体外长期培养人转化角朊细胞系的生物学特征
苏映军 陈璧 贾赤宇 汤朝武
摘 要 目的: 研究SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外长期培养过程中的细胞生物学特征. 方法：采用细胞培养法观察转化细胞系的克隆形成率、细胞生命曲线以及血清、Ca2+对其生长分化的影响. 结果：与正常角朊细胞相比，转化角朊细胞系于体外形成克隆所需的最低接种密度有所降低，但接触抑制特性仍未丧失. 转化细胞在体外已传代培养25代，对血清的依赖性降低，可被Ca2+诱导分化而形成细胞膜片结构. 结论：本研究所观察的转化细胞系可在体外长期传代培养，并保留了正常角朊细胞的部分生物学特征，该细胞系在创面修复研究中具有一定价值.
关键词:角朊细胞系 细胞培养 SV40病毒 人
0 引言
皮肤角朊细胞体外培养时对培养环境要求较高，且长期传代培养困难. 为研究需要，国外一些学者曾采用多种病毒基因转化细胞的方法，获得了可长期传代培养的角朊细胞系. 在转化过程中，由于外源性基因整合至宿主细胞染色体的位点的不同，在所获得的角朊细胞系中有些致瘤性极底或无致瘤性，在创面修复研究中具有重要价值. 为此，我们采用SV40病毒体外转化细胞的方法，获得了可长期培养的角朊细胞，经过筛选，得到了长期培养后对裸鼠无致瘤性的细胞系，为了创面移植的需要，我们对其体外生长的特性进行了观察.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人角朊细胞无血清培养基K-SFM，不含添加剂的人角朊细胞无血清基础培养基KBM，DMEM培养基均购自Gibco公司，小牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料研究所.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 复苏冻存的转化角朊细胞，以K-SFM接种于培养瓶中，24 h后换液，之后每2 d～3 d更换一次培养液. 正常人角朊细胞培养按照我室常规方法进行[1]. 鳞癌细胞系VX-2细胞采用K-SFM培养.
1.2.2 细胞体外生长密度依赖性及细胞克隆形成率 将第2代正常人角朊细胞、第24代转化角朊细胞及VX-2细胞按照10, 102, 103, 104个细胞/cm2的密度接种于培养瓶内培养，倒置显微镜下定期观察并记录各培养瓶内30个视野中含有10个以上细胞的细胞克隆数, 根据以下公式计算克隆形成率.
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1.2.3 细胞生命曲线 将第2代正常人角朊细胞、第4代转化角朊细胞按照3×105个/瓶的密度接种于底面积为24 cm2的培养瓶中，待细胞生长至70%～80%融合程度时以1.25 g/L胰酶溶液(含1 g/L十二烷基磺酸钠)消化、计数，再以同样的细胞接种密度接种细胞于培养瓶内，继续传代培养. 以细胞培养代数为横坐标，消化得到的细胞数为纵坐标作图并分析细胞增殖状况.
1.2.4 转化细胞体外生长对血清的依赖性 第2代正常人包皮角朊细胞和第24代转化角朊细胞以2×103/孔的细胞密度接种于96孔培养板，各种细胞分别采用含20, 50和100 mL/L血清的DMEM培养，每日换液，培养5 d后以噻唑蓝呈色法[2]测定各孔A值，比较细胞的增殖率.
1.2.5 Ca2+对转化细胞体外分化的影响 正常角朊细胞及第24代转化角朊细胞在33 mm直径的培养皿中以K-SFM培养至完全融合后，将每种细胞的培养皿分为两组，一组继续以K-SFM培养，另一组培养基内加入CaCl2溶液致Ca2+终浓度为1.8 mmol/L. 4 d后，弃培养基，各培养皿内加入2 g/L中性蛋白酶溶液1 mL，37℃条件下作用15 min，揭下已形成的角朊细胞膜片，经固定、包埋、切片并常规HE染色，光镜下观察.
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实验数据进行方差分析，P<0.05为显著性差异界限.
2 结果
2.1 可形成细胞克隆的最低接种密度 第2代正常人包皮角朊细胞在大于103细胞/cm2接种密度下可形成克隆，人转化角朊细胞和VX-2细胞分别要求大于102和10细胞/cm2接种密度方可形成细胞克隆. 但是，正常角朊细胞和转化角朊细胞在体外培养条件下形成稳定细胞克隆的最佳接种密度分别是104和103细胞/cm2，而且在最佳接种密度下，两种细胞的克隆形成率无明显差别(Tab 1). VX-2鳞癌细胞在低接种密度条件下(10细胞/cm2)仍具有较高的细胞克隆形成率，显著高于转化细胞的克隆形成率(P<0.05). 但是，VX-2与正常和转化角朊细胞的细胞克隆镜下形态不同，VX-2克隆细胞排列致密，并有明显复层细胞，尤其克隆中央区域最为显著. 正常和转化角朊细胞克隆在K-SMF培养条件下形成单层生长的细胞克隆，无细胞复层现象.
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表 1 细胞接种密度对克隆形成率(%)的影响
Tab 1 Influence of seeding density of cells on colony formation rate
(n=3, x±s)
Seeding density (cell/cm2)
Cell type
10
102
103
104
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Normal
0
0
1.5±0.7
17.1±5.1
Transformed (passage 24)
0
1.0±0.4
25.8±10.1e
19.7±8.2
VX-2
43.3±12.9ac
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64.3±16.7ac
36.1±6.6ac
31.8±10.9ac
aP<0.05 vs normal of 104 cells/cm2; cP<0.05 vs transformed of 103 cells/cm2; eP<0.05 vs normal of 103 cells/cm2. 2.2 体外培养人包皮角朊细胞生长情况 角朊细胞接种后以K-SFM培养，可继续增殖6代～10代，之后细胞逐渐老化，失去生长能力. 本研究分离得到的原代角朊细胞混有许多老化细胞和其它类型的细胞，经换液去出后，剩余细胞为贴壁生长的表皮基底层细胞，具有良好的增殖分化能力. 为研究该层角朊细胞的增殖能力，我们选用含角朊细胞纯度较高的第2代细胞接种并传代培养，根据细胞计数可推算出各代所获细胞数(Fig 1)，至第8代时所获细胞平均数达峰值，细胞倍增数约为32次. 转化后的角朊细胞在体外具有长期增殖的能力，已传代培养达25代，经推算，倍增次数约为88次. 转化细胞在25代以内，无明显的“危机期”出现，呈持续稳定增殖状态.
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2.3 细胞的增殖率 两种细胞的增殖对FCS的依赖性不同(Fig 2), 20 mL/L和50mL/L的FCS对正常角朊细胞的促增殖作用较弱，而100 mL/L的FCS可明显促进其增殖(P<0.05). 转化细胞在20 mL/L的FCS作用下，增殖率较低，而FCS浓度增加到50 mL/L时可明显促进转化细胞的增殖(P<0.05). 提示转化角朊细胞的增殖对血清的依赖性降低.
2.4 Ca2+对角朊细胞分化生长的影响 完全融合后的正常角朊细胞和转化角朊细胞以K-SFM继续培养，细胞不能持续生长，不能形成复层细胞结构，也无法形成角朊细胞膜片. 而在含有1.8 mmol/L Ca2+的培养基中培养的正常角朊细胞和转化角朊细胞均可发生进一步的细胞分化、复层，并形成完整的角朊细胞膜片. 光镜下见正常角朊细胞膜片大部分区域形成3层结构(Fig 3A)，下层及中层内含有扁平状、排列紧密的角朊细胞，上层细胞成分较少，类似表皮角质层结构. 转化细胞膜片大部分区域形成2层细胞结构，底层为扁平状的角朊细胞，上层为核成分较少的角质层结构(Fig 3B).
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图 1 正常人角朊细胞和转化人角朊细胞的生长曲线
Fig 1 Growth curve of normal human keratinocytes and transformed human keratinocytes
图 2 血清对正常和转化角朊细胞生长的影响
Fig 2 Influence of serum on the growth of normal and transformed keratinocytes
图 3 正常人角朊细胞(A)和转化角朊细胞(B)膜片形态
Fig 3 Morphology of normal keratinocyte (A) and transformed keratinocyte (B) sheets HE ×400
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3 讨论
通过基因转化细胞技术可以建立能够长期体外培养的多种组织来源的细胞系[3]，为体外研究工作提供便利. 我们观察的SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外已培养25代，明显高于常规连续培养6代～10代的水平，且增殖较稳定，在血清依赖性、克隆形成率等方面表现出转化细胞特有的生物学特征.
组织培养细胞和体内组织细胞相似, 生长过程中细胞间具有群体依赖性(population dependence, PD)的特征[4]. 角朊细胞在体外培养时需要一定的接种密度方可良好地分裂增殖，形成细胞克隆，各克隆逐渐扩大而最终导致细胞完全融合成片[5]. 从反映细胞体外增殖活力的克隆形成率这一指标来看，正常人角朊细胞在大于103细胞/cm2接种密度时形成细胞克隆，克隆形成率远远低于VX-2细胞，但经过SV40病毒转化后的角朊细胞在102细胞/cm2接种密度时便可形成细胞克隆，说明转化使角朊细胞分裂增殖的群体依赖性降低. 同时，本研究显示正常和所转化细胞间最大克隆形成率无明显差别，反映出所观察的转化细胞与正常角朊细胞中具备体外增殖活力的细胞比例基本一致. 此外，就形态学观察而言，在一定的培养条件下，正常角朊细胞可分化形成3层细胞结构[1,6]，这是创面移植应用的结构基础. 而我们获得的转化角朊细胞在体外也可分化形成类似结构，这就为将其应用于创面修复的研究创造了有利条件.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目 No.39570718
作者简介:苏映军, 男, 1965-02-01生, 广西南宁人, 汉族, 1989年第四军医大学毕业, 现任西京医院烧伤科主治医师, 博士生，发表论文12篇. 导师:陈璧教授. Tel：(029)3375570 Fax：(029)3251734 E-mail burns@fmmu.edu.cn
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
1 陈 璧, 汤朝武. 人表皮细胞培养增殖的动态观察. 中华整形烧伤外科杂志, 1989;5(4):279-280
2 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Meth, 1989;119(2):203-210
, 百拇医药
3 Katakura Y, Alam S, Shirahata S. Immortalization by gene transfection. Methods Cell Biol, 1998; 57(1): 69-91
4 鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 第2版. 北京: 北京出版社, 1997:24-26
5 汤朝武, 陈 璧. 人表皮细胞悬液点状接种原代培养法. 中华实验外科杂志, 1990;7(3):136-137
6 Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975;6(3):331-344, 百拇医药
摘 要 目的: 研究SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外长期培养过程中的细胞生物学特征. 方法：采用细胞培养法观察转化细胞系的克隆形成率、细胞生命曲线以及血清、Ca2+对其生长分化的影响. 结果：与正常角朊细胞相比，转化角朊细胞系于体外形成克隆所需的最低接种密度有所降低，但接触抑制特性仍未丧失. 转化细胞在体外已传代培养25代，对血清的依赖性降低，可被Ca2+诱导分化而形成细胞膜片结构. 结论：本研究所观察的转化细胞系可在体外长期传代培养，并保留了正常角朊细胞的部分生物学特征，该细胞系在创面修复研究中具有一定价值.
关键词:角朊细胞系 细胞培养 SV40病毒 人
0 引言
皮肤角朊细胞体外培养时对培养环境要求较高，且长期传代培养困难. 为研究需要，国外一些学者曾采用多种病毒基因转化细胞的方法，获得了可长期传代培养的角朊细胞系. 在转化过程中，由于外源性基因整合至宿主细胞染色体的位点的不同，在所获得的角朊细胞系中有些致瘤性极底或无致瘤性，在创面修复研究中具有重要价值. 为此，我们采用SV40病毒体外转化细胞的方法，获得了可长期培养的角朊细胞，经过筛选，得到了长期培养后对裸鼠无致瘤性的细胞系，为了创面移植的需要，我们对其体外生长的特性进行了观察.
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1 材料和方法
1.1 材料 人角朊细胞无血清培养基K-SFM，不含添加剂的人角朊细胞无血清基础培养基KBM，DMEM培养基均购自Gibco公司，小牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料研究所.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 复苏冻存的转化角朊细胞，以K-SFM接种于培养瓶中，24 h后换液，之后每2 d～3 d更换一次培养液. 正常人角朊细胞培养按照我室常规方法进行[1]. 鳞癌细胞系VX-2细胞采用K-SFM培养.
1.2.2 细胞体外生长密度依赖性及细胞克隆形成率 将第2代正常人角朊细胞、第24代转化角朊细胞及VX-2细胞按照10, 102, 103, 104个细胞/cm2的密度接种于培养瓶内培养，倒置显微镜下定期观察并记录各培养瓶内30个视野中含有10个以上细胞的细胞克隆数, 根据以下公式计算克隆形成率.
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1.2.3 细胞生命曲线 将第2代正常人角朊细胞、第4代转化角朊细胞按照3×105个/瓶的密度接种于底面积为24 cm2的培养瓶中，待细胞生长至70%～80%融合程度时以1.25 g/L胰酶溶液(含1 g/L十二烷基磺酸钠)消化、计数，再以同样的细胞接种密度接种细胞于培养瓶内，继续传代培养. 以细胞培养代数为横坐标，消化得到的细胞数为纵坐标作图并分析细胞增殖状况.
1.2.4 转化细胞体外生长对血清的依赖性 第2代正常人包皮角朊细胞和第24代转化角朊细胞以2×103/孔的细胞密度接种于96孔培养板，各种细胞分别采用含20, 50和100 mL/L血清的DMEM培养，每日换液，培养5 d后以噻唑蓝呈色法[2]测定各孔A值，比较细胞的增殖率.
1.2.5 Ca2+对转化细胞体外分化的影响 正常角朊细胞及第24代转化角朊细胞在33 mm直径的培养皿中以K-SFM培养至完全融合后，将每种细胞的培养皿分为两组，一组继续以K-SFM培养，另一组培养基内加入CaCl2溶液致Ca2+终浓度为1.8 mmol/L. 4 d后，弃培养基，各培养皿内加入2 g/L中性蛋白酶溶液1 mL，37℃条件下作用15 min，揭下已形成的角朊细胞膜片，经固定、包埋、切片并常规HE染色，光镜下观察.
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实验数据进行方差分析，P<0.05为显著性差异界限.
2 结果
2.1 可形成细胞克隆的最低接种密度 第2代正常人包皮角朊细胞在大于103细胞/cm2接种密度下可形成克隆，人转化角朊细胞和VX-2细胞分别要求大于102和10细胞/cm2接种密度方可形成细胞克隆. 但是，正常角朊细胞和转化角朊细胞在体外培养条件下形成稳定细胞克隆的最佳接种密度分别是104和103细胞/cm2，而且在最佳接种密度下，两种细胞的克隆形成率无明显差别(Tab 1). VX-2鳞癌细胞在低接种密度条件下(10细胞/cm2)仍具有较高的细胞克隆形成率，显著高于转化细胞的克隆形成率(P<0.05). 但是，VX-2与正常和转化角朊细胞的细胞克隆镜下形态不同，VX-2克隆细胞排列致密，并有明显复层细胞，尤其克隆中央区域最为显著. 正常和转化角朊细胞克隆在K-SMF培养条件下形成单层生长的细胞克隆，无细胞复层现象.
, 百拇医药
表 1 细胞接种密度对克隆形成率(%)的影响
Tab 1 Influence of seeding density of cells on colony formation rate
(n=3, x±s)
Seeding density (cell/cm2)
Cell type
10
102
103
104
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Normal
0
0
1.5±0.7
17.1±5.1
Transformed (passage 24)
0
1.0±0.4
25.8±10.1e
19.7±8.2
VX-2
43.3±12.9ac
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64.3±16.7ac
36.1±6.6ac
31.8±10.9ac
aP<0.05 vs normal of 104 cells/cm2; cP<0.05 vs transformed of 103 cells/cm2; eP<0.05 vs normal of 103 cells/cm2. 2.2 体外培养人包皮角朊细胞生长情况 角朊细胞接种后以K-SFM培养，可继续增殖6代～10代，之后细胞逐渐老化，失去生长能力. 本研究分离得到的原代角朊细胞混有许多老化细胞和其它类型的细胞，经换液去出后，剩余细胞为贴壁生长的表皮基底层细胞，具有良好的增殖分化能力. 为研究该层角朊细胞的增殖能力，我们选用含角朊细胞纯度较高的第2代细胞接种并传代培养，根据细胞计数可推算出各代所获细胞数(Fig 1)，至第8代时所获细胞平均数达峰值，细胞倍增数约为32次. 转化后的角朊细胞在体外具有长期增殖的能力，已传代培养达25代，经推算，倍增次数约为88次. 转化细胞在25代以内，无明显的“危机期”出现，呈持续稳定增殖状态.
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2.3 细胞的增殖率 两种细胞的增殖对FCS的依赖性不同(Fig 2), 20 mL/L和50mL/L的FCS对正常角朊细胞的促增殖作用较弱，而100 mL/L的FCS可明显促进其增殖(P<0.05). 转化细胞在20 mL/L的FCS作用下，增殖率较低，而FCS浓度增加到50 mL/L时可明显促进转化细胞的增殖(P<0.05). 提示转化角朊细胞的增殖对血清的依赖性降低.
2.4 Ca2+对角朊细胞分化生长的影响 完全融合后的正常角朊细胞和转化角朊细胞以K-SFM继续培养，细胞不能持续生长，不能形成复层细胞结构，也无法形成角朊细胞膜片. 而在含有1.8 mmol/L Ca2+的培养基中培养的正常角朊细胞和转化角朊细胞均可发生进一步的细胞分化、复层，并形成完整的角朊细胞膜片. 光镜下见正常角朊细胞膜片大部分区域形成3层结构(Fig 3A)，下层及中层内含有扁平状、排列紧密的角朊细胞，上层细胞成分较少，类似表皮角质层结构. 转化细胞膜片大部分区域形成2层细胞结构，底层为扁平状的角朊细胞，上层为核成分较少的角质层结构(Fig 3B).
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图 1 正常人角朊细胞和转化人角朊细胞的生长曲线
Fig 1 Growth curve of normal human keratinocytes and transformed human keratinocytes
图 2 血清对正常和转化角朊细胞生长的影响
Fig 2 Influence of serum on the growth of normal and transformed keratinocytes
图 3 正常人角朊细胞(A)和转化角朊细胞(B)膜片形态
Fig 3 Morphology of normal keratinocyte (A) and transformed keratinocyte (B) sheets HE ×400
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3 讨论
通过基因转化细胞技术可以建立能够长期体外培养的多种组织来源的细胞系[3]，为体外研究工作提供便利. 我们观察的SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外已培养25代，明显高于常规连续培养6代～10代的水平，且增殖较稳定，在血清依赖性、克隆形成率等方面表现出转化细胞特有的生物学特征.
组织培养细胞和体内组织细胞相似, 生长过程中细胞间具有群体依赖性(population dependence, PD)的特征[4]. 角朊细胞在体外培养时需要一定的接种密度方可良好地分裂增殖，形成细胞克隆，各克隆逐渐扩大而最终导致细胞完全融合成片[5]. 从反映细胞体外增殖活力的克隆形成率这一指标来看，正常人角朊细胞在大于103细胞/cm2接种密度时形成细胞克隆，克隆形成率远远低于VX-2细胞，但经过SV40病毒转化后的角朊细胞在102细胞/cm2接种密度时便可形成细胞克隆，说明转化使角朊细胞分裂增殖的群体依赖性降低. 同时，本研究显示正常和所转化细胞间最大克隆形成率无明显差别，反映出所观察的转化细胞与正常角朊细胞中具备体外增殖活力的细胞比例基本一致. 此外，就形态学观察而言，在一定的培养条件下，正常角朊细胞可分化形成3层细胞结构[1,6]，这是创面移植应用的结构基础. 而我们获得的转化角朊细胞在体外也可分化形成类似结构，这就为将其应用于创面修复的研究创造了有利条件.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目 No.39570718
作者简介:苏映军, 男, 1965-02-01生, 广西南宁人, 汉族, 1989年第四军医大学毕业, 现任西京医院烧伤科主治医师, 博士生，发表论文12篇. 导师:陈璧教授. Tel：(029)3375570 Fax：(029)3251734 E-mail burns@fmmu.edu.cn
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
1 陈 璧, 汤朝武. 人表皮细胞培养增殖的动态观察. 中华整形烧伤外科杂志, 1989;5(4):279-280
2 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Meth, 1989;119(2):203-210
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3 Katakura Y, Alam S, Shirahata S. Immortalization by gene transfection. Methods Cell Biol, 1998; 57(1): 69-91
4 鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 第2版. 北京: 北京出版社, 1997:24-26
5 汤朝武, 陈 璧. 人表皮细胞悬液点状接种原代培养法. 中华实验外科杂志, 1990;7(3):136-137
6 Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975;6(3):331-344, 百拇医药