhIL-2 2 500U/ml)刺激培养后72小时的培养上清，离心后装入EP管，作好标记，封口胶封口，-70℃冰箱保存，用于细胞因子检测。TNF-α含量测定采用ELISA试剂盒(军事医学科学院产品)，按说明书进行。TGF-β含量的检测采用CCL-64细胞生长抑制法[6]。
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6.统计学分析：所有数据均以平均数±标准差表示，以t检验进行统计学处理。
结果
1.小肠IEL计数的变化
表1显示放射损伤后小鼠小肠粘膜IEL计数呈明显的下降趋势。3Gy组照后8小时即下降，与正常对照值相比较，2天下降为59.00%(P<0.05)，3天达低值为正常对照值的49.23%(P<0.05)，照后15天尚未完全恢复正常。8Gy组照后8小时出现下降，3天达最低值为41.18%(P<0.01)，IEL计数的低水平一直持续到第15天。12Gy组照后8小时亦下降，1天降为55.56%(P<0.05)，2天为43.29%(P<0.01)，3天因肠粘膜上皮细胞坏死脱落严重，粘膜层不完整不能准确计数。与3Gy组比，伤后1天12Gy组明显降低(P<0.05)，7和15天8Gy组明显降低(P<0.05)。
表1 小鼠受照射后不同时间小肠粘膜IELs数量的变化[(x±s)个IEL/100个肠上皮细胞]
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照后时间
(d)
3Gy照后计数
%
8Gy照后计数
%
12Gy照后计数
%
8h
4.24±0.36
79.88
3.72±0.44
70.11
, 百拇医药
3.86±0.33
72.99
1
3.73±0.41
70.31
3.98±0.37
74.90
2.95±0.17*#
55.56
2
3.13±0.22*
59.00
, 百拇医药
2.45±0.21*
46.17
2.30±0.36**
43.29
3
2.61±0.37*
49.23
2.19±0.25**
41.18
—
—
, http://www.100md.com
7
3.90±0.19
73.37
2.28±0.16**#
42.91
—
—
15
4.16±0.21
78.35
2.85±0.16*#
53.63
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—
—
注：1.每组动物数5只，对照组正常值5.31±0.98(100%,n=10)
2.与对照组比：*P<0.05, **P<0.01;与3Gy组比：#P<0.05
2. IEL增殖活力的变化
3种剂量照射后IEL的增殖活性受到抑制的变化规律基本一致，都表现为先下降后缓慢回升的过程。伤后8小时即有下降，随后继续下降，3Gy和8Gy组伤后3天为最低值，7天显示回升，其中3Gy组照后15天接近正常值水平，而8Gy组仍低于正常值(P<0.05)。12Gy组伤后2天为最低值(见表2)。
表2 3种剂量全身照射IELs增殖活力和细胞毒活力的变化
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照后时间
(d)
增殖活力(.min-1)
细胞毒力(特异性释放%)
3Gy
8Gy
12Gy
3Gy
8Gy
12Gy
8h
33 293±2 813
, 百拇医药
28 806±1 016*
26 562±1 394*
37.34±9.14
32.98±6.98
33.65±7.52
1
26 578±2 147*
26 164±1 355**
16 784±1 030**
22.75±8.65**
, 百拇医药
21.71±9.43**
18.65±9.61**
2
24 228±1 673*
16 257±2 267**
11 298±1 694**
19.52±9.07**
22.66±10.08**
17.36±8.93**
, 百拇医药
3
10 545±1 289**
7 685±746**
—
11.81±5.78**
13.48±8.54**
—
7
26 545±995*
24 842±1 375*
, 百拇医药 —
21.12±10.21**
18.47±10.47**
—
15
30 536±804
28 255±1 393*
—
28.21±9.38*
24.24±9.04**
—
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注：正常IELs增殖活力为36 308±3 353(n=10)；正常IELs细胞毒为46.85±7.61(n=10,效靶比20∶1);其余各组n=5
3. IEL细胞毒力的变化
小鼠受3种剂量照射后IEL的细胞毒活力受到明显抑制，由表2可见，在受照后1天即出现显著性下降，3Gy和8Gy组持续到3天达最低值，此后有所回升，但15天仍未恢复到对照值。12Gy组伤后2天为最低值。各剂量组之间比较，差异无显著性。结果表明整体照射引起IEL细胞毒活力受到抑制，但抑制的程度与受照剂量并不相关。
4. 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TNF-α含量的变化
对受3种剂量照射后培养上清内TNF-α含量检测的结果表明，3种剂量照射后IEL培养上清中TNF-α和TGF-β含量都有明显增高。从表3看出，IEL培养上清中TNF-α的含量伤后8小时即有增高，3Gy和8Gy组持续到3天达最高，到15天仍未恢复到对照值。3Gy组3天增高为对照值的5倍，15天仍为4倍。8Gy组3天增高为7倍，15天为4.5倍，12Gy组2天为3倍。组间比较发现，8Gy组3天IEL培养上清中TNF-α含量显著高于3Gy组(P<0.05)。
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表3 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TNF-α和TGF-β含量的变化(ng/ml)
照后时间
(d)
TNF-α含量
TGF-β含量
3Gy
8Gy
12Gy
3Gy
8Gy
12Gy
8h
, 百拇医药
2.09±0.42**
2.74±0.38**
2.23±0.47**
0.86±0.12
1.30±0.49*
1.55±0.72**
1
2.88±0.27**
3.04±0.48**
2.06±0.30**
, 百拇医药
1.22±0.23*
1.96±0.35**
2.68±0.63**#
2
3.56±0.43**
4.32±0.36**
3.21±0.30**
1.64±0.37**
2.45±0.47**
, 百拇医药 3.24±0.41**#
3
4.57±0.39**
6.54±0.29**#
—
2.97±0.84**
3.22±0.61**
—
7
3.91±0.24**
5.04±0.85**
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—
2.03±0.69**
3.04±0.42**
—
15
4.01±0.62**
4.27±0.69**
—
1.86±0.32**
2.21±0.34**
—
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注：1.正常小鼠分离IELs培养上清中TNF-α浓度为(0.97±0.16)ng/ml(n=8),正常小鼠分离IELs培养上清内TGF-β浓度为(0.68±0.19)ng/ml (n=8);其余各组n=5； 2.与对照组比：*P<0.05,**P<0.01; 与3Gy组比：#P<0.05
5. 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TGF-β含量的变化
从表3看出，IEL培养上清中TGF-β的含量伤后8小时即有增高，3Gy和8Gy组持续到3天达最高，到15天仍未恢复到对照值。3Gy组3天增高为对照值的4倍，15天仍为3倍。8Gy组3天增高为5倍，15天为3倍。12Gy组伤后2天为5倍。3种剂量组间比较发现，12Gy组伤后1天和2天IEL培养上清中TGF-β含量显著高于3Gy组(P<0.05)，但与8Gy组相比差异无显著性。
, 百拇医药 讨论
本实验设计3种照射剂量，拟分别代表中度、重度骨髓型和轻度肠型放射病，小鼠受照后的全身状况、外周血变化和肠粘膜病变等方面，均表明符合所预想的伤情。
肠道不仅是消化器官，同时又是淋巴细胞含量最多的脏器。肠上皮细胞和淋巴细胞均为辐射敏感细胞。IEL来源于骨髓造血干细胞和小肠集合淋巴集结的淋巴细胞前体[7]，肠粘膜内IEL数量减少，可由于来源减少和在上皮层内破坏两方面因素所引起。IEL数量减少，虽有12Gy组>8Gy组>3Gy组的总体趋势，但减少程度与受照剂量并不完全相关。
IEL具有两方面的功能，一是受各种刺激后发生增殖并引发细胞因子的分泌，通过细胞因子起作用；二是通过其自身的细胞毒性作用保护粘膜免受病原菌的侵害[8]。目前尚未见到整体照射对IEL功能影响的研究报道。淋巴细胞的增殖能力是其功能的重要表现形式，T细胞受有丝分裂原、细菌抗原等刺激发生增殖反应，并分化为效应细胞的过程多伴随着细胞因子的分泌。IEL的细胞毒作用是其抗感染的重要手段之一，细胞毒性功能的下降会导致IEL对抗外来细菌、病毒和抗原入侵的能力下降。本实验发现，3种全身辐射引起IEL增殖活力和细胞毒力的明显下降，都表现出照后8小时下降，2～3天达最低值，表明射线引起IEL增殖和细胞毒能力的抑制。
, 百拇医药
T细胞在增殖过程中能够分泌多种细胞因子，这些细胞因子是T细胞免疫生理调节功能得以实施的物质基础。射线损伤引起IEL细胞因子分泌的改变，必然会影响到粘膜免疫状态以及对肠上皮细胞的生理调节功能。在本实验中观察到3种剂量全身辐射引起小鼠小肠IEL培养上清中TNF-α和TGF-β因子分泌增多，以伤后2～3天达高峰。IEL能够分泌多种细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α和TGF-β等，这些细胞因子可以起多种作用，归结为两个方面：第一，作用于粘膜免疫系统，刺激淋巴细胞的增殖并指导B细胞的分化，尤其是sIgA的合成和装配；第二，作用于肠上皮细胞，调节其增殖和分化以及MHC-II的表达，并能够影响肠上皮细胞的生理特性以及吸收、转运功能[9]，TGF-β刺激肠上皮细胞分泌IL-6,IL-6是吸引淋巴细胞向上皮层移居的趋化因子[10]，另有文献报道TGF-β可以上调IEL细胞表面αEβ7分子表达，而αEβ7是淋巴细胞进入上皮层的关键粘附分子[11]，由此推测放射损伤后IEL培养上清中TGF-β增多可能是一种自身的补偿作用，籍以吸引淋巴细胞向上皮层移居，以改善射线造成的IEL减少。关于TNF-α对肠粘膜免疫影响的研究目前还不多，有待继续深入。
, 百拇医药
从实验结果发现，数量及功能(增殖活力和细胞毒力)的变化都有着相似的趋势，即以受照后8小时下降，持续至2～3天达最低值，随后缓慢回升。提示放射损伤造成IEL数量减少、结构破坏与其功能受抑有着内在的紧密联系。
IEL数量的减少，必然会导致肠上皮IEL整体功能的削弱，从而影响肠粘膜免疫功能。因此，受照后IEL数量减少和功能受损是全身放射损伤时肠粘膜免疫功能削弱的重要原因之一。
本课题受全军“九五”指令性攻关课题基金资助(项目号：96L045)
作者单位：400038 重庆，第三军医大学预防医学系
参考文献
[1]Allan M, Joanne LV.The anatomical basis of intestinal immunity.Immunol Rev，1997,156:145-166.
, 百拇医药
[2]Ferguson A,Murray D.Quantitation of intraepithelial lymphocytes in human jejunum.Gut,1971,12:988.
[3]Mosley RL,Klein JR.A rapid method for isolating murine intestinal intraepithelial lymphocytes with high yield and purity.J Immunol Methods,1992,156:19.
[4]徐辉，程天民，粟永萍.放射损伤小鼠小肠上皮内淋巴细胞增殖活力变化的实验研究.第三军医大学学报，1998，20：187-190.
[5]Guy-Grand D,Malassis-Seris M,Briottet C,et al.Cytotoxic differentiation of mousegut thymodependent and independent intraepithelial T lymphocytes is induced locally:correlation between functional assays,presence of perforin andgranzyme transcripts,and cytoplasmicgranules.J Exp Med,1991,173:1549-1552.
, http://www.100md.com
[6]虞冠华，许祥裕，丁树标.转化生长因子-β的测定.上海免疫学杂志，1995，12：116-118.
[7]Klein JR.Whence the intestinal intraepithelial lymphocyte? J Exp Med,1996,184:1203-1206.
[8]Guy-Grand D,Cuenod-Jabri B,Malassis-Seris M,et al.Complexity of the mousegut T cell immune system:indentification of two distinct natural killer T cell intraepithelial lineages.Eur J Immunol,1996,26:2248-2256.
[9]Guy-Grand D,Vassalli P.Gut intraepithelial T lymphocytes.Curr Opin Immunol,1993,5:247-252.
, http://www.100md.com
[10]McGee DW,Beagley KW,Aicher WK,et al.Transforminggrowth factor-β and IL-1 β act in synergy to enhance IL-6 secretion by the intestinal epithelial cell line,IEC-6. J Immunol,1993,151:970-978.
[11]Park CM,Cepek KL,RussellgJ,et al.A family of β7 integrins on human mucosal lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:1924-1928., 百拇医药
摘要 目的：探讨辐射对粘膜免疫的影响。方法：小鼠全身照射，吸收剂量为3、8、12Gy，然后分离培养全小肠上皮内淋巴细胞(IEL)，并对其数量、细胞增殖活力、细胞毒力、TNF-α和TGF-β分泌水平进行检测。结果：①全身照射后使IEL数量减少，3种剂量均呈现出伤后8小时下降，48～72小时达最低值，7天回升，至15天尚未恢复正常水平；各剂量组间差异无显著性，但8Gy组较3Gy组恢复慢，12Gy组未待回升动物已死亡；②全身照射后IEL功能受抑，表现为增殖活力和细胞毒力下降，其变化过程和数量减少相一致；③全身照射后IEL分泌TNF-α和TGF-β增多，也呈现为8小时升高，48～72小时达高峰，15天仍未下降至正常值的过程。结论：放射损伤导致IEL数量减少及功能降低，造成肠粘膜免疫功能的下降，从而共同导致肠道屏障功能的削弱。
关键词：辐射 粘膜免疫 小肠上皮内淋巴细胞
, 百拇医药 肠粘膜免疫是肠屏障的关键环节，它由肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissues,简称GALT)构成，包括Peyer's patches(PP)\,肠系膜淋巴结和散在于固有层和上皮层内的淋巴细胞。在GALT中，上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,简称IEL)是整个免疫系统中与肠腔抗原最接近的免疫细胞，同时IEL和上皮细胞毗邻，与肠上皮细胞间存在双向的免疫生理调节，这使其在粘膜免疫中发挥着独特的作用[1]。包括放射损伤在内的多类损伤和粘膜疾病都能够引起粘膜免疫功能的损害，导致肠源性感染的发生。目前有关放射损伤时小肠粘膜免疫功能状态的变化还不清楚。本研究以小鼠3种剂量全身辐射为模型，了解射线对IEL的数量和功能的影响。
材料和方法
1.动物分组及照射：由本校动物中心提供的健康昆明种小鼠，体重20～25g，随机分为对照组，3、8、12Gy照射组。小鼠装入特制的有机玻璃盒内，放在距源心1.5米处，用60Coγ射线进行一次性全身照射，吸收剂量率0.589Gy/min。照后自由进水、食。各剂量组分别于照后8小时、1、2、3、7和15天共6个时相点活杀，取全小肠。
, 百拇医药
2.小肠IEL计数[2]：HE染色的小肠横截面在光镜下观察，计数整个横截面绒毛及隐窝上皮细胞数，同时计数其间的IEL数，取百分比，即IEL/100个肠上皮细胞。
3.小鼠全小肠IEL的分离培养：参照Mosley法[3]并加以改进，主要分三个步骤进行，即分离肠组织、粘膜层细胞的分离、将IEL从肠上皮细胞中分离。按上述方法分离正常小鼠全小肠IEL，并用RPMI 1640调为2×106/ml的细胞悬液。
4.IEL增殖活力和细胞毒力的检测[4,5]：将2×106/ml IEL 100μl加入96孔平底培养板内，重复三孔，rhIL-2 2 500U/ml+PMA 5ng/ml刺激培养，每孔总体积200μl。在37℃ 5% CO2孵箱内培养72小时，培养结束前18小时每孔加入3.7×104Bq3H-TdR，对照组不加刺激物。用多头细胞样品收集器将细胞收集到49号玻璃纤维滤膜上，80 ℃烤干30分钟，放入闪烁瓶，加5 ml闪烁液，稳定过夜后，用液闪仪测每分钟计数(.min-1)。结果以每孔每分钟计数来表示IEL受刺激后的增殖活力。
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将各组分离的IEL调整到2×106/ml后加入Anti-CD3(1μg/ml)诱导培养48小时。在96孔平底培养板上每孔加靶细胞100μl(含Raji细胞1×104个/孔)，按效靶比(10～50)：1的比例加100μl IEL细胞悬液，重复三孔。加完将培养板放在37℃ 5% CO2培养箱中孵育4.5小时，最大释放孔加入100μl含2% Triton X-100的培养基，自发释放孔加入100μl培养基代替。反应结束后，培养板在250g离心10分钟将细胞沉淀，每孔吸上清100μl转入另一96孔板中，采用LDH测定来反映细胞毒力，LDH试剂盒购自宝灵曼公司，按说明书操作。
5.IEL培养上清内TNF-α和TGF-β含量的测定：同时收集(PMA 5ng+rhIL-2 2 500U/ml)刺激培养后72小时的培养上清，离心后装入EP管，作好标记，封口胶封口，-70℃冰箱保存，用于细胞因子检测。TNF-α含量测定采用ELISA试剂盒(军事医学科学院产品)，按说明书进行。TGF-β含量的检测采用CCL-64细胞生长抑制法[6]。
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6.统计学分析：所有数据均以平均数±标准差表示，以t检验进行统计学处理。
结果
1.小肠IEL计数的变化
表1显示放射损伤后小鼠小肠粘膜IEL计数呈明显的下降趋势。3Gy组照后8小时即下降，与正常对照值相比较，2天下降为59.00%(P<0.05)，3天达低值为正常对照值的49.23%(P<0.05)，照后15天尚未完全恢复正常。8Gy组照后8小时出现下降，3天达最低值为41.18%(P<0.01)，IEL计数的低水平一直持续到第15天。12Gy组照后8小时亦下降，1天降为55.56%(P<0.05)，2天为43.29%(P<0.01)，3天因肠粘膜上皮细胞坏死脱落严重，粘膜层不完整不能准确计数。与3Gy组比，伤后1天12Gy组明显降低(P<0.05)，7和15天8Gy组明显降低(P<0.05)。
表1 小鼠受照射后不同时间小肠粘膜IELs数量的变化[(x±s)个IEL/100个肠上皮细胞]
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照后时间
(d)
3Gy照后计数
%
8Gy照后计数
%
12Gy照后计数
%
8h
4.24±0.36
79.88
3.72±0.44
70.11
, 百拇医药
3.86±0.33
72.99
1
3.73±0.41
70.31
3.98±0.37
74.90
2.95±0.17*#
55.56
2
3.13±0.22*
59.00
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2.45±0.21*
46.17
2.30±0.36**
43.29
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2.61±0.37*
49.23
2.19±0.25**
41.18
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3.90±0.19
73.37
2.28±0.16**#
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4.16±0.21
78.35
2.85±0.16*#
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注：1.每组动物数5只，对照组正常值5.31±0.98(100%,n=10)
2.与对照组比：*P<0.05, **P<0.01;与3Gy组比：#P<0.05
2. IEL增殖活力的变化
3种剂量照射后IEL的增殖活性受到抑制的变化规律基本一致，都表现为先下降后缓慢回升的过程。伤后8小时即有下降，随后继续下降，3Gy和8Gy组伤后3天为最低值，7天显示回升，其中3Gy组照后15天接近正常值水平，而8Gy组仍低于正常值(P<0.05)。12Gy组伤后2天为最低值(见表2)。
表2 3种剂量全身照射IELs增殖活力和细胞毒活力的变化
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照后时间
(d)
增殖活力(.min-1)
细胞毒力(特异性释放%)
3Gy
8Gy
12Gy
3Gy
8Gy
12Gy
8h
33 293±2 813
, 百拇医药
28 806±1 016*
26 562±1 394*
37.34±9.14
32.98±6.98
33.65±7.52
1
26 578±2 147*
26 164±1 355**
16 784±1 030**
22.75±8.65**
, 百拇医药
21.71±9.43**
18.65±9.61**
2
24 228±1 673*
16 257±2 267**
11 298±1 694**
19.52±9.07**
22.66±10.08**
17.36±8.93**
, 百拇医药
3
10 545±1 289**
7 685±746**
—
11.81±5.78**
13.48±8.54**
—
7
26 545±995*
24 842±1 375*
, 百拇医药 —
21.12±10.21**
18.47±10.47**
—
15
30 536±804
28 255±1 393*
—
28.21±9.38*
24.24±9.04**
—
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注：正常IELs增殖活力为36 308±3 353(n=10)；正常IELs细胞毒为46.85±7.61(n=10,效靶比20∶1);其余各组n=5
3. IEL细胞毒力的变化
小鼠受3种剂量照射后IEL的细胞毒活力受到明显抑制，由表2可见，在受照后1天即出现显著性下降，3Gy和8Gy组持续到3天达最低值，此后有所回升，但15天仍未恢复到对照值。12Gy组伤后2天为最低值。各剂量组之间比较，差异无显著性。结果表明整体照射引起IEL细胞毒活力受到抑制，但抑制的程度与受照剂量并不相关。
4. 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TNF-α含量的变化
对受3种剂量照射后培养上清内TNF-α含量检测的结果表明，3种剂量照射后IEL培养上清中TNF-α和TGF-β含量都有明显增高。从表3看出，IEL培养上清中TNF-α的含量伤后8小时即有增高，3Gy和8Gy组持续到3天达最高，到15天仍未恢复到对照值。3Gy组3天增高为对照值的5倍，15天仍为4倍。8Gy组3天增高为7倍，15天为4.5倍，12Gy组2天为3倍。组间比较发现，8Gy组3天IEL培养上清中TNF-α含量显著高于3Gy组(P<0.05)。
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表3 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TNF-α和TGF-β含量的变化(ng/ml)
照后时间
(d)
TNF-α含量
TGF-β含量
3Gy
8Gy
12Gy
3Gy
8Gy
12Gy
8h
, 百拇医药
2.09±0.42**
2.74±0.38**
2.23±0.47**
0.86±0.12
1.30±0.49*
1.55±0.72**
1
2.88±0.27**
3.04±0.48**
2.06±0.30**
, 百拇医药
1.22±0.23*
1.96±0.35**
2.68±0.63**#
2
3.56±0.43**
4.32±0.36**
3.21±0.30**
1.64±0.37**
2.45±0.47**
, 百拇医药 3.24±0.41**#
3
4.57±0.39**
6.54±0.29**#
—
2.97±0.84**
3.22±0.61**
—
7
3.91±0.24**
5.04±0.85**
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—
2.03±0.69**
3.04±0.42**
—
15
4.01±0.62**
4.27±0.69**
—
1.86±0.32**
2.21±0.34**
—
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注：1.正常小鼠分离IELs培养上清中TNF-α浓度为(0.97±0.16)ng/ml(n=8),正常小鼠分离IELs培养上清内TGF-β浓度为(0.68±0.19)ng/ml (n=8);其余各组n=5； 2.与对照组比：*P<0.05,**P<0.01; 与3Gy组比：#P<0.05
5. 3种剂量全身照射后IEL培养上清中TGF-β含量的变化
从表3看出，IEL培养上清中TGF-β的含量伤后8小时即有增高，3Gy和8Gy组持续到3天达最高，到15天仍未恢复到对照值。3Gy组3天增高为对照值的4倍，15天仍为3倍。8Gy组3天增高为5倍，15天为3倍。12Gy组伤后2天为5倍。3种剂量组间比较发现，12Gy组伤后1天和2天IEL培养上清中TGF-β含量显著高于3Gy组(P<0.05)，但与8Gy组相比差异无显著性。
, 百拇医药 讨论
本实验设计3种照射剂量，拟分别代表中度、重度骨髓型和轻度肠型放射病，小鼠受照后的全身状况、外周血变化和肠粘膜病变等方面，均表明符合所预想的伤情。
肠道不仅是消化器官，同时又是淋巴细胞含量最多的脏器。肠上皮细胞和淋巴细胞均为辐射敏感细胞。IEL来源于骨髓造血干细胞和小肠集合淋巴集结的淋巴细胞前体[7]，肠粘膜内IEL数量减少，可由于来源减少和在上皮层内破坏两方面因素所引起。IEL数量减少，虽有12Gy组>8Gy组>3Gy组的总体趋势，但减少程度与受照剂量并不完全相关。
IEL具有两方面的功能，一是受各种刺激后发生增殖并引发细胞因子的分泌，通过细胞因子起作用；二是通过其自身的细胞毒性作用保护粘膜免受病原菌的侵害[8]。目前尚未见到整体照射对IEL功能影响的研究报道。淋巴细胞的增殖能力是其功能的重要表现形式，T细胞受有丝分裂原、细菌抗原等刺激发生增殖反应，并分化为效应细胞的过程多伴随着细胞因子的分泌。IEL的细胞毒作用是其抗感染的重要手段之一，细胞毒性功能的下降会导致IEL对抗外来细菌、病毒和抗原入侵的能力下降。本实验发现，3种全身辐射引起IEL增殖活力和细胞毒力的明显下降，都表现出照后8小时下降，2～3天达最低值，表明射线引起IEL增殖和细胞毒能力的抑制。
, 百拇医药
T细胞在增殖过程中能够分泌多种细胞因子，这些细胞因子是T细胞免疫生理调节功能得以实施的物质基础。射线损伤引起IEL细胞因子分泌的改变，必然会影响到粘膜免疫状态以及对肠上皮细胞的生理调节功能。在本实验中观察到3种剂量全身辐射引起小鼠小肠IEL培养上清中TNF-α和TGF-β因子分泌增多，以伤后2～3天达高峰。IEL能够分泌多种细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α和TGF-β等，这些细胞因子可以起多种作用，归结为两个方面：第一，作用于粘膜免疫系统，刺激淋巴细胞的增殖并指导B细胞的分化，尤其是sIgA的合成和装配；第二，作用于肠上皮细胞，调节其增殖和分化以及MHC-II的表达，并能够影响肠上皮细胞的生理特性以及吸收、转运功能[9]，TGF-β刺激肠上皮细胞分泌IL-6,IL-6是吸引淋巴细胞向上皮层移居的趋化因子[10]，另有文献报道TGF-β可以上调IEL细胞表面αEβ7分子表达，而αEβ7是淋巴细胞进入上皮层的关键粘附分子[11]，由此推测放射损伤后IEL培养上清中TGF-β增多可能是一种自身的补偿作用，籍以吸引淋巴细胞向上皮层移居，以改善射线造成的IEL减少。关于TNF-α对肠粘膜免疫影响的研究目前还不多，有待继续深入。
, 百拇医药
从实验结果发现，数量及功能(增殖活力和细胞毒力)的变化都有着相似的趋势，即以受照后8小时下降，持续至2～3天达最低值，随后缓慢回升。提示放射损伤造成IEL数量减少、结构破坏与其功能受抑有着内在的紧密联系。
IEL数量的减少，必然会导致肠上皮IEL整体功能的削弱，从而影响肠粘膜免疫功能。因此，受照后IEL数量减少和功能受损是全身放射损伤时肠粘膜免疫功能削弱的重要原因之一。
本课题受全军“九五”指令性攻关课题基金资助(项目号：96L045)
作者单位：400038 重庆，第三军医大学预防医学系
参考文献
[1]Allan M, Joanne LV.The anatomical basis of intestinal immunity.Immunol Rev，1997,156:145-166.
, 百拇医药
[2]Ferguson A,Murray D.Quantitation of intraepithelial lymphocytes in human jejunum.Gut,1971,12:988.
[3]Mosley RL,Klein JR.A rapid method for isolating murine intestinal intraepithelial lymphocytes with high yield and purity.J Immunol Methods,1992,156:19.
[4]徐辉，程天民，粟永萍.放射损伤小鼠小肠上皮内淋巴细胞增殖活力变化的实验研究.第三军医大学学报，1998，20：187-190.
[5]Guy-Grand D,Malassis-Seris M,Briottet C,et al.Cytotoxic differentiation of mousegut thymodependent and independent intraepithelial T lymphocytes is induced locally:correlation between functional assays,presence of perforin andgranzyme transcripts,and cytoplasmicgranules.J Exp Med,1991,173:1549-1552.
, http://www.100md.com
[6]虞冠华，许祥裕，丁树标.转化生长因子-β的测定.上海免疫学杂志，1995，12：116-118.
[7]Klein JR.Whence the intestinal intraepithelial lymphocyte? J Exp Med,1996,184:1203-1206.
[8]Guy-Grand D,Cuenod-Jabri B,Malassis-Seris M,et al.Complexity of the mousegut T cell immune system:indentification of two distinct natural killer T cell intraepithelial lineages.Eur J Immunol,1996,26:2248-2256.
[9]Guy-Grand D,Vassalli P.Gut intraepithelial T lymphocytes.Curr Opin Immunol,1993,5:247-252.
, http://www.100md.com
[10]McGee DW,Beagley KW,Aicher WK,et al.Transforminggrowth factor-β and IL-1 β act in synergy to enhance IL-6 secretion by the intestinal epithelial cell line,IEC-6. J Immunol,1993,151:970-978.
[11]Park CM,Cepek KL,RussellgJ,et al.A family of β7 integrins on human mucosal lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:1924-1928., 百拇医药