孕大鼠在胚泡着床前给醋氨酚对移植仔鼠发育及行为的影响
作者：金戈 楼宜嘉
单位：金戈(浙江省人民医院临床药理室工作)；楼宜嘉(浙江大学药学院药理教研室 杭州市 310031)
关键词：醋氨酚；胚泡；微核；胚胎移植；行为致畸；药源性异常
中国现代应用药学000604 摘要 目的：探讨药源性大鼠着床前胚泡异常对移植胚胎发育及行为的影响。方法：采用胚胎移植生物技术，评价亲代孕d 3给醋氨酚(0.25，0.5，1.0 g.kg-1)，对胚泡的细胞毒性和遗传毒性及对移植后仔鼠生理功能和行为发育的影响，探索仔鼠发育与胚泡异常间的相关性。结果：醋氨酚1.0 g.kg-1对胚泡细胞产生细胞毒性及剂量依赖性遗传毒作用。孕大鼠胚泡着床前给予醋氨酚0.5，1.0 g.kg-1可引起仔鼠某些生理功能发育延缓，导致仔鼠行为畸形。结论：醋氨酚对着床前胚泡遗传毒作用与仔鼠某些生理功能发育延缓及行为畸形相关。
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Effects of maternal treatment with acetaminophen during preimplantation period on physiological and behavioral development in offspring of transferred rat embryos
Jin Ge(jin G)，Lou Yijia(Lou YJ)
(Department of Pharmacology,College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University,Hangzhou 310031)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effect of drug-induced rat blastocysts abnormalities during the preimplantation period on the development of the offspring.METHOD:The biological technique of embryo transfer was applied.Ig pregnant rats Acetaminophen(Ace) 0.25，0.5，1.0 g.kg-1 on d 3 of gestation，to evaluate a possible relationship between maternal exposure to Ace during the preimplantation period and the developmental abnormalities of offspring of transferred rat embryos.RESULTS:Caused by Ace both retardation of postnatal development of physical function in some items，and behavioral toxicity in the offspring of transferred embryos were observed.A dose-related increase in frequency of micronuclei(14.9，15.3，19.3‰) and frequency of blastocysts with micronuclei(21.7，25.5，35.5%) were observed.CONCLUSION:The genetic toxicity induced by Ace was correlated to the developmental abnormality and behavioral toxicity of offspring.
, 百拇医药
KEY WORDS acetaminophen，blastocysts，micronuclei，embryo transfer，behavioral teratogenesis，drug-induced abnormalities
近年来，关于药源性哺乳动物着床前胚泡异常对胎仔发育影响的相关性研究日趋重视[1～2]。前文报道[3]，孕大鼠在胚泡着床前应用醋氨酚(Acetaminophen，Ace) 1.0 g.kg11既可引起仔鼠生理功能发育的迟缓，又可导致某些行为功能的缺陷；同时Ace对大鼠着床前胚泡具显著遗传毒性，表现为在不影响胚泡细胞分裂时已可诱导其产生微核[4]，提示药源性着床前胚泡异常与仔鼠生理功能和行为发育异常间可能存在内在联系。本研究应用胚胎移植生物技术，拟评价亲代给Ace后可能存在的母体毒性因素介入，探索着床前亲代应用Ace后，对移植产仔鼠生理功能和行为发育的影响以及与胚泡异常间的相关性。
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材料与方法
1 药品及动物
Ace为浙江温州制药厂产品。氯丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol)，由中国科学院上海药物研究所生殖药理组惠赠。Hepes-M2营养液主要成份中，Hepes为FARCO化学公司产品，牛血清白蛋白为Boehringer公司产品，其余成份均为国产分析纯试剂。Sprague-Dawley大鼠，10wk龄；♀，处女鼠，体重198±17 g；♂，体重287±22 g，由浙江大学湖滨校区实验动物中心提供,合格证号：22-9601018。
2 动物处理
2.1 大鼠在胚泡着床前给Ace对胚泡发育的影响
按文献[4]获得孕鼠，孕鼠于妊娠d 3上午9:00 igAce 0.25，0.5和1.0 g.kg-1(Ace 1.0 g.kg-1约为1/3 LD50)，药物以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)配制悬液。另设ig 0.5% CMC 10 ml.kg-1作溶剂对照(相当于Ace 1.0 g.kg-1给药容量)。
, 百拇医药
各组动物于妊娠d 4(13:00-15:00)称重后处死，按文献[4]收集胚泡，胚泡经低渗处理破坏整体结构后仅剩细胞核，显微镜(×1000)下计数，以每个胚泡的细胞核总数计为该胚泡细胞数(cell number per plastocysts，CNPB)，并将颜色与主核相同，大小约为主核1/5～1/20，边缘光滑，在显微镜下与主核焦距一致的核粒计为该胚泡的微核数，不计入该胚泡的细胞总数。计算每剂量组胚泡微核数及微核率(frequency of micronuclei，FM)、具微核胚泡率(frequency of blastocysts with micronuclei，FBM)。
2.2 大鼠胚泡着床前给亲代Ace对移植仔鼠生理功能和行为的影响
2.2.1 供胚鼠处理 供胚鼠的获得同上，给药组分别为Ace 0.5，1.0 g.kg-1。另设ig 0.5% CMC 10 ml.kg-1作溶剂对照 。孕d 3上午9:00给药，d 4 13:00-15:00进行同步胚胎移植。
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2.2.2 受胚鼠处理 10wk龄♂鼠，ig氯丙二醇5 mg.kg-1，连续5天给药后，使其仍具备交配能力，但精子失去活性，与♀鼠合笼后，于次日查得精子者为假孕d 0，作受胚鼠供用。受胚鼠分成三组，分别作相应组别供胚鼠胚泡的同步移植。
2.2.3胚胎移植显微手术 假孕受胚鼠于妊娠d 4称重后，ip戊巴比妥钠(pentobarbitial sodium)30 mg.kg-1麻醉，卧位固定于手术板。手术区局部消毒后，暴露子宫角待用。同时另将Ace各剂量组及对照组妊娠d 4供胚鼠颈椎脱臼处死，以胚泡营养液(Hepes-M2)冲洗每侧子宫，收集胚泡于微型表面皿，在低倍显微镜下(×40)观察胚泡形态，记录胚泡形态异常状况，然后以4号注射针头在假孕受胚鼠子宫卵巢端，向子宫腔戳一孔，再以直径10 μm硬质玻管将胚泡经孔移植于假孕受胚鼠子宫内。作手术区缝合，每只受胚鼠单独分笼饲养。
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另设9只经氯丙二醇绝育法制备的假孕鼠，在假孕d 13剖杀，观察其子宫是否有胚胎吸收点，评价该法的绝育可靠性。同时观察孕鼠饮水、饮食及活动状况。
2.2.4 仔鼠发育观察 生理发育观察[3]：包括仔鼠体重、张耳时间、长齿时间、开眼时间的记录。
反射发育观察[3]：记录仔鼠翻正反射、悬崖回避、斜坡转身、前肢悬挂、角膜反射、听觉惊愕反射阳性的天数。
行为发育观察、包括游泳能力、开阔场试验、转棒试验和Y型水迷宫试验。游泳能力评价标准：仔鼠于PN(postnatal days，产后天数)7，PN 13进行测试，观察下列指标并计分。①方向：下沉计0分，浮起1分，呈圆形或弧形游泳2分，直线或近直线游泳3分；②头部位置：浸没于水中0分，鼻子位于水面1分，鼻子和头顶部位于或高于水平面但耳朵仍在水面下计2分，同前且耳朵一半位于水面上计3分；③四肢划动：不划动0分，同时用四肢划动1分，前肢卷曲不动，后肢划动2分。并将以上指标得分相加，即为被测试仔鼠的游泳得分。
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为了确使本研究行为学测试系统的可靠性与可复性，另设未行胚胎移植术的溶剂对照组和Ace 1.0 g.kg-1组，所获结果与文献进行比较(此二组分娩后第4天每窝仔鼠调整到4 ♂、4 ♀共8只，不足8只以实际仔鼠数实验，每窝少于5只仔鼠的整窝淘汰)。
3 数据处理
CNPB以t检验，FM，FBM以X2进行显著性检验。仔鼠行为学研究中，实验结果除转棒试验阳性百分率先进行反正弦函数变换后，与其它各组数据进行Dunnett's T检验，数据输入SPSS统计软件包进行自动分析。
结 果
1 孕鼠d 3给予不同剂量Ace对胚泡发育的影响
Ace 0.25，0.5 g.kg-1组对CNPB无明显改变，Ace 1.0 g.kg-1使CNPB显著减少。Ace各剂量组FM和FBM均显著升高(表1)。Ace致胚泡遗传物质损伤作用有明显剂量依赖关系，呈正相关性(γ1=0.969;γ2=0.998)。
, 百拇医药
表1 母鼠孕d 3给醋氨酚对胚泡细胞数，微核率和具微核胚泡率的影响 醋氨酚/
克.kg-1
孕鼠数
观察胚
泡数
胚泡细胞
数/x±s
微核率/
‰
具微核胚
泡率/%
0
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12
115
41±6
3.2
9.6
0.25
10
84
40±7
14.9*1
21.7*1
0.5
8
, 百拇医药
47
41±7
15.3*1
25.5*1
1.0
10
82
34±5*2
19.3*1
35.5*1
注：与对照组相比，*1P<0.01，*2P<0.001
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2 孕鼠在胚胎着床前ig Ace对移植产仔鼠发育的影响
2.1移植胚胎在假孕受胚鼠体内的发育
各剂量组与对照组比较，受胚孕鼠饮水、饮食及活动状况无差异。氯丙二醇绝育雄鼠制备的假孕鼠，未经胚胎移植者均未见着床点。
2.2 仔鼠发育进程评价
Ace 1.0 g.kg-1组仔鼠PN 9-PN 25体重均低于同期对照组，有显著差异。Ace 0.5 g.kg-1组与对照组无差异(结果未列出)。Ace 1.0 g.kg-1组张耳、开眼时间与对照组相比均明显延缓，Ace 0.5 g.kg-1组开眼时间与对照组相比明显延缓，而长齿时间无显著改变(表2)。
, 百拇医药
表2 移植仔鼠发育观察 醋氨酚/克.kg-1
窝数
张耳时间/d
长齿时间/d
开眼时间/d
0
19
3.3±0.5
10.4±0.7
14.2±0.6
0.5
18
, 百拇医药
3.3±0.5
10.5±0.5
14.9±0.5*
1.0
20
3.8±0.8*
10.8±1.2
14.8±0.8*
注：天-指每窝中所有仔鼠达到标准的天数；与对照组相比，*P<0.05
2.3 仔鼠反射发育观察
, 百拇医药 与CMC组相比，仔鼠反射行为测试中，Ace各剂量组在听觉惊愕反射上明显延缓(表3)。
表3 移植仔鼠反射发育观察 醋氨酚/
克.kg-1
窝数
翻正反射/d
角膜反射/d
听觉惊愕/d
斜坡转身/d
斜坡转身/s
前肢悬挂/d
悬崖回避/d
, 百拇医药
0
19
4.4±0.9
15.2±0.8
14.7±0.9
8.4±0.7
11.2±3.4
8.0±0.6
5.9±0.8
0.5
17
4.7±0.7
15.3±0.5
, 百拇医药
15.8±0.9*
8.8±0.8
11.1±4.0
8.8±0.9
5.5±0.5
1.0
20
4.8±1.1
15.6±0.9
15.5±1.1*
8.6±0.9
11.9±4.0
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8.6±1.4
6.2±0.8
注：d-指每窝中所有仔鼠达到标准的天数；与对照组相比，*P<0.05
2.4 仔鼠行为发育观察
游泳能力测试:在游泳能力测试中，Ace各剂量组与对照组相比，PN 13游泳头部位置得分都显著低于对照组( 2.7±0.4 vs 3.0±0.1，0.5 g.kg-1；2.8±0.4 vs 3.0±0.1，1.0 g.kg-1)。在转棒实验中，与对照组相比，Ace 0.5 g.kg-1组在PN 20(6.5±12.6 vs 59.1±25.3，P<0.001)，Ace 1.0 g.kg-1在PN25(69.8±31.5 vs 97.8±8.8，P<0.05)达标阳性率上有显著差别。
, 百拇医药
开阔场试验：在PN 19，PN 27开阔场测试中，Ace 1.0 g.kg-1组活动静止期显著高于对照组，爬行格子数少于对照组；Ace 0.5 g.kg-1组PN 19除爬行格子数少于对照组，PN 27活动静止期显著高于对照组，爬行格子数少于对照组，其余分指标差异无显著性(表4)。
表4 移植仔鼠开阔场试验结果 醋氨酚/克.kg-1
窝数
静止时间/s
爬行格子数
PN19
PN27
, 百拇医药
PN19
PN27
0
19
38.9±9.8
19.8±6.9
37.6±14.1
61.6±24.4
0.5
17
52.0±24.9
29.9±20.3*1
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25.1±6.7*2
33.5±8.7*3
1.0
19
54.9±19.6*2
29.8±15.3*1
25.4±11.7*2
42.4±15.2*2
注：与对照组相比，*1P<0.05，*2P<0.01,*3P<0.001
, 百拇医药
Y型水迷宫学习及记忆能力测试：Ace各剂量在PN 25，27，32 Y型水迷宫测试中，与对照组比较具有显著差异(表5)。
表5 移植仔鼠Y型水迷宫实验结果 醋氨酚/
克.kg-1
窝数
PN25/s
PN27/s
PN32/s
0
19
24.2±5.8
, 百拇医药 17.3±4.3
11.3±3.2
0.5
17
36.9±7.8*1
24.3±5.9*1
15.9±3.7*1
1.0
19
31.3±6.7*1
20.7±5.1*2
, 百拇医药
15.6±5.2*3
注：与对照组相比，*1P<0.001，*2P<0.05，*3P<0.01
未经胚胎移植的Ace 1.0 g.kg-1组与CMC组生理功能及行为研究，结果与前文报道[3]基本吻合。
讨 论
孕鼠妊娠d 3给予Ace可明显影响着床前胚胎发育，在未引起胚泡CNPB减少时，显著提高FM和FBM，提示Ace对着床前胚胎具有特异的遗传毒性作用，但该胚胎尚可继续发育为具滋养层细胞和内细胞团的胚泡，表明具遗传物质损伤的早期胚胎仍可在特定时相按正常发育程序生长，对着床后胚胎发育具潜在危害。
, 百拇医药 胚胎移植生物技术通过将胚泡移植到假孕受胚鼠子宫内继续生长发育的手段，可分析整体实验中胚泡着床前亲代给药所产生的仔鼠行为畸形，系母体毒性介入所致，还是药物对胚泡的直接作用发展而致。
本文以氯丙二醇灌胃给予雄鼠，使之仍具交配能力，但精子失去活力，绝育率达100%。以氯丙二醇制备假孕模型，进行胚胎移植，方便易行，假孕肯定，结果可靠，使移植胚胎在受胚鼠子宫内的发育能确切反映胚胎移植前损伤情况，迄今未见氯丙二醇制备假孕模型作为胚胎移植受胚鼠，用于评价药源性胚泡异常对仔鼠生理功能及行为影响的报道，故本研究以此模型移植产仔鼠，在同类研究方法学上有所突破。
在分娩存活的移植仔鼠中，未发现明显外观畸形仔鼠，与文献报道小鼠着床前阶段进行电离辐射或应用乌拉坦后分娩得到的仔鼠情况相一致，表明胚泡在亲代体内染毒不同剂量Ace并移植后，虽然遗传物质损伤，尚能完成着床过程，胚泡一旦着床，在子宫环境内的进一步发育就相似。
, 百拇医药 仔鼠生理发育观察结果表明仔鼠生长发育的一般状况比对照组迟缓。在仔鼠反射发育观察中，听觉惊愕反射的延迟表明了给药组与对照组在先天反射行为上的差异，而先天反射行为具有高度的发育规律性和重复性。听觉反射异常可能为“反射弧”上任何一个环节或多个环节的发育滞后。中枢神经系统是其中一个可能的环节，因为Ace虽非神经毒物，但小鼠孕前和妊娠期用药可明显抑制胎仔大脑和垂体发育[5]。体外研究表明，Ace可使大鼠胚胎神经管闭合延缓，表明Ace可影响胎仔神经系统的发育。听觉反射的中枢在延髓，提示移植仔鼠听觉惊愕反射异常可能为中枢神经系统功能上的发育延缓。
仔鼠行为发育测试中，动物的活动能力 ( 游泳能力，转棒试验 )是一项综合指标，可反映动物多系统的协调能力，特别是神经肌肉的活动能力与功能状态。给药组仔鼠游泳能力与转棒达标率显著低于对照组，表明仔鼠神经及运动协调功能发育延缓。开阔场是行为畸胎学常用测试方法，用来测定动物探索性行为和情绪状态以及对新奇环境的应激性。给药组活动静止期高于对照组，爬行格子数低于对照组，表明仔鼠适应能力与探索能力的减弱。Y型水迷宫是一种简单的学习模式，实验结果反映了给药组仔鼠在学习能力和记忆能力方面与对照组有显著差异。
, 百拇医药
行为发育主要取决于神经系统的发育，即行为只是内在发育的外部表现。张耳、开眼、听觉惊谔反射等项目的延缓，表现为时序上的落后，但最终仍可发育完全。而游泳能力、转棒试验、开阔场、Y型水迷宫等测试结果表明仔鼠行为功能的缺陷，这些差异可在较长时间内存在，甚至是永久性的，实质是一定程度丧失了执行某些功能的能力，提示神经组织部分机能不全，一般难以恢复。
胚泡显微形态学与细胞学分析表明，Ace 0.5 g.kg-1对胚泡无明显细胞毒性，Ace 0.5，1.0 g.kg-1则对胚泡具遗传毒性，而与此相应的两个给药组移植后仔鼠发育异常及行为畸形。该结果说明仔鼠行为发育畸形与Ace致着床前胚泡遗传物质损伤有关，而与Ace的细胞毒性作用关系不密切。同时本实验结果也表明，虽然着床前胚泡遗传物质损伤存在剂量依赖关系，但在致仔鼠行为畸形效应上无明显差别，可能Ace致仔鼠神经系统功能损害存在阈剂量，0.5 g.kg-1与1.0 g.kg-1已在阈剂量以上。
, 百拇医药
本实验通过运用胚胎移植生物技术，选用从生理功能、反射发育到运动能力、情感活动和学习记忆等一整套行为功能测试方法，基本覆盖了行为畸胎学试验的各个方面，结合着床前胚泡的细胞学研究，明确了Ace致着床前胚泡损伤对移植仔鼠生理功能和行为发育的致畸作用相关性，但其确切作用机制尚待进一步阐明。
本研究受国家自然科学基金资助No 39470836
参考文献
1，Giavini E，Lemonica IP，Lou Y，et al.Induction of micronuclei and toxic effects in embryos of pregnant rats treated before implantation with anticancer drugs:cyclophosphamide，cis-platinum，adriamycin.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1990，10∶417.
, 百拇医药
2，Nagao T，Morita Y，Ishizuka Y，et al.Induction of fetal malformations after treatment of mouse embryos with methylnitrosourea at the preimplantation stages.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1991，11∶1.
3，应赢，楼宜嘉，刘鹤雏.大鼠胚泡着床前应用阿司匹林和醋氨酚对仔鼠的行为致畸作用.浙江医科大学学报，1993，22∶196.
4，楼宜嘉，应赢，吴飞文，等.阿司匹林，对乙酰氨基酚和布洛芬对整体大鼠着床前胚泡的微核诱导作用.中国药理学与毒理学杂志，1993，7∶297.
5，Weeks BS，Garnache P，Klein NW，et al.Acetaminophen toxicity to cultured rat embryos.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1990，10∶361.
收稿日期：1999-03-19, 百拇医药
单位：金戈(浙江省人民医院临床药理室工作)；楼宜嘉(浙江大学药学院药理教研室 杭州市 310031)
关键词：醋氨酚；胚泡；微核；胚胎移植；行为致畸；药源性异常
中国现代应用药学000604 摘要 目的：探讨药源性大鼠着床前胚泡异常对移植胚胎发育及行为的影响。方法：采用胚胎移植生物技术，评价亲代孕d 3给醋氨酚(0.25，0.5，1.0 g.kg-1)，对胚泡的细胞毒性和遗传毒性及对移植后仔鼠生理功能和行为发育的影响，探索仔鼠发育与胚泡异常间的相关性。结果：醋氨酚1.0 g.kg-1对胚泡细胞产生细胞毒性及剂量依赖性遗传毒作用。孕大鼠胚泡着床前给予醋氨酚0.5，1.0 g.kg-1可引起仔鼠某些生理功能发育延缓，导致仔鼠行为畸形。结论：醋氨酚对着床前胚泡遗传毒作用与仔鼠某些生理功能发育延缓及行为畸形相关。
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Effects of maternal treatment with acetaminophen during preimplantation period on physiological and behavioral development in offspring of transferred rat embryos
Jin Ge(jin G)，Lou Yijia(Lou YJ)
(Department of Pharmacology,College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University,Hangzhou 310031)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effect of drug-induced rat blastocysts abnormalities during the preimplantation period on the development of the offspring.METHOD:The biological technique of embryo transfer was applied.Ig pregnant rats Acetaminophen(Ace) 0.25，0.5，1.0 g.kg-1 on d 3 of gestation，to evaluate a possible relationship between maternal exposure to Ace during the preimplantation period and the developmental abnormalities of offspring of transferred rat embryos.RESULTS:Caused by Ace both retardation of postnatal development of physical function in some items，and behavioral toxicity in the offspring of transferred embryos were observed.A dose-related increase in frequency of micronuclei(14.9，15.3，19.3‰) and frequency of blastocysts with micronuclei(21.7，25.5，35.5%) were observed.CONCLUSION:The genetic toxicity induced by Ace was correlated to the developmental abnormality and behavioral toxicity of offspring.
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KEY WORDS acetaminophen，blastocysts，micronuclei，embryo transfer，behavioral teratogenesis，drug-induced abnormalities
近年来，关于药源性哺乳动物着床前胚泡异常对胎仔发育影响的相关性研究日趋重视[1～2]。前文报道[3]，孕大鼠在胚泡着床前应用醋氨酚(Acetaminophen，Ace) 1.0 g.kg11既可引起仔鼠生理功能发育的迟缓，又可导致某些行为功能的缺陷；同时Ace对大鼠着床前胚泡具显著遗传毒性，表现为在不影响胚泡细胞分裂时已可诱导其产生微核[4]，提示药源性着床前胚泡异常与仔鼠生理功能和行为发育异常间可能存在内在联系。本研究应用胚胎移植生物技术，拟评价亲代给Ace后可能存在的母体毒性因素介入，探索着床前亲代应用Ace后，对移植产仔鼠生理功能和行为发育的影响以及与胚泡异常间的相关性。
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材料与方法
1 药品及动物
Ace为浙江温州制药厂产品。氯丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol)，由中国科学院上海药物研究所生殖药理组惠赠。Hepes-M2营养液主要成份中，Hepes为FARCO化学公司产品，牛血清白蛋白为Boehringer公司产品，其余成份均为国产分析纯试剂。Sprague-Dawley大鼠，10wk龄；♀，处女鼠，体重198±17 g；♂，体重287±22 g，由浙江大学湖滨校区实验动物中心提供,合格证号：22-9601018。
2 动物处理
2.1 大鼠在胚泡着床前给Ace对胚泡发育的影响
按文献[4]获得孕鼠，孕鼠于妊娠d 3上午9:00 igAce 0.25，0.5和1.0 g.kg-1(Ace 1.0 g.kg-1约为1/3 LD50)，药物以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)配制悬液。另设ig 0.5% CMC 10 ml.kg-1作溶剂对照(相当于Ace 1.0 g.kg-1给药容量)。
, 百拇医药
各组动物于妊娠d 4(13:00-15:00)称重后处死，按文献[4]收集胚泡，胚泡经低渗处理破坏整体结构后仅剩细胞核，显微镜(×1000)下计数，以每个胚泡的细胞核总数计为该胚泡细胞数(cell number per plastocysts，CNPB)，并将颜色与主核相同，大小约为主核1/5～1/20，边缘光滑，在显微镜下与主核焦距一致的核粒计为该胚泡的微核数，不计入该胚泡的细胞总数。计算每剂量组胚泡微核数及微核率(frequency of micronuclei，FM)、具微核胚泡率(frequency of blastocysts with micronuclei，FBM)。
2.2 大鼠胚泡着床前给亲代Ace对移植仔鼠生理功能和行为的影响
2.2.1 供胚鼠处理 供胚鼠的获得同上，给药组分别为Ace 0.5，1.0 g.kg-1。另设ig 0.5% CMC 10 ml.kg-1作溶剂对照 。孕d 3上午9:00给药，d 4 13:00-15:00进行同步胚胎移植。
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2.2.2 受胚鼠处理 10wk龄♂鼠，ig氯丙二醇5 mg.kg-1，连续5天给药后，使其仍具备交配能力，但精子失去活性，与♀鼠合笼后，于次日查得精子者为假孕d 0，作受胚鼠供用。受胚鼠分成三组，分别作相应组别供胚鼠胚泡的同步移植。
2.2.3胚胎移植显微手术 假孕受胚鼠于妊娠d 4称重后，ip戊巴比妥钠(pentobarbitial sodium)30 mg.kg-1麻醉，卧位固定于手术板。手术区局部消毒后，暴露子宫角待用。同时另将Ace各剂量组及对照组妊娠d 4供胚鼠颈椎脱臼处死，以胚泡营养液(Hepes-M2)冲洗每侧子宫，收集胚泡于微型表面皿，在低倍显微镜下(×40)观察胚泡形态，记录胚泡形态异常状况，然后以4号注射针头在假孕受胚鼠子宫卵巢端，向子宫腔戳一孔，再以直径10 μm硬质玻管将胚泡经孔移植于假孕受胚鼠子宫内。作手术区缝合，每只受胚鼠单独分笼饲养。
, http://www.100md.com
另设9只经氯丙二醇绝育法制备的假孕鼠，在假孕d 13剖杀，观察其子宫是否有胚胎吸收点，评价该法的绝育可靠性。同时观察孕鼠饮水、饮食及活动状况。
2.2.4 仔鼠发育观察 生理发育观察[3]：包括仔鼠体重、张耳时间、长齿时间、开眼时间的记录。
反射发育观察[3]：记录仔鼠翻正反射、悬崖回避、斜坡转身、前肢悬挂、角膜反射、听觉惊愕反射阳性的天数。
行为发育观察、包括游泳能力、开阔场试验、转棒试验和Y型水迷宫试验。游泳能力评价标准：仔鼠于PN(postnatal days，产后天数)7，PN 13进行测试，观察下列指标并计分。①方向：下沉计0分，浮起1分，呈圆形或弧形游泳2分，直线或近直线游泳3分；②头部位置：浸没于水中0分，鼻子位于水面1分，鼻子和头顶部位于或高于水平面但耳朵仍在水面下计2分，同前且耳朵一半位于水面上计3分；③四肢划动：不划动0分，同时用四肢划动1分，前肢卷曲不动，后肢划动2分。并将以上指标得分相加，即为被测试仔鼠的游泳得分。
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为了确使本研究行为学测试系统的可靠性与可复性，另设未行胚胎移植术的溶剂对照组和Ace 1.0 g.kg-1组，所获结果与文献进行比较(此二组分娩后第4天每窝仔鼠调整到4 ♂、4 ♀共8只，不足8只以实际仔鼠数实验，每窝少于5只仔鼠的整窝淘汰)。
3 数据处理
CNPB以t检验，FM，FBM以X2进行显著性检验。仔鼠行为学研究中，实验结果除转棒试验阳性百分率先进行反正弦函数变换后，与其它各组数据进行Dunnett's T检验，数据输入SPSS统计软件包进行自动分析。
结 果
1 孕鼠d 3给予不同剂量Ace对胚泡发育的影响
Ace 0.25，0.5 g.kg-1组对CNPB无明显改变，Ace 1.0 g.kg-1使CNPB显著减少。Ace各剂量组FM和FBM均显著升高(表1)。Ace致胚泡遗传物质损伤作用有明显剂量依赖关系，呈正相关性(γ1=0.969;γ2=0.998)。
, 百拇医药
表1 母鼠孕d 3给醋氨酚对胚泡细胞数，微核率和具微核胚泡率的影响 醋氨酚/
克.kg-1
孕鼠数
观察胚
泡数
胚泡细胞
数/x±s
微核率/
‰
具微核胚
泡率/%
0
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12
115
41±6
3.2
9.6
0.25
10
84
40±7
14.9*1
21.7*1
0.5
8
, 百拇医药
47
41±7
15.3*1
25.5*1
1.0
10
82
34±5*2
19.3*1
35.5*1
注：与对照组相比，*1P<0.01，*2P<0.001
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2 孕鼠在胚胎着床前ig Ace对移植产仔鼠发育的影响
2.1移植胚胎在假孕受胚鼠体内的发育
各剂量组与对照组比较，受胚孕鼠饮水、饮食及活动状况无差异。氯丙二醇绝育雄鼠制备的假孕鼠，未经胚胎移植者均未见着床点。
2.2 仔鼠发育进程评价
Ace 1.0 g.kg-1组仔鼠PN 9-PN 25体重均低于同期对照组，有显著差异。Ace 0.5 g.kg-1组与对照组无差异(结果未列出)。Ace 1.0 g.kg-1组张耳、开眼时间与对照组相比均明显延缓，Ace 0.5 g.kg-1组开眼时间与对照组相比明显延缓，而长齿时间无显著改变(表2)。
, 百拇医药
表2 移植仔鼠发育观察 醋氨酚/克.kg-1
窝数
张耳时间/d
长齿时间/d
开眼时间/d
0
19
3.3±0.5
10.4±0.7
14.2±0.6
0.5
18
, 百拇医药
3.3±0.5
10.5±0.5
14.9±0.5*
1.0
20
3.8±0.8*
10.8±1.2
14.8±0.8*
注：天-指每窝中所有仔鼠达到标准的天数；与对照组相比，*P<0.05
2.3 仔鼠反射发育观察
, 百拇医药 与CMC组相比，仔鼠反射行为测试中，Ace各剂量组在听觉惊愕反射上明显延缓(表3)。
表3 移植仔鼠反射发育观察 醋氨酚/
克.kg-1
窝数
翻正反射/d
角膜反射/d
听觉惊愕/d
斜坡转身/d
斜坡转身/s
前肢悬挂/d
悬崖回避/d
, 百拇医药
0
19
4.4±0.9
15.2±0.8
14.7±0.9
8.4±0.7
11.2±3.4
8.0±0.6
5.9±0.8
0.5
17
4.7±0.7
15.3±0.5
, 百拇医药
15.8±0.9*
8.8±0.8
11.1±4.0
8.8±0.9
5.5±0.5
1.0
20
4.8±1.1
15.6±0.9
15.5±1.1*
8.6±0.9
11.9±4.0
, http://www.100md.com
8.6±1.4
6.2±0.8
注：d-指每窝中所有仔鼠达到标准的天数；与对照组相比，*P<0.05
2.4 仔鼠行为发育观察
游泳能力测试:在游泳能力测试中，Ace各剂量组与对照组相比，PN 13游泳头部位置得分都显著低于对照组( 2.7±0.4 vs 3.0±0.1，0.5 g.kg-1；2.8±0.4 vs 3.0±0.1，1.0 g.kg-1)。在转棒实验中，与对照组相比，Ace 0.5 g.kg-1组在PN 20(6.5±12.6 vs 59.1±25.3，P<0.001)，Ace 1.0 g.kg-1在PN25(69.8±31.5 vs 97.8±8.8，P<0.05)达标阳性率上有显著差别。
, 百拇医药
开阔场试验：在PN 19，PN 27开阔场测试中，Ace 1.0 g.kg-1组活动静止期显著高于对照组，爬行格子数少于对照组；Ace 0.5 g.kg-1组PN 19除爬行格子数少于对照组，PN 27活动静止期显著高于对照组，爬行格子数少于对照组，其余分指标差异无显著性(表4)。
表4 移植仔鼠开阔场试验结果 醋氨酚/克.kg-1
窝数
静止时间/s
爬行格子数
PN19
PN27
, 百拇医药
PN19
PN27
0
19
38.9±9.8
19.8±6.9
37.6±14.1
61.6±24.4
0.5
17
52.0±24.9
29.9±20.3*1
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25.1±6.7*2
33.5±8.7*3
1.0
19
54.9±19.6*2
29.8±15.3*1
25.4±11.7*2
42.4±15.2*2
注：与对照组相比，*1P<0.05，*2P<0.01,*3P<0.001
, 百拇医药
Y型水迷宫学习及记忆能力测试：Ace各剂量在PN 25，27，32 Y型水迷宫测试中，与对照组比较具有显著差异(表5)。
表5 移植仔鼠Y型水迷宫实验结果 醋氨酚/
克.kg-1
窝数
PN25/s
PN27/s
PN32/s
0
19
24.2±5.8
, 百拇医药 17.3±4.3
11.3±3.2
0.5
17
36.9±7.8*1
24.3±5.9*1
15.9±3.7*1
1.0
19
31.3±6.7*1
20.7±5.1*2
, 百拇医药
15.6±5.2*3
注：与对照组相比，*1P<0.001，*2P<0.05，*3P<0.01
未经胚胎移植的Ace 1.0 g.kg-1组与CMC组生理功能及行为研究，结果与前文报道[3]基本吻合。
讨 论
孕鼠妊娠d 3给予Ace可明显影响着床前胚胎发育，在未引起胚泡CNPB减少时，显著提高FM和FBM，提示Ace对着床前胚胎具有特异的遗传毒性作用，但该胚胎尚可继续发育为具滋养层细胞和内细胞团的胚泡，表明具遗传物质损伤的早期胚胎仍可在特定时相按正常发育程序生长，对着床后胚胎发育具潜在危害。
, 百拇医药 胚胎移植生物技术通过将胚泡移植到假孕受胚鼠子宫内继续生长发育的手段，可分析整体实验中胚泡着床前亲代给药所产生的仔鼠行为畸形，系母体毒性介入所致，还是药物对胚泡的直接作用发展而致。
本文以氯丙二醇灌胃给予雄鼠，使之仍具交配能力，但精子失去活力，绝育率达100%。以氯丙二醇制备假孕模型，进行胚胎移植，方便易行，假孕肯定，结果可靠，使移植胚胎在受胚鼠子宫内的发育能确切反映胚胎移植前损伤情况，迄今未见氯丙二醇制备假孕模型作为胚胎移植受胚鼠，用于评价药源性胚泡异常对仔鼠生理功能及行为影响的报道，故本研究以此模型移植产仔鼠，在同类研究方法学上有所突破。
在分娩存活的移植仔鼠中，未发现明显外观畸形仔鼠，与文献报道小鼠着床前阶段进行电离辐射或应用乌拉坦后分娩得到的仔鼠情况相一致，表明胚泡在亲代体内染毒不同剂量Ace并移植后，虽然遗传物质损伤，尚能完成着床过程，胚泡一旦着床，在子宫环境内的进一步发育就相似。
, 百拇医药 仔鼠生理发育观察结果表明仔鼠生长发育的一般状况比对照组迟缓。在仔鼠反射发育观察中，听觉惊愕反射的延迟表明了给药组与对照组在先天反射行为上的差异，而先天反射行为具有高度的发育规律性和重复性。听觉反射异常可能为“反射弧”上任何一个环节或多个环节的发育滞后。中枢神经系统是其中一个可能的环节，因为Ace虽非神经毒物，但小鼠孕前和妊娠期用药可明显抑制胎仔大脑和垂体发育[5]。体外研究表明，Ace可使大鼠胚胎神经管闭合延缓，表明Ace可影响胎仔神经系统的发育。听觉反射的中枢在延髓，提示移植仔鼠听觉惊愕反射异常可能为中枢神经系统功能上的发育延缓。
仔鼠行为发育测试中，动物的活动能力 ( 游泳能力，转棒试验 )是一项综合指标，可反映动物多系统的协调能力，特别是神经肌肉的活动能力与功能状态。给药组仔鼠游泳能力与转棒达标率显著低于对照组，表明仔鼠神经及运动协调功能发育延缓。开阔场是行为畸胎学常用测试方法，用来测定动物探索性行为和情绪状态以及对新奇环境的应激性。给药组活动静止期高于对照组，爬行格子数低于对照组，表明仔鼠适应能力与探索能力的减弱。Y型水迷宫是一种简单的学习模式，实验结果反映了给药组仔鼠在学习能力和记忆能力方面与对照组有显著差异。
, 百拇医药
行为发育主要取决于神经系统的发育，即行为只是内在发育的外部表现。张耳、开眼、听觉惊谔反射等项目的延缓，表现为时序上的落后，但最终仍可发育完全。而游泳能力、转棒试验、开阔场、Y型水迷宫等测试结果表明仔鼠行为功能的缺陷，这些差异可在较长时间内存在，甚至是永久性的，实质是一定程度丧失了执行某些功能的能力，提示神经组织部分机能不全，一般难以恢复。
胚泡显微形态学与细胞学分析表明，Ace 0.5 g.kg-1对胚泡无明显细胞毒性，Ace 0.5，1.0 g.kg-1则对胚泡具遗传毒性，而与此相应的两个给药组移植后仔鼠发育异常及行为畸形。该结果说明仔鼠行为发育畸形与Ace致着床前胚泡遗传物质损伤有关，而与Ace的细胞毒性作用关系不密切。同时本实验结果也表明，虽然着床前胚泡遗传物质损伤存在剂量依赖关系，但在致仔鼠行为畸形效应上无明显差别，可能Ace致仔鼠神经系统功能损害存在阈剂量，0.5 g.kg-1与1.0 g.kg-1已在阈剂量以上。
, 百拇医药
本实验通过运用胚胎移植生物技术，选用从生理功能、反射发育到运动能力、情感活动和学习记忆等一整套行为功能测试方法，基本覆盖了行为畸胎学试验的各个方面，结合着床前胚泡的细胞学研究，明确了Ace致着床前胚泡损伤对移植仔鼠生理功能和行为发育的致畸作用相关性，但其确切作用机制尚待进一步阐明。
本研究受国家自然科学基金资助No 39470836
参考文献
1，Giavini E，Lemonica IP，Lou Y，et al.Induction of micronuclei and toxic effects in embryos of pregnant rats treated before implantation with anticancer drugs:cyclophosphamide，cis-platinum，adriamycin.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1990，10∶417.
, 百拇医药
2，Nagao T，Morita Y，Ishizuka Y，et al.Induction of fetal malformations after treatment of mouse embryos with methylnitrosourea at the preimplantation stages.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1991，11∶1.
3，应赢，楼宜嘉，刘鹤雏.大鼠胚泡着床前应用阿司匹林和醋氨酚对仔鼠的行为致畸作用.浙江医科大学学报，1993，22∶196.
4，楼宜嘉，应赢，吴飞文，等.阿司匹林，对乙酰氨基酚和布洛芬对整体大鼠着床前胚泡的微核诱导作用.中国药理学与毒理学杂志，1993，7∶297.
5，Weeks BS，Garnache P，Klein NW，et al.Acetaminophen toxicity to cultured rat embryos.Teratogenesis Carcinog Mutagen，1990，10∶361.
收稿日期：1999-03-19, 百拇医药