药物代谢分型的研究进展
作者：周权 姚彤炜 曾苏
单位：周权(浙江大学医学院附属二院 杭州 310009)；姚彤炜 曾苏(浙江大学药学院药物代谢与药物分析研究室 杭州 310031)
关键词：代谢；遗传多态性；代谢分型；基因分型
中国现代应用药学000601 摘要 目的：为了促进药物代谢分型研究在临床上的深入。方法：综述近几年具遗传多态性代谢酶的探针药物、代谢分型方法以及影响因素。介绍“Cocktail”分型法。比较代谢分型与基因分型两种分型方法。结果：疾病、并用药物、探药剂量、样本处理方法、服药依从性是代谢分型的主要影响因素。结论：药物代谢分型能指导临床安全合理有效地用药。基因分型与代谢分型各有优缺点，应灵活应用。“Cocktail”分型方法具有独特的优越性和发展前景。应大力开展在特殊群体中的代谢分型研究。
The advancement in phenotyping study of drug metabolism
, 百拇医药
Zhou Quan(Zhou Q),Yao Tongwei(Yao TW),Zeng Su(Zeng S)
(The Second Hospital Affiliated to College of Medicinal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
ABSTRACT OBJECTIVE：To promote the phenotyping study in clinical practise.METHOD:The probe drugs of drug metabolism、methods of phenotype and related factors were reviewed.The “Cocktail” strategy was described the methods of phenotyping genotyping was compared.RESULTS:Disease,coadministration,probe dosage,sample treatment and compliance are the main factors affecting phenotyping.CONCLUSION:Phenotyping will help provide a safe、rational and effectual prescription.Pros and cons exist in phenotyping as well as in genotyping.The “Cocktail” strategy has sepecial advantages.Phenotyping study in special individuals should be enhanced.
, 百拇医药
KEY WORDS metabolism,polymorphism,phenotyping,genotyping
若药物代谢酶具有遗传多态性(Genetic polymorphism)，则会造成药物个体作用差异。对于治疗范围狭窄的药物，则可能出现疗效不佳或毒副作用。用选择性的探针药物(Probe drug)来确定病人的代谢表型(Phenotype)，区分快代谢型(Extensive metabolizer,EM)和慢代谢型(Poor metabolizer,PM)，以指导临床安全合理有效地用药，正是药物代谢分型研究的主要内容。目前国内的药物代谢分型研究多侧重于健康志愿者的分型，真正应用于临床还几乎是空白。医生很少考虑表型与处方剂量之间的关系。本文综述药物代谢分型研究的方法进展、影响因素以及与基因分型的比较，以说明代谢分型研究在临床上的可行性和重要性。
1 具遗传多态性代谢酶的探针药物
, 百拇医药 1.1 CYP1A2
在人肝P450中其含量约13%，个体差异有40倍。在毒理学上对一些前致癌物的代谢激活有重要的意义，膀胱癌和直肠癌发病率的差异与CYP1A2的多态性有关。在药物代谢中CYP1A2的底物有局麻药利多卡因、解热镇痛药(对乙酰氨基酚、非那西丁、萘普生)、抗心律失常药(美西律、普罗帕酮)、一些三环、四环类抗忧郁药、抗肿瘤药(futamide、三苯氧胺)、咖啡因、β受体阻滞剂等。
常用咖啡因作为CYP1A2多态性的探针药物。方法有13C咖啡因呼吸试验、尿代谢物比、血浆或唾液中1,7-二甲黄嘌呤/咖啡因浓度比。最新研究表明用前两种方法来估计CYP1A2的活性不够准确。这主要是因为咖啡因代谢的复杂性及影响每个代谢产物肾清除因素的多样性。统计200多名志愿者的5种代谢率，结果没有一项两两相关。而利用给药后5-7 hr时在血浆或唾液中1,7-二甲黄嘌呤/咖啡因浓度比能很好地反映CYP1A2的活性，其比例与咖啡因的系统清除率高度相关。该法只需单点取样，故快速、简便、经济。表型分型结果被肝切除术后的基因分型所证实[1]。
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1.2 CYP2A6
在人肝P450中含量约4%，个体差异30-100倍。人群慢代谢发生率小于2%，它催化一些药物如挥发性麻醉剂的脱氟反应、精神安定药的S-氧化、环磷酰胺的C4-羟化、1,7-二甲黄嘌呤的C8-羟化等。
香豆素C7-羟化可作为CYP2A6的体内外探针。血小板活化因子受体拮抗剂SM12502主要经CYP2A6代谢(S-氧化)，以它为探针从28名健康日本志愿者中检出三例慢代谢者。PCR-RPLC分析发现这三例CYP2A6的等位基因缺少外显子1、8、9[2]。
1.3 CYP2C9
CYP2C亚族在人肝P450中含量约18%，其中以CYP2C9含量最多。主要经CYP2C9代谢的药物有甲苯磺丁脲、洛沙坦、苯妥因、S-华法林、氟伐他丁及一些非甾体类抗炎药(如双氯灭酸、布洛芬)等。
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抑制试验和利用转基因细胞的酶学表征试验证明，非甾体类抗炎药氟比洛芬的主要氧化代谢途径(4'-羟化反应)只有CYP2C9参与，而CYP1A1、 2A6、 2B6、 2C19、2D6 对该反应均无贡献。由于CYP2C9和CYP 2C19有80%的同源性，因此氟比洛芬无疑是CYP2C9多态性的专属性探针底物[3]。
口服300 mg单剂量苯妥英后12 hr时苯妥英的平均血清浓度可以作为CYP2C9多态性的分型指标。在CYP2C9*1/1基因型中为4.16 mg.ml-1(3.86-4.46), CYP2C9*1/2 中为5.52 mg.ml-1(4.66-6.39)，CYP2C9*1/3中为5.65 mg.ml-1(4.86-6.43)。而且基因分型为CYP2C9*1/1的平均5-(对-羟基苯基)-5-苯基乙内酰脲/苯妥英浓度比(p-HPPH/P)为0.43(0.39-0.47)，CYP2C9*1/2为0.26 (0.21-0.31)，CYP2C9*2/2为0.14(0.13-0.14)，CYP2C9*1/3为0.21(0.18-0.24)，CYP2C9*3/3为0.02，所有突变型的p-HPPH/P均显著低于CYP2C9*1/1。因此若以p-HPPH/P为CYP2C9分型指标则更具专属性[4]。
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一名对华法林治疗极为敏感的病人基因分型为CYP2C9*3/3，其血浆中华法林对映体的浓度比S/R为3.9:1，而在能耐受4-8 mg/d华法林治疗的病人中，S/R为0.50±0.25∶1，提示可以用血浆S/R为指标来替代基因分型法检出CYP2C9*3/3型慢代谢者[5]。
1.4 CYP2C19
个体差异达100倍，白人中CYP2C19慢代谢发生率为5%，东方人为23%。一些重要的底物有β受体阻滞剂、抗忧郁药、精神安定药、质子泵抑制剂等，因此其多态性的临床意义较为重要。其代谢分型的探针有美芬妥英、苯妥英、氯喹、奥美拉唑。
口服单剂量美芬妥英(MP)后，收集服药后在一定时间内的尿样，测定尿中S-MP/R-MP浓度比值，以S/R=0.95为临界线，S/R>0.95为慢代谢，S/R<0.95为快代谢[6]。或测定S-MP羟化指数(S-MP/4′-OH-MP，HI)，以lg HI值1.5为分型临界线，≥1.5为慢代谢[7]。由于测定羟化指数难区分非依从性EM和真正PM，以及尿样收集不完全、药物吸收不良引起的假PM等缺点，目前多采用S/R比值法进行表型分型测定。该探针的缺点是有些受试者对美芬妥英的镇静效应较为敏感，而且许多国家现已很少在临床上使用。
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事先经基因分型的6名健康志愿者单剂量口服100 mg苯妥英后，(R)-pHPPH 的36 h尿回收率在PMs中比EMs低3.5倍，而(S)-pHPPH在PMs中比EMs低1.3倍。(R)-pHPPH的尿回收率与口服20 mg奥美拉唑后3 hr的血浆代谢率显著相关。提示可以用(R)-pHPPH的尿回收率作为CYP2C19的分型指标[8]。
以口服100mg氯喹后在尿中的氯喹/环化氯喹浓度比为分型指标，在白人中的分型临界线为10[9]。
以口服20mg奥美拉唑后3hr时的血浆代谢率(奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑)作为分型指标，分型临界线为7[10]。而Tybring等指出，由于(+)-奥美拉唑主要经CYP2C19代谢，而(-)-奥美拉唑主要经CYP3A4代谢，少量经CYP2C19代谢。因此以血浆 (+)-奥美拉唑/(+)-5-羟基奥美拉唑作为CYP2C19分型指标则更具有专属性[11]。
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1.5 CYP2D6
在人肝P450中含量约2.5%，个体差异达1000倍，较为重要的底物有解热镇痛药、阿片类镇痛药、抗心律失常药、抗忧郁剂、中枢性兴奋剂、β受体阻滞剂等。其探针药物有金雀碱、异喹胍、右美沙芬、美托洛尔、普罗帕酮等。
111名土耳其志愿者采用自身比较，分别服用10mg异喹胍、100mg金雀碱、100mg美托洛尔、20mg右美沙芬四种探针药物，每种探针药物服用后至少经1周才能服用另一种探针药物。收集8 hr内的尿样，分别计算尿中母体药物/代谢产物浓度比(MR)，结果表明4种探针的MR相互之间有显著相关性，均可作为CYP2D6的探药[12]。
De Zeeuw等以右美沙芬为探针，利用薄层层析法(TLC)从71名志愿者中检出9名慢代谢者，并用HPLC法确认。尿液经β-葡醛苷酶处理、提取、TLC分离、显色后，以一系列不同浓度、右美沙芬/去甲右美沙芬浓度比固定为0.3的混合标准溶液作对照确定代谢表型。该法快速、简便、经济。也可以测定右美沙芬给药后2-5 h时单点血样或6 h时的唾液，以确定代谢表型[13]。
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口服100 mg美托洛尔后3 hr时的log[10MR](MR：血浆美托洛尔/α-羟基美托洛尔)也可以作为CYP2D6 的分型指标。该法与收集8hr内的尿药分型法显著相关。另外，在快代谢者中的S-美托洛尔的AUC比R型高35%，而在慢代谢者中却相反。提示还可用血浆美托洛尔S/R比例进行CYP2D6 的表型分型。
Latini等对长期接受普罗帕酮治疗(150mg,tid)的病人，则采用血药浓度达稳态时两次给药间隔期间尿中总的普罗帕酮/总的5-羟基普罗帕酮的浓度比(MR1)为分型指标进行代谢分型，认为该法比异喹胍分型更为实际可行，比以血浆代谢率普罗帕酮/5-羟基普罗帕酮(MR2)分型更为专属[14]。Botsch等用HPLC法测定尿中普罗帕酮葡醛苷量以进行代谢分型。在8名EMs中普罗帕酮葡醛苷量占给药量的15.4(5.6%，而在两名PMs中则为42.2%和51.6%。机制是普罗帕酮主要经CYP2D6介导的5-羟基化和葡醛化消除，PMs中5-羟基化反应弱，母体药物葡醛化消除量增加。故PMs尿中普罗帕酮葡醛苷量高于EMs。由于尿样收集不完全会得出错误的结论，所以Botsch等又提出以尿中5-羟基普罗帕酮葡醛苷/普罗帕酮葡醛苷为分型指标可能更为准确[15]。最近我们实验室的一项研究初步表明，可以利用尿样中普罗帕酮对映体浓度比来进行CYP2D6的表型分型。
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1.6 CYP2E1
在人肝P450中含量约7%，个体差异达20倍。它不仅参与药物代谢(氟烷、甲氧氟烷、安氟醚、七氟异丙甲醚等吸入含氟麻醉药、氯唑沙宗、扑热息痛)，还能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。因其活性存在明显的个体差异，故对不同个体的药物治疗作用和不良反应以及化学物质的毒性产生重要影响。
体外试验的探药有对硝基酚(4-羟化)、N-亚硝基双甲胺(去甲基化)。目前唯一对人体无损害的体内探药为氯唑沙宗(CZX)，因其90%经CYP2E1代谢生成6-羟基氯唑沙宗(HCZX)。分型指标为CZX/HCZX(MR)。口服250 mg或500 mg的CZX，2-4 h时的血浆MR能很好地反映CYP2E1的活性[16]。
1.7 NAT2(N-乙酰化转移酶)
白人N-乙酰化慢代谢发生率为50%，中国大陆人慢代谢发生率为25.6%，快代谢49.3%，中间代谢25.1%。其探针有咖啡因、异烟肼、氨苯酚、磺胺二甲嘧啶。
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服用一杯咖啡或浓茶或含咖啡因的软饮料，收集6 h尿样，求出5-乙酰胺基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶(AAMU)、1-甲基黄嘌呤(1X)、1-甲基尿酸(1U)浓度，以AAMU/(AAMU+1X+1U)为分型指标。性别、种族、吸烟、饮酒等对乙酰化分型无影响。
以异烟肼为探针，发现乙酰异烟肼/异烟肼(MR)呈三相分布，该分型结果与三种基因型(纯合子慢代谢者、杂合子快代谢者、纯合子快代谢者)完全相符。
2 “Cocktail”表型分型法
“Cocktail”法的概念：同时给予多种相对低剂量的探针药物，测定生物样本(尿、血浆、唾液)中每个探药的代谢率或其它代谢分型指标，以获取多个代谢酶的表型信息。因此对于那些有多重代谢途径而又均受遗传多态性控制的药物的剂量设计有极为重要的指导意义。该法省时经济，值得临床推广。但要求探药间无相互作用，而且对分析方法也提出更高的要求[17]。
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有两例足以说明“Cocktail”法的重要性。去甲阿米替林的代谢90%经CYP2D6介导，10%经CYP2C19和CYP1A2介导。这三种代谢酶均有遗传多态性。在CYP2D6慢代谢表型中，代谢主要依赖CYP2C19和CYP1A2。因此，CYP2C19和CYP1A2的表型直接决定去甲阿米替林的给药剂量[18]。应用“Cocktail”法事先分型则起到“一石三鸟”的作用。
普萘洛尔在美芬妥英慢代谢者和快代谢者中有近似的血浆清除率，这个药动学的奇怪现象后被“Cocktail”分型法所阐明。因为普萘洛尔经CYP2C19和CYP2D6代谢。CYP2C19的慢代谢速率恰好被CYP2D6的快代谢所弥补。若不熟悉它的代谢处置方式，只用某个探针进行代谢分型，可能会得出错误的给药方案。
胶束动电毛细管电泳法可从酶水解处理的尿样中同时测出美芬妥因、右美沙芬、咖啡因的主要代谢产物，可分别对CYP2C19、2D6和NAT2多态性进行分型[19]。
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单用或合用氨苯酚、美托洛尔、S-美芬妥英三种探药对104名印尼人进行NAT2、CYP2D6和CYP2C19的代谢分型。每种探针单用时代谢率与“Cocktail”法高度相关。结果发现N-乙酰化和S-美芬妥英4-羟化有表型分界线，而未检出美托洛尔α-羟化慢代谢者[20]。
40例无抽烟史的健康男性志愿者分别单用或合用5种探药(100 mg咖啡因、250 mg氯唑沙宗、 100 mg氨苯酚、10 mg异喹胍、100 mg美芬妥英)，考察8 hr内尿代谢率或4-8 hr的血浆代谢率，发现每种探药单用时的代谢率与“Cocktail”法的代谢率一致。提示5种探药无相互作用，可以用上述“Cocktail”法来进行CYP1A2、CYP2E1、NAT2、CYP2D6、CYP2C19的多态性分型[21]。但也有氯唑沙宗影响咖啡因表型分型的报道。16名健康志愿者口服140 mg咖啡因和500 mg氯唑沙宗，发现“Cocktail”法时CYP2E1的活性不受咖啡因的影响，而CYP1A2的活性却受氯唑沙宗的影响。咖啡因的尿代谢率下降16%，血浆代谢率下降20%，该结果被人肝微粒体孵育试验所证实[22]。
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3 代谢分型的影响因素
3.1 疾病
以咖啡因为探药，发现在HIV携带者和爱滋病人中，病情影响NAT2的基因表达水平，可以使原先快代谢表型转变为慢代谢表型[23]。以磺胺二甲嘧啶为探药，发现在有微血管障碍的II型糖尿病人中，慢乙酰化发生率显著高于无并发症的糖尿病人[24]。
47例肝病患者中有30名的奥美拉唑代谢率(奥美拉唑+奥美拉唑砜/5′-羟基奥美拉唑)大于分型临界值12，远远超出了3%的CYP2C19的慢代谢发生率。因此，只有受试者的肝功能好的情况下，才能以奥美拉唑为探药进行CYP2C19分型[25]。
13名肝移植病人的CYP2D6表型发生了改变，6名EMs变成了PMs，7名PMs变成了EMs。所有基因型发生改变的4例肝移植病人均伴有表型改变(2名EMs变成了PMs，2名PMs变成了EMs)。表明肝脏供体CYP2D6的基因型控制着受体的代谢表型[26]。
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肾功能减退能显著抑制6-羟基氯唑沙宗的清除。因此用氯唑沙宗作CYP2E1活性探药时必须要求受试者肾功能正常。肾功能不佳的病人用金雀碱和右美沙芬分别作表型分型试验，会得出两种不同CYP2D6活性的结论。金雀碱的代谢比与肌酐清除率无相关性，而右美沙芬的尿回收率与肌酐清除率有显著的相关性。故肾功能不佳病人的CYP2D6分型试验应选金雀碱为探药[27]。
3.2 并用药物
若病人在接受CYP2D6的底物或抑制剂治疗时，代谢分型试验尤应慎重。例如，心律失常病人在接受普罗帕酮治疗时，就不能以金雀碱或异喹胍作为CYP2D6表型探药。因为由于普罗帕酮与CYP2D6的高亲和力，金雀碱或异喹胍的代谢会被抑制，从而使EMs变成PMs，给出表型试验的错误结果。这种从EMs到PMs的转变称为Phenocopying。而接受美西律治疗的病人，并不影响分型结果。一名患严重忧郁症的病人经金雀碱分型试验列为PMs，但第二次试验时却变成了EMs。后来发现第一次表型试验时，该病人在偷偷地服用帕罗西汀(CYP2D6强抑制剂)，所以停用帕罗西汀后，表型发生了逆转。在服用镇痛药右丙氧芬(CYP2D6强抑制剂)的53名类风湿性关节炎病人中，异喹胍代谢率明显增加。
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以奥美拉唑为探药对110例无肝病但使用并用药物的白人住院病人进行CYP2C19分型试验，发现有20例为慢代谢，大大超过了白人3.3%的慢代谢发生率[25]。
在一项以咖啡因、美芬妥英、异喹胍、氯唑沙宗和氨苯酚为探针的“Cocktail”表型分型试验中，发现抗疟药氯喹能引起CYP2D6活性的下降，而对CYP1A2、2C19、2E1、NAT2的活性无影响[28]。
3.3 探药剂量
氯唑沙宗口服剂量为250、500mg时，2-4 h时的血浆代谢率(氯唑沙宗/6-羟基氯唑沙宗)能很好地反映CYP2E1的活性，但剂量超过750 mg时，其6-羟化代谢消除不再成线性，就不能用氯唑沙宗的6-羟化来反映CYP2E1的活性。这是第一个强调表型分型试验探药剂量重要性的报道[16]。
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3.4 样本处理方法
例如，在以美芬妥因S/R为分型指标的CYP2C19分型试验中，尿样储存时间可能对测定有影响[6]。Basci等在右美沙芬表型分型试验时对尿样未进行β-葡醛苷酶水解处理，并认为该法更为快速、可靠、灵敏。酶处理虽然并未改变右美沙芬在不同表型中的尿药浓度，但去甲右美沙芬在PMs中的尿药浓度增加了3.7倍，EMs中增加12.8倍。尿样未水解时右美沙芬/去甲右美沙芬为2.00，而水解后变为0.3。水解处理降低了表型分界值[29]。另外，尿样中可能存在的β-葡醛苷酶抑制剂会对表型分型有干扰[15]。
3.5 服药依从性
最好选用服用依从性好的探针药物，否则可能会引起一些假PMs。例如，103名津巴布韦人以异喹胍为探针检出2个PMs，以美托洛尔为探针检出5个PMs。对其中不相符合的3个PMs再进行基因分型，未检出有新的突变基因。可能是美托洛尔的服药依从性较差所引起。
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4 特殊个体的代谢分型
目前在特殊群体(儿童、老人、其他特殊生理病理条件或正在接受药物治疗的的受试者)中代谢分型的报道较少。而这些群体的代谢分型试验更具临床意义。
代谢分型试验的样本应视受试者的实际情况而灵活选用。例如，对于前列腺增生等排尿有困难或肾衰病人，应以唾液、血浆样本为妥。
对于正在接受药物治疗，停药不太现实时的病人，应选择合适的表型分型方案。像长期接受普罗帕酮治疗的病人、接受奥美拉唑治疗的胃溃疡病人、接受异烟肼治疗的肺结核病人最好选用该治疗药物为探药以进行CYP2D6、CYP2C19、NAT2的表型分型。由于三环类抗忧郁药不干扰右美沙芬的表型分型，因此接受这些药物治疗的病人可用右美沙芬作为CYP2D6的探药[30]。肝病不影响右美沙芬对CYP2D6的表型分型。在肝移植病人中的乙酰化分型，以AFMU/(AFMU+1X+1U) 为分型指标则比AFMU/1X更可信[31]。
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某些特殊受试者的分型临界线可用代谢酶抑制剂预处理的方法来求出。例如，100名接受血液透析的肾衰病人口服30mg氢溴酸右美沙芬胶囊后，收集3 h时的唾液，发现log[代谢率]呈单相分布，均为快代谢者。该结果经PCR基因分型所证实。其中9名病人再接受硫酸奎尼丁(20mg,Bid)预处理的表型分型试验，发现右美沙芬的代谢率显著增加。分型临界值33能很好地将奎尼丁预处理组与未处理组分开，该值能检出肾衰病人中的慢代谢者[32]。
5 基因分型与代谢分型比较
表型分型需要给予有药理活性的探药，这可能会引起一些伦理上的考虑。若其它CYP也参与探针药物的代谢，还可能使分型结果复杂化。而且代谢分型试验的影响因素也较多。但蛋白翻译后的酶活性改变只能通过代谢分型来反映，只有代谢分型才能100%地检出所有的慢代谢者[33]。
基因分型不需要服用探药，其结果也不受并用药物的影响。但如果存在尚未被发现的突变基因，则有可能得出错误结论。
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例如111名胃酸紊乱病人接受奥美拉唑分型试验，4名代谢率大于5，属于慢代谢者。其中两名基因分型也为慢代谢, 另两名基因分型为快代谢。提示还存在其它等位基因[34]。
在以美芬妥因S/R为分型指标的CYP2C19分型试验中，某些快代谢者尿中存在着酸不稳定代谢物，这些代谢物在尿中可分解再生成S-MP，使S/R比值升高，导致错判为PMs。所以若表型分型为慢代谢而基因分型却为快代谢，则应将该受试者的尿样进行酸化处理重新测定。若S/R比值不变，则说明是真PMs，而且提示存在未被检出的突变基因。若S/R比值明显升高，则可以确证为EM[6]。
基因分型研究的进展对代谢分型也提出更高的要求。例如，随着对CYP2D6多态性研究的不断深入，发现过去CYP2D6多态性分类为快代谢与慢代谢太过于粗犷。细致分类可有慢代谢、中间代谢、快代谢和超快代谢。特别是CYP2D6基因分型研究的逐步深入，已有越来越多的等位基因的报道。不同的等位基因可产生不同活性的酶蛋白。利用右美沙芬MR进行代谢分型用于区分CYP2D6快、慢代谢者已很理想，但对快代谢者之间区分较困难。原因是母体药物右美沙芬在尿样中的测定灵敏度不够高。通过提高样本浓缩度和增加HPLC进样量，并提高检测灵敏度，可以成功地区分纯合子快代谢者与杂合子快代谢者之间的代谢率差异[35]。
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50名HIV携带者和爱滋病患者的基因分型结果为26:24(慢代谢:快代谢)，与表型分型有18例不相符合。12 例慢乙酰化表型的基因分型为快代谢，6例快乙酰化表型的基因分型为慢代谢。在基因分型为快代谢的慢乙酰化表型中，爱滋病发生率比两种分型均为快代谢的高[23]。该例说明基因分型与表型分型试验应有机地结合起来，这样才能指导疾病预防和合理用药。
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收稿日期：1999-12-07, 百拇医药
单位：周权(浙江大学医学院附属二院 杭州 310009)；姚彤炜 曾苏(浙江大学药学院药物代谢与药物分析研究室 杭州 310031)
关键词：代谢；遗传多态性；代谢分型；基因分型
中国现代应用药学000601 摘要 目的：为了促进药物代谢分型研究在临床上的深入。方法：综述近几年具遗传多态性代谢酶的探针药物、代谢分型方法以及影响因素。介绍“Cocktail”分型法。比较代谢分型与基因分型两种分型方法。结果：疾病、并用药物、探药剂量、样本处理方法、服药依从性是代谢分型的主要影响因素。结论：药物代谢分型能指导临床安全合理有效地用药。基因分型与代谢分型各有优缺点，应灵活应用。“Cocktail”分型方法具有独特的优越性和发展前景。应大力开展在特殊群体中的代谢分型研究。
The advancement in phenotyping study of drug metabolism
, 百拇医药
Zhou Quan(Zhou Q),Yao Tongwei(Yao TW),Zeng Su(Zeng S)
(The Second Hospital Affiliated to College of Medicinal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
ABSTRACT OBJECTIVE：To promote the phenotyping study in clinical practise.METHOD:The probe drugs of drug metabolism、methods of phenotype and related factors were reviewed.The “Cocktail” strategy was described the methods of phenotyping genotyping was compared.RESULTS:Disease,coadministration,probe dosage,sample treatment and compliance are the main factors affecting phenotyping.CONCLUSION:Phenotyping will help provide a safe、rational and effectual prescription.Pros and cons exist in phenotyping as well as in genotyping.The “Cocktail” strategy has sepecial advantages.Phenotyping study in special individuals should be enhanced.
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KEY WORDS metabolism,polymorphism,phenotyping,genotyping
若药物代谢酶具有遗传多态性(Genetic polymorphism)，则会造成药物个体作用差异。对于治疗范围狭窄的药物，则可能出现疗效不佳或毒副作用。用选择性的探针药物(Probe drug)来确定病人的代谢表型(Phenotype)，区分快代谢型(Extensive metabolizer,EM)和慢代谢型(Poor metabolizer,PM)，以指导临床安全合理有效地用药，正是药物代谢分型研究的主要内容。目前国内的药物代谢分型研究多侧重于健康志愿者的分型，真正应用于临床还几乎是空白。医生很少考虑表型与处方剂量之间的关系。本文综述药物代谢分型研究的方法进展、影响因素以及与基因分型的比较，以说明代谢分型研究在临床上的可行性和重要性。
1 具遗传多态性代谢酶的探针药物
, 百拇医药 1.1 CYP1A2
在人肝P450中其含量约13%，个体差异有40倍。在毒理学上对一些前致癌物的代谢激活有重要的意义，膀胱癌和直肠癌发病率的差异与CYP1A2的多态性有关。在药物代谢中CYP1A2的底物有局麻药利多卡因、解热镇痛药(对乙酰氨基酚、非那西丁、萘普生)、抗心律失常药(美西律、普罗帕酮)、一些三环、四环类抗忧郁药、抗肿瘤药(futamide、三苯氧胺)、咖啡因、β受体阻滞剂等。
常用咖啡因作为CYP1A2多态性的探针药物。方法有13C咖啡因呼吸试验、尿代谢物比、血浆或唾液中1,7-二甲黄嘌呤/咖啡因浓度比。最新研究表明用前两种方法来估计CYP1A2的活性不够准确。这主要是因为咖啡因代谢的复杂性及影响每个代谢产物肾清除因素的多样性。统计200多名志愿者的5种代谢率，结果没有一项两两相关。而利用给药后5-7 hr时在血浆或唾液中1,7-二甲黄嘌呤/咖啡因浓度比能很好地反映CYP1A2的活性，其比例与咖啡因的系统清除率高度相关。该法只需单点取样，故快速、简便、经济。表型分型结果被肝切除术后的基因分型所证实[1]。
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1.2 CYP2A6
在人肝P450中含量约4%，个体差异30-100倍。人群慢代谢发生率小于2%，它催化一些药物如挥发性麻醉剂的脱氟反应、精神安定药的S-氧化、环磷酰胺的C4-羟化、1,7-二甲黄嘌呤的C8-羟化等。
香豆素C7-羟化可作为CYP2A6的体内外探针。血小板活化因子受体拮抗剂SM12502主要经CYP2A6代谢(S-氧化)，以它为探针从28名健康日本志愿者中检出三例慢代谢者。PCR-RPLC分析发现这三例CYP2A6的等位基因缺少外显子1、8、9[2]。
1.3 CYP2C9
CYP2C亚族在人肝P450中含量约18%，其中以CYP2C9含量最多。主要经CYP2C9代谢的药物有甲苯磺丁脲、洛沙坦、苯妥因、S-华法林、氟伐他丁及一些非甾体类抗炎药(如双氯灭酸、布洛芬)等。
, 百拇医药
抑制试验和利用转基因细胞的酶学表征试验证明，非甾体类抗炎药氟比洛芬的主要氧化代谢途径(4'-羟化反应)只有CYP2C9参与，而CYP1A1、 2A6、 2B6、 2C19、2D6 对该反应均无贡献。由于CYP2C9和CYP 2C19有80%的同源性，因此氟比洛芬无疑是CYP2C9多态性的专属性探针底物[3]。
口服300 mg单剂量苯妥英后12 hr时苯妥英的平均血清浓度可以作为CYP2C9多态性的分型指标。在CYP2C9*1/1基因型中为4.16 mg.ml-1(3.86-4.46), CYP2C9*1/2 中为5.52 mg.ml-1(4.66-6.39)，CYP2C9*1/3中为5.65 mg.ml-1(4.86-6.43)。而且基因分型为CYP2C9*1/1的平均5-(对-羟基苯基)-5-苯基乙内酰脲/苯妥英浓度比(p-HPPH/P)为0.43(0.39-0.47)，CYP2C9*1/2为0.26 (0.21-0.31)，CYP2C9*2/2为0.14(0.13-0.14)，CYP2C9*1/3为0.21(0.18-0.24)，CYP2C9*3/3为0.02，所有突变型的p-HPPH/P均显著低于CYP2C9*1/1。因此若以p-HPPH/P为CYP2C9分型指标则更具专属性[4]。
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一名对华法林治疗极为敏感的病人基因分型为CYP2C9*3/3，其血浆中华法林对映体的浓度比S/R为3.9:1，而在能耐受4-8 mg/d华法林治疗的病人中，S/R为0.50±0.25∶1，提示可以用血浆S/R为指标来替代基因分型法检出CYP2C9*3/3型慢代谢者[5]。
1.4 CYP2C19
个体差异达100倍，白人中CYP2C19慢代谢发生率为5%，东方人为23%。一些重要的底物有β受体阻滞剂、抗忧郁药、精神安定药、质子泵抑制剂等，因此其多态性的临床意义较为重要。其代谢分型的探针有美芬妥英、苯妥英、氯喹、奥美拉唑。
口服单剂量美芬妥英(MP)后，收集服药后在一定时间内的尿样，测定尿中S-MP/R-MP浓度比值，以S/R=0.95为临界线，S/R>0.95为慢代谢，S/R<0.95为快代谢[6]。或测定S-MP羟化指数(S-MP/4′-OH-MP，HI)，以lg HI值1.5为分型临界线，≥1.5为慢代谢[7]。由于测定羟化指数难区分非依从性EM和真正PM，以及尿样收集不完全、药物吸收不良引起的假PM等缺点，目前多采用S/R比值法进行表型分型测定。该探针的缺点是有些受试者对美芬妥英的镇静效应较为敏感，而且许多国家现已很少在临床上使用。
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事先经基因分型的6名健康志愿者单剂量口服100 mg苯妥英后，(R)-pHPPH 的36 h尿回收率在PMs中比EMs低3.5倍，而(S)-pHPPH在PMs中比EMs低1.3倍。(R)-pHPPH的尿回收率与口服20 mg奥美拉唑后3 hr的血浆代谢率显著相关。提示可以用(R)-pHPPH的尿回收率作为CYP2C19的分型指标[8]。
以口服100mg氯喹后在尿中的氯喹/环化氯喹浓度比为分型指标，在白人中的分型临界线为10[9]。
以口服20mg奥美拉唑后3hr时的血浆代谢率(奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑)作为分型指标，分型临界线为7[10]。而Tybring等指出，由于(+)-奥美拉唑主要经CYP2C19代谢，而(-)-奥美拉唑主要经CYP3A4代谢，少量经CYP2C19代谢。因此以血浆 (+)-奥美拉唑/(+)-5-羟基奥美拉唑作为CYP2C19分型指标则更具有专属性[11]。
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1.5 CYP2D6
在人肝P450中含量约2.5%，个体差异达1000倍，较为重要的底物有解热镇痛药、阿片类镇痛药、抗心律失常药、抗忧郁剂、中枢性兴奋剂、β受体阻滞剂等。其探针药物有金雀碱、异喹胍、右美沙芬、美托洛尔、普罗帕酮等。
111名土耳其志愿者采用自身比较，分别服用10mg异喹胍、100mg金雀碱、100mg美托洛尔、20mg右美沙芬四种探针药物，每种探针药物服用后至少经1周才能服用另一种探针药物。收集8 hr内的尿样，分别计算尿中母体药物/代谢产物浓度比(MR)，结果表明4种探针的MR相互之间有显著相关性，均可作为CYP2D6的探药[12]。
De Zeeuw等以右美沙芬为探针，利用薄层层析法(TLC)从71名志愿者中检出9名慢代谢者，并用HPLC法确认。尿液经β-葡醛苷酶处理、提取、TLC分离、显色后，以一系列不同浓度、右美沙芬/去甲右美沙芬浓度比固定为0.3的混合标准溶液作对照确定代谢表型。该法快速、简便、经济。也可以测定右美沙芬给药后2-5 h时单点血样或6 h时的唾液，以确定代谢表型[13]。
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口服100 mg美托洛尔后3 hr时的log[10MR](MR：血浆美托洛尔/α-羟基美托洛尔)也可以作为CYP2D6 的分型指标。该法与收集8hr内的尿药分型法显著相关。另外，在快代谢者中的S-美托洛尔的AUC比R型高35%，而在慢代谢者中却相反。提示还可用血浆美托洛尔S/R比例进行CYP2D6 的表型分型。
Latini等对长期接受普罗帕酮治疗(150mg,tid)的病人，则采用血药浓度达稳态时两次给药间隔期间尿中总的普罗帕酮/总的5-羟基普罗帕酮的浓度比(MR1)为分型指标进行代谢分型，认为该法比异喹胍分型更为实际可行，比以血浆代谢率普罗帕酮/5-羟基普罗帕酮(MR2)分型更为专属[14]。Botsch等用HPLC法测定尿中普罗帕酮葡醛苷量以进行代谢分型。在8名EMs中普罗帕酮葡醛苷量占给药量的15.4(5.6%，而在两名PMs中则为42.2%和51.6%。机制是普罗帕酮主要经CYP2D6介导的5-羟基化和葡醛化消除，PMs中5-羟基化反应弱，母体药物葡醛化消除量增加。故PMs尿中普罗帕酮葡醛苷量高于EMs。由于尿样收集不完全会得出错误的结论，所以Botsch等又提出以尿中5-羟基普罗帕酮葡醛苷/普罗帕酮葡醛苷为分型指标可能更为准确[15]。最近我们实验室的一项研究初步表明，可以利用尿样中普罗帕酮对映体浓度比来进行CYP2D6的表型分型。
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1.6 CYP2E1
在人肝P450中含量约7%，个体差异达20倍。它不仅参与药物代谢(氟烷、甲氧氟烷、安氟醚、七氟异丙甲醚等吸入含氟麻醉药、氯唑沙宗、扑热息痛)，还能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。因其活性存在明显的个体差异，故对不同个体的药物治疗作用和不良反应以及化学物质的毒性产生重要影响。
体外试验的探药有对硝基酚(4-羟化)、N-亚硝基双甲胺(去甲基化)。目前唯一对人体无损害的体内探药为氯唑沙宗(CZX)，因其90%经CYP2E1代谢生成6-羟基氯唑沙宗(HCZX)。分型指标为CZX/HCZX(MR)。口服250 mg或500 mg的CZX，2-4 h时的血浆MR能很好地反映CYP2E1的活性[16]。
1.7 NAT2(N-乙酰化转移酶)
白人N-乙酰化慢代谢发生率为50%，中国大陆人慢代谢发生率为25.6%，快代谢49.3%，中间代谢25.1%。其探针有咖啡因、异烟肼、氨苯酚、磺胺二甲嘧啶。
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服用一杯咖啡或浓茶或含咖啡因的软饮料，收集6 h尿样，求出5-乙酰胺基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶(AAMU)、1-甲基黄嘌呤(1X)、1-甲基尿酸(1U)浓度，以AAMU/(AAMU+1X+1U)为分型指标。性别、种族、吸烟、饮酒等对乙酰化分型无影响。
以异烟肼为探针，发现乙酰异烟肼/异烟肼(MR)呈三相分布，该分型结果与三种基因型(纯合子慢代谢者、杂合子快代谢者、纯合子快代谢者)完全相符。
2 “Cocktail”表型分型法
“Cocktail”法的概念：同时给予多种相对低剂量的探针药物，测定生物样本(尿、血浆、唾液)中每个探药的代谢率或其它代谢分型指标，以获取多个代谢酶的表型信息。因此对于那些有多重代谢途径而又均受遗传多态性控制的药物的剂量设计有极为重要的指导意义。该法省时经济，值得临床推广。但要求探药间无相互作用，而且对分析方法也提出更高的要求[17]。
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有两例足以说明“Cocktail”法的重要性。去甲阿米替林的代谢90%经CYP2D6介导，10%经CYP2C19和CYP1A2介导。这三种代谢酶均有遗传多态性。在CYP2D6慢代谢表型中，代谢主要依赖CYP2C19和CYP1A2。因此，CYP2C19和CYP1A2的表型直接决定去甲阿米替林的给药剂量[18]。应用“Cocktail”法事先分型则起到“一石三鸟”的作用。
普萘洛尔在美芬妥英慢代谢者和快代谢者中有近似的血浆清除率，这个药动学的奇怪现象后被“Cocktail”分型法所阐明。因为普萘洛尔经CYP2C19和CYP2D6代谢。CYP2C19的慢代谢速率恰好被CYP2D6的快代谢所弥补。若不熟悉它的代谢处置方式，只用某个探针进行代谢分型，可能会得出错误的给药方案。
胶束动电毛细管电泳法可从酶水解处理的尿样中同时测出美芬妥因、右美沙芬、咖啡因的主要代谢产物，可分别对CYP2C19、2D6和NAT2多态性进行分型[19]。
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单用或合用氨苯酚、美托洛尔、S-美芬妥英三种探药对104名印尼人进行NAT2、CYP2D6和CYP2C19的代谢分型。每种探针单用时代谢率与“Cocktail”法高度相关。结果发现N-乙酰化和S-美芬妥英4-羟化有表型分界线，而未检出美托洛尔α-羟化慢代谢者[20]。
40例无抽烟史的健康男性志愿者分别单用或合用5种探药(100 mg咖啡因、250 mg氯唑沙宗、 100 mg氨苯酚、10 mg异喹胍、100 mg美芬妥英)，考察8 hr内尿代谢率或4-8 hr的血浆代谢率，发现每种探药单用时的代谢率与“Cocktail”法的代谢率一致。提示5种探药无相互作用，可以用上述“Cocktail”法来进行CYP1A2、CYP2E1、NAT2、CYP2D6、CYP2C19的多态性分型[21]。但也有氯唑沙宗影响咖啡因表型分型的报道。16名健康志愿者口服140 mg咖啡因和500 mg氯唑沙宗，发现“Cocktail”法时CYP2E1的活性不受咖啡因的影响，而CYP1A2的活性却受氯唑沙宗的影响。咖啡因的尿代谢率下降16%，血浆代谢率下降20%，该结果被人肝微粒体孵育试验所证实[22]。
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3 代谢分型的影响因素
3.1 疾病
以咖啡因为探药，发现在HIV携带者和爱滋病人中，病情影响NAT2的基因表达水平，可以使原先快代谢表型转变为慢代谢表型[23]。以磺胺二甲嘧啶为探药，发现在有微血管障碍的II型糖尿病人中，慢乙酰化发生率显著高于无并发症的糖尿病人[24]。
47例肝病患者中有30名的奥美拉唑代谢率(奥美拉唑+奥美拉唑砜/5′-羟基奥美拉唑)大于分型临界值12，远远超出了3%的CYP2C19的慢代谢发生率。因此，只有受试者的肝功能好的情况下，才能以奥美拉唑为探药进行CYP2C19分型[25]。
13名肝移植病人的CYP2D6表型发生了改变，6名EMs变成了PMs，7名PMs变成了EMs。所有基因型发生改变的4例肝移植病人均伴有表型改变(2名EMs变成了PMs，2名PMs变成了EMs)。表明肝脏供体CYP2D6的基因型控制着受体的代谢表型[26]。
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肾功能减退能显著抑制6-羟基氯唑沙宗的清除。因此用氯唑沙宗作CYP2E1活性探药时必须要求受试者肾功能正常。肾功能不佳的病人用金雀碱和右美沙芬分别作表型分型试验，会得出两种不同CYP2D6活性的结论。金雀碱的代谢比与肌酐清除率无相关性，而右美沙芬的尿回收率与肌酐清除率有显著的相关性。故肾功能不佳病人的CYP2D6分型试验应选金雀碱为探药[27]。
3.2 并用药物
若病人在接受CYP2D6的底物或抑制剂治疗时，代谢分型试验尤应慎重。例如，心律失常病人在接受普罗帕酮治疗时，就不能以金雀碱或异喹胍作为CYP2D6表型探药。因为由于普罗帕酮与CYP2D6的高亲和力，金雀碱或异喹胍的代谢会被抑制，从而使EMs变成PMs，给出表型试验的错误结果。这种从EMs到PMs的转变称为Phenocopying。而接受美西律治疗的病人，并不影响分型结果。一名患严重忧郁症的病人经金雀碱分型试验列为PMs，但第二次试验时却变成了EMs。后来发现第一次表型试验时，该病人在偷偷地服用帕罗西汀(CYP2D6强抑制剂)，所以停用帕罗西汀后，表型发生了逆转。在服用镇痛药右丙氧芬(CYP2D6强抑制剂)的53名类风湿性关节炎病人中，异喹胍代谢率明显增加。
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以奥美拉唑为探药对110例无肝病但使用并用药物的白人住院病人进行CYP2C19分型试验，发现有20例为慢代谢，大大超过了白人3.3%的慢代谢发生率[25]。
在一项以咖啡因、美芬妥英、异喹胍、氯唑沙宗和氨苯酚为探针的“Cocktail”表型分型试验中，发现抗疟药氯喹能引起CYP2D6活性的下降，而对CYP1A2、2C19、2E1、NAT2的活性无影响[28]。
3.3 探药剂量
氯唑沙宗口服剂量为250、500mg时，2-4 h时的血浆代谢率(氯唑沙宗/6-羟基氯唑沙宗)能很好地反映CYP2E1的活性，但剂量超过750 mg时，其6-羟化代谢消除不再成线性，就不能用氯唑沙宗的6-羟化来反映CYP2E1的活性。这是第一个强调表型分型试验探药剂量重要性的报道[16]。
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3.4 样本处理方法
例如，在以美芬妥因S/R为分型指标的CYP2C19分型试验中，尿样储存时间可能对测定有影响[6]。Basci等在右美沙芬表型分型试验时对尿样未进行β-葡醛苷酶水解处理，并认为该法更为快速、可靠、灵敏。酶处理虽然并未改变右美沙芬在不同表型中的尿药浓度，但去甲右美沙芬在PMs中的尿药浓度增加了3.7倍，EMs中增加12.8倍。尿样未水解时右美沙芬/去甲右美沙芬为2.00，而水解后变为0.3。水解处理降低了表型分界值[29]。另外，尿样中可能存在的β-葡醛苷酶抑制剂会对表型分型有干扰[15]。
3.5 服药依从性
最好选用服用依从性好的探针药物，否则可能会引起一些假PMs。例如，103名津巴布韦人以异喹胍为探针检出2个PMs，以美托洛尔为探针检出5个PMs。对其中不相符合的3个PMs再进行基因分型，未检出有新的突变基因。可能是美托洛尔的服药依从性较差所引起。
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4 特殊个体的代谢分型
目前在特殊群体(儿童、老人、其他特殊生理病理条件或正在接受药物治疗的的受试者)中代谢分型的报道较少。而这些群体的代谢分型试验更具临床意义。
代谢分型试验的样本应视受试者的实际情况而灵活选用。例如，对于前列腺增生等排尿有困难或肾衰病人，应以唾液、血浆样本为妥。
对于正在接受药物治疗，停药不太现实时的病人，应选择合适的表型分型方案。像长期接受普罗帕酮治疗的病人、接受奥美拉唑治疗的胃溃疡病人、接受异烟肼治疗的肺结核病人最好选用该治疗药物为探药以进行CYP2D6、CYP2C19、NAT2的表型分型。由于三环类抗忧郁药不干扰右美沙芬的表型分型，因此接受这些药物治疗的病人可用右美沙芬作为CYP2D6的探药[30]。肝病不影响右美沙芬对CYP2D6的表型分型。在肝移植病人中的乙酰化分型，以AFMU/(AFMU+1X+1U) 为分型指标则比AFMU/1X更可信[31]。
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某些特殊受试者的分型临界线可用代谢酶抑制剂预处理的方法来求出。例如，100名接受血液透析的肾衰病人口服30mg氢溴酸右美沙芬胶囊后，收集3 h时的唾液，发现log[代谢率]呈单相分布，均为快代谢者。该结果经PCR基因分型所证实。其中9名病人再接受硫酸奎尼丁(20mg,Bid)预处理的表型分型试验，发现右美沙芬的代谢率显著增加。分型临界值33能很好地将奎尼丁预处理组与未处理组分开，该值能检出肾衰病人中的慢代谢者[32]。
5 基因分型与代谢分型比较
表型分型需要给予有药理活性的探药，这可能会引起一些伦理上的考虑。若其它CYP也参与探针药物的代谢，还可能使分型结果复杂化。而且代谢分型试验的影响因素也较多。但蛋白翻译后的酶活性改变只能通过代谢分型来反映，只有代谢分型才能100%地检出所有的慢代谢者[33]。
基因分型不需要服用探药，其结果也不受并用药物的影响。但如果存在尚未被发现的突变基因，则有可能得出错误结论。
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例如111名胃酸紊乱病人接受奥美拉唑分型试验，4名代谢率大于5，属于慢代谢者。其中两名基因分型也为慢代谢, 另两名基因分型为快代谢。提示还存在其它等位基因[34]。
在以美芬妥因S/R为分型指标的CYP2C19分型试验中，某些快代谢者尿中存在着酸不稳定代谢物，这些代谢物在尿中可分解再生成S-MP，使S/R比值升高，导致错判为PMs。所以若表型分型为慢代谢而基因分型却为快代谢，则应将该受试者的尿样进行酸化处理重新测定。若S/R比值不变，则说明是真PMs，而且提示存在未被检出的突变基因。若S/R比值明显升高，则可以确证为EM[6]。
基因分型研究的进展对代谢分型也提出更高的要求。例如，随着对CYP2D6多态性研究的不断深入，发现过去CYP2D6多态性分类为快代谢与慢代谢太过于粗犷。细致分类可有慢代谢、中间代谢、快代谢和超快代谢。特别是CYP2D6基因分型研究的逐步深入，已有越来越多的等位基因的报道。不同的等位基因可产生不同活性的酶蛋白。利用右美沙芬MR进行代谢分型用于区分CYP2D6快、慢代谢者已很理想，但对快代谢者之间区分较困难。原因是母体药物右美沙芬在尿样中的测定灵敏度不够高。通过提高样本浓缩度和增加HPLC进样量，并提高检测灵敏度，可以成功地区分纯合子快代谢者与杂合子快代谢者之间的代谢率差异[35]。
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50名HIV携带者和爱滋病患者的基因分型结果为26:24(慢代谢:快代谢)，与表型分型有18例不相符合。12 例慢乙酰化表型的基因分型为快代谢，6例快乙酰化表型的基因分型为慢代谢。在基因分型为快代谢的慢乙酰化表型中，爱滋病发生率比两种分型均为快代谢的高[23]。该例说明基因分型与表型分型试验应有机地结合起来，这样才能指导疾病预防和合理用药。
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收稿日期：1999-12-07, 百拇医药