深低温停循环间断灌注脑保护液对大脑皮层组织一氧化氮化氮合酶的影响
作者：罗国华 吴清玉 孙立忠
单位：中国医学科学院心血管病研究所，中国协和医科大学阜外医院，北京，100037
关键词：深低温停循环；脑保护液；一氧化氮
苏州医学院学报000609 摘要 目的 研究深低温停循环(DHCA)下间断灌注充氧脑保护液对大脑皮层组织一氧化氮合酶(NOS)的影响。方法 10条健康杂种犬随机分为两组，A组单纯DHCA 120min，B组DHCA后经双侧颈动脉间断灌注充氧脑保护液。两组动物于不同时相取大脑皮层组织测其NOS的活性。结果 DHCA 120min及恢复循环45min后，A组大脑皮层组织NOS阳性神经细胞的数量明显多于CPB前(P<0.05及P<0.01)，B组变化不明显(P>0.05)。结论 DHCA间断灌注充氧脑保护液抑制大脑皮层组织NOS的活性，减少大脑皮层组织一氧化氮(NO)的过量合成。
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中图法分类号 R654.1
The Effect of Intermittent Cerebroplegia Perfusion on Nitric Oxide Synthase
in Cerebral Cortex during Deep Hypothermic Circulatory Arrest
Luo Guohua, Wu Qingyu, Sun lizhong
(Department of Surgery,Cardiovascular Institute & FuWai Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing,100037)
, 百拇医药
Abstract Objective To study the effect of intermittent oxygenated cerebroplegia perfusion on nitric oxide synthase (NOS) in cerebral cortex during deep hypothermic circulatory arrest (DHCA).Methods Ten mongrel dogs were divided into group A and group B.The animals in group A (N=5) were submitted DHCA only and the animals in group B (n=5) received oxygnated cerebralplegia perfusioh through the bilateral common carotid arteries during DHCA. Cerebral cortex was collected to study NOS at different time points.Results The number of NOS-positive neuron at 120 minutes of DHCA and at 45 minutes of reperfusion were greater significantly than that before cardiopulmonary bypass (CPB)(P<0.05 anb P<0.01 respectively)in group A and those changes did not take place in group B.Conclusions Intermittent oxygenated cerebroplegia perfusion during DHCA can inhibit the activity of NOS,reduce the excessive synthesis of nitric oxide within the cerebral cortex.
, 百拇医药
Key words hypothermic circulatory arrest;cerebroplegia；nitric oxide
DHCA脑损伤的机制复杂，本研究观察了DHCA下间断灌注充氧脑保护液对大脑皮层组织一氧化氮合酶的影响，现报道如下。
1 材料、方法与结果
1.1 实验动物及分组 健康杂种犬10条，随机分成两组，A组单纯DHCA；B组DHCA后，经双侧颈动脉间断灌注脑保护液。
1.2 实验模型 犬静脉注射2.5%硫喷妥钠30mg/kg，安定5mg/kg进行麻醉后，气管内插管，机械通气。右侧第4肋间进胸，升主动脉及右心房插管建立CPB。降温至鼻咽温18℃时DHCA，A组于此条件DHCA 120min。B组DHCA后，经预先放置插管的双侧颈动脉灌注4℃的充氧脑保护液。脑保护液的主要成份为葡萄糖25g，氯化钠4.5g，甘露醇12.5g，碳酸氢钠22mmol，利多卡因200mg，硝酸甘油0.5mg，加注射用水至100ml。在室温下用3L/min的氧流量对上述液体预吹30min。其pH值为7.67，二氧化碳分压13mmHg，氧分压760mmHg，渗透压332毫渗量。灌注压为60～100mmHg，灌注量为25ml/kg,以后每隔30min灌注1次，灌注量为12.5ml/kg。DHCA 120min后恢复循环并复温。45min恢复到鼻咽温36℃左右。
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1.3 大脑皮层组织NOS的显示 两组分别于CPB前，DHCA 120min后及恢复循环45min后经颅顶开窗部位迅速取大脑皮层组织置于4℃、4%多聚甲醛溶液中。采用还原型尼克酰胺二磷酸腺甘脱氢酶(NADPH)组织化学法显示大脑皮层组织NOS阳性神经细胞。大脑皮层组织切片厚度40μm，贴于经明胶预处理过的载玻片上，在NADPH 10mg，硝基四氮唑蓝(NBT)3mg，30%Triton x-100 100μl，加0.1mol/L PBS至10ml的溶液中，37℃下孵育120min，常规脱水，透明，封片，Olympus显微镜下观察、分析。
1.4 统计学处理 各组数据均用
±s表示，组内比较用自身t检验，组间比较用配对t检验。
1.5 结果 两组动物CPB前大脑皮层组织NOS阳性神经细胞数较少，分布散在。DHCA 120min后，A组大脑皮层组织NOS阳性神经细胞数明显多于CPB前(P<0.05)，恢复循环45min后，其数量进一步增多，明显多于DHCA 120min后(P<0.01)。B组DHCA 120 min及恢复循环45min后，NOS阳性神经细胞数均无明显增多(P>0.05)。见附表。
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附表 两组动物不同时相大脑皮层组织NOS阳性
神经细胞数(个/低倍视野，×25倍)
A组
B组
CPB前
3.4±0.6
3.2±0.8
DHCA后
7.8±1.3*
5.4±0.6
复灌45min后
12.4±1.7**
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5.4±1.1
*与CPB前比，P<0.05；**与DHCA120min比，P<0.01
2 讨论
NO是一种自由基气体，其半衰期极短，难以直接检测，通常利用NO的化学性质，测定其终末代谢产物亚硝酸盐的含量或测定NOS的活性间接反映组织细胞内NO的含量。本实验采用NADPH染色法测定大脑皮层组织NOS的活性来间接反应其NO的含量。实验结果表明，正常情况下犬大脑皮层组织NOS阳性细胞散在分布，数目较少，与文献[1]报告的结果一致。A组DHCA 120min后，大脑皮层组织NOS阳性细胞数明显增加，恢复循环45min后，其数量进一步增多，明显多于DHCA 120min后，B组DHCA 120min及恢复循环45min后，大脑皮层组织NOS阳性细胞数仅轻度增加，无统计学意义。Segawa等用犬作实验时发现，DHCA 90min再灌注120min后，脑组织NO水平的升高不仅发生在停循环期间，而且发生在再灌注期间。再灌注120min后，NO的水平较体外循环前明显升高。应用NOS抑制剂，能明显减轻DHCA后脑组织的再灌注损伤，促进体觉诱发电位(SEP)的恢复[2]。我们推测，单纯DHCA组NOS活性增加的原因可能是：(1)脑组织内谷氨酸等兴奋性氨基酸增多，它们作用于细胞膜上的NMDA受体，引起钙离子细胞内流，细胞内钙离子达到一定浓度时便激活了NOS[3]；(2)NOS磷酸化时，其活性下降。单纯DHCA时，脑组织内ATP减少，NOS去磷酸化，因此，NOS的活性增加[1]。DHCA间断灌注充氧脑保护液时，脑保护液中氧气部分满足了低温状态下脑组织的代谢需要，提高了大脑皮层组织ATP的含量，冲走了各种代谢产物，从而使NOS的活性升高不明显。
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DHCA间断灌注充氧脑保护液能够抑制大脑皮层组织NOS的活性，减少大脑皮层组织NO的过量合成。
参考文献
[1] Faraci FM,Brain JE.Nitric Oxide and cerebral ciculation.Stroke,1994，25∶692
[2] Segawa D,Hatori N,Yoshizu H,et al.The effect of nitric oxide synthase inhibitor on reperfusion injury of the brain under hypothermic circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115∶925
[3] Bredt DS,Glatt CE,Hwang PM,et al.Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in neuronal populations of the mamalian CNS together with NADPH diaphorase.Neuron,1991,7∶615
[4] Bred1 DS,Ferris CD,Snyder SH.Nitric oxide synthase regulatory siles∶phosphorylation bycyclic AMP dependent protein kinase,protein kinase C,and calcium/calmoudlin binding sites.J Biol Chem,1992,267∶10976
(1999年12月9日收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院心血管病研究所，中国协和医科大学阜外医院，北京，100037
关键词：深低温停循环；脑保护液；一氧化氮
苏州医学院学报000609 摘要 目的 研究深低温停循环(DHCA)下间断灌注充氧脑保护液对大脑皮层组织一氧化氮合酶(NOS)的影响。方法 10条健康杂种犬随机分为两组，A组单纯DHCA 120min，B组DHCA后经双侧颈动脉间断灌注充氧脑保护液。两组动物于不同时相取大脑皮层组织测其NOS的活性。结果 DHCA 120min及恢复循环45min后，A组大脑皮层组织NOS阳性神经细胞的数量明显多于CPB前(P<0.05及P<0.01)，B组变化不明显(P>0.05)。结论 DHCA间断灌注充氧脑保护液抑制大脑皮层组织NOS的活性，减少大脑皮层组织一氧化氮(NO)的过量合成。
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中图法分类号 R654.1
The Effect of Intermittent Cerebroplegia Perfusion on Nitric Oxide Synthase
in Cerebral Cortex during Deep Hypothermic Circulatory Arrest
Luo Guohua, Wu Qingyu, Sun lizhong
(Department of Surgery,Cardiovascular Institute & FuWai Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing,100037)
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Abstract Objective To study the effect of intermittent oxygenated cerebroplegia perfusion on nitric oxide synthase (NOS) in cerebral cortex during deep hypothermic circulatory arrest (DHCA).Methods Ten mongrel dogs were divided into group A and group B.The animals in group A (N=5) were submitted DHCA only and the animals in group B (n=5) received oxygnated cerebralplegia perfusioh through the bilateral common carotid arteries during DHCA. Cerebral cortex was collected to study NOS at different time points.Results The number of NOS-positive neuron at 120 minutes of DHCA and at 45 minutes of reperfusion were greater significantly than that before cardiopulmonary bypass (CPB)(P<0.05 anb P<0.01 respectively)in group A and those changes did not take place in group B.Conclusions Intermittent oxygenated cerebroplegia perfusion during DHCA can inhibit the activity of NOS,reduce the excessive synthesis of nitric oxide within the cerebral cortex.
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Key words hypothermic circulatory arrest;cerebroplegia；nitric oxide
DHCA脑损伤的机制复杂，本研究观察了DHCA下间断灌注充氧脑保护液对大脑皮层组织一氧化氮合酶的影响，现报道如下。
1 材料、方法与结果
1.1 实验动物及分组 健康杂种犬10条，随机分成两组，A组单纯DHCA；B组DHCA后，经双侧颈动脉间断灌注脑保护液。
1.2 实验模型 犬静脉注射2.5%硫喷妥钠30mg/kg，安定5mg/kg进行麻醉后，气管内插管，机械通气。右侧第4肋间进胸，升主动脉及右心房插管建立CPB。降温至鼻咽温18℃时DHCA，A组于此条件DHCA 120min。B组DHCA后，经预先放置插管的双侧颈动脉灌注4℃的充氧脑保护液。脑保护液的主要成份为葡萄糖25g，氯化钠4.5g，甘露醇12.5g，碳酸氢钠22mmol，利多卡因200mg，硝酸甘油0.5mg，加注射用水至100ml。在室温下用3L/min的氧流量对上述液体预吹30min。其pH值为7.67，二氧化碳分压13mmHg，氧分压760mmHg，渗透压332毫渗量。灌注压为60～100mmHg，灌注量为25ml/kg,以后每隔30min灌注1次，灌注量为12.5ml/kg。DHCA 120min后恢复循环并复温。45min恢复到鼻咽温36℃左右。
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1.3 大脑皮层组织NOS的显示 两组分别于CPB前，DHCA 120min后及恢复循环45min后经颅顶开窗部位迅速取大脑皮层组织置于4℃、4%多聚甲醛溶液中。采用还原型尼克酰胺二磷酸腺甘脱氢酶(NADPH)组织化学法显示大脑皮层组织NOS阳性神经细胞。大脑皮层组织切片厚度40μm，贴于经明胶预处理过的载玻片上，在NADPH 10mg，硝基四氮唑蓝(NBT)3mg，30%Triton x-100 100μl，加0.1mol/L PBS至10ml的溶液中，37℃下孵育120min，常规脱水，透明，封片，Olympus显微镜下观察、分析。
1.4 统计学处理 各组数据均用
±s表示，组内比较用自身t检验，组间比较用配对t检验。1.5 结果 两组动物CPB前大脑皮层组织NOS阳性神经细胞数较少，分布散在。DHCA 120min后，A组大脑皮层组织NOS阳性神经细胞数明显多于CPB前(P<0.05)，恢复循环45min后，其数量进一步增多，明显多于DHCA 120min后(P<0.01)。B组DHCA 120 min及恢复循环45min后，NOS阳性神经细胞数均无明显增多(P>0.05)。见附表。
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附表 两组动物不同时相大脑皮层组织NOS阳性
神经细胞数(个/低倍视野，×25倍)
A组
B组
CPB前
3.4±0.6
3.2±0.8
DHCA后
7.8±1.3*
5.4±0.6
复灌45min后
12.4±1.7**
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5.4±1.1
*与CPB前比，P<0.05；**与DHCA120min比，P<0.01
2 讨论
NO是一种自由基气体，其半衰期极短，难以直接检测，通常利用NO的化学性质，测定其终末代谢产物亚硝酸盐的含量或测定NOS的活性间接反映组织细胞内NO的含量。本实验采用NADPH染色法测定大脑皮层组织NOS的活性来间接反应其NO的含量。实验结果表明，正常情况下犬大脑皮层组织NOS阳性细胞散在分布，数目较少，与文献[1]报告的结果一致。A组DHCA 120min后，大脑皮层组织NOS阳性细胞数明显增加，恢复循环45min后，其数量进一步增多，明显多于DHCA 120min后，B组DHCA 120min及恢复循环45min后，大脑皮层组织NOS阳性细胞数仅轻度增加，无统计学意义。Segawa等用犬作实验时发现，DHCA 90min再灌注120min后，脑组织NO水平的升高不仅发生在停循环期间，而且发生在再灌注期间。再灌注120min后，NO的水平较体外循环前明显升高。应用NOS抑制剂，能明显减轻DHCA后脑组织的再灌注损伤，促进体觉诱发电位(SEP)的恢复[2]。我们推测，单纯DHCA组NOS活性增加的原因可能是：(1)脑组织内谷氨酸等兴奋性氨基酸增多，它们作用于细胞膜上的NMDA受体，引起钙离子细胞内流，细胞内钙离子达到一定浓度时便激活了NOS[3]；(2)NOS磷酸化时，其活性下降。单纯DHCA时，脑组织内ATP减少，NOS去磷酸化，因此，NOS的活性增加[1]。DHCA间断灌注充氧脑保护液时，脑保护液中氧气部分满足了低温状态下脑组织的代谢需要，提高了大脑皮层组织ATP的含量，冲走了各种代谢产物，从而使NOS的活性升高不明显。
, http://www.100md.com
DHCA间断灌注充氧脑保护液能够抑制大脑皮层组织NOS的活性，减少大脑皮层组织NO的过量合成。
参考文献
[1] Faraci FM,Brain JE.Nitric Oxide and cerebral ciculation.Stroke,1994，25∶692
[2] Segawa D,Hatori N,Yoshizu H,et al.The effect of nitric oxide synthase inhibitor on reperfusion injury of the brain under hypothermic circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115∶925
[3] Bredt DS,Glatt CE,Hwang PM,et al.Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in neuronal populations of the mamalian CNS together with NADPH diaphorase.Neuron,1991,7∶615
[4] Bred1 DS,Ferris CD,Snyder SH.Nitric oxide synthase regulatory siles∶phosphorylation bycyclic AMP dependent protein kinase,protein kinase C,and calcium/calmoudlin binding sites.J Biol Chem,1992,267∶10976
(1999年12月9日收稿), http://www.100md.com