脑缺血与神经细胞凋亡
刘红梅 佟振清
摘 要：近年研究发现脑缺血后迟发性神经元死亡(DND)受IEGs、bcl-2、ICE、p53等多种基因调控，蛋白合成抑制剂与谷氨酸受体拮抗剂均对脑缺血损伤有保护作用，提示神经兴奋毒性作用与凋亡机制共同参与了脑缺血后神经元的死亡，从而为人类脑缺血的治疗提供了新的途径。
关键词：脑缺血 细胞调亡 坏死 基因
1 细胞凋亡与坏死的关系
细胞凋亡一词由Kerr等[1]于1972年提出，用于描述细胞遵循自身规律的主动死亡过程，以区别于细胞坏死。虽然凋亡与坏死是细胞的两种不同死亡方式，但在目前仍然缺乏区分这两者的严格标准(必要且充分)。因为凋亡与坏死不是毫无关联的，它们之间交错存在：(1)无论是哪一种死亡形式，最终都伴有能量不足，线粒体功能衰竭，大分子物质的降解以及自由基的生成；(2)两者在发生机制上有时也不能严格区分，某些导致膜严重破坏和坏死的诱因，在某种程度上对凋亡也具有潜在的激发作用，尤其当损伤不是很激烈的时候，容许细胞有足够的时间停留在某些阶段，进而才决定发生哪一种死亡方式。凋亡的发生不仅取决于损伤的严重程度，还依赖于其它因素，如胞内游离Ca2+的浓度、生长因子的缺乏、细胞分化程度等；(3)凋亡发生后，也可能因为再受到其它损伤因素而最终以坏死结局。
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证实凋亡的发生应从多方面来阐述，既要描述细胞的形态、生化和生理特征，又要借助人为干预手段来阻止细胞死亡。如果通过某些实验可以阻止细胞按其自身基因调控本应发生的死亡，将是证明凋亡的一个有力证据。目前蛋白合成抑制剂(如放线菌酮，cycloheximide)被广泛用于抗凋亡研究。但它也有一定局限性：(1)某些凋亡过程并不需要合成新的蛋白质[2]；(2)放线菌酮对神经元的保护作用不一定都与凋亡有关，可能是通过降低脑温或抑制谷氨酸受体的合成，尤其后者在脑缺血损害中可明显减少细胞Ca2+内流，对CA1区锥体神经元的选择性损伤具有保护作用[3]。(3)放线菌酮能减少半胱氨酸的消耗，增加细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的水平[4]；(4)Lobner D等[5]观察到预先给予培养的皮层神经元放线菌酮，可减少本来因氧气/葡萄糖缺乏导致的细胞坏死，虽然其机理不甚明确，可能与凋亡无关。
2 脑缺血后迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death，DND)
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过去一直认为脑缺血后神经元死亡主要是坏死机制参与。近些年由于对细胞凋亡机制的发现与研究，越来越多的实验证明神经系统的疾病，如癫痫、帕金森氏病、老年痴呆症、脑缺血等，与细胞凋亡之间存在着密切关系。神经细胞凋亡的形态、生理、生化方面的特征与其它细胞凋亡基本一致。由于传统观点的存在以及凋亡与坏死的联系，目前对脑缺血后DND的形式尚有争议。
脑缺血再灌流损伤导致DND，如海马CA1区锥体细胞能存活于急性脑缺血损伤阶段，但在其后的48~72 h死亡。过去，缺氧性脑缺血导致神经元死亡一直被认为是坏死，由于神经兴奋性作用，引起神经元谷氨酸受体活性改变，膜通透性增加，大量Na+、Ca2+通过谷氨酸受体内流，继发引起Cl-和水的内流，从而导致细胞及突起的快速膨胀[6]。近来这一理论在培养的神经元上又得到进一步证实。Dessi等[7]利用体外培养的小脑颗粒细胞，作用于兴奋性谷氨酸，发现其死亡过程缺乏凋亡所应具备的描述学和干预方面的证据。 Didier等[8]也发现神经兴奋毒性导致培养的小脑颗粒细胞DNA损伤，无论是轻度损伤致单链DNA断裂，还是重度损伤致双链DNA断裂，都缺乏只在对照组能观察到由其它因素所致的细胞凋亡产生的核小体间断裂的DNA片段。提示神经兴奋毒性作用能导致神经元坏死。
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将DND与细胞凋亡相结合研究却是近几年才开始，并发现两者紧密相关。大鼠全脑缺血后，海马区可检测到断裂的DNA片段， 而且蛋白合成抑制剂能明显减少CA1区神经元的死亡数量，提示全脑缺血后神经元发生细胞凋亡，并观察到神经元类似于凋亡样的形态学变化，胞浆皱缩，核固缩，染色质向核膜方向凝聚，膜结构完整，凋亡小体形成。利用琼脂糖凝胶电泳、TUNEL、电镜超微结构术都证实CA1区选择性DND属于细胞凋亡。而且发现放线菌酮能明显减少脑梗塞面积，与NMDA受体拮抗剂dextrorphan混合使用后，效果更加明显，也提示抑制蛋白质的合成有助于减轻神经元损伤[9]。
如何解释坏死与凋亡机制在DND中所扮演的角色。有学者认为缺氧性损伤的轻、重、缓、急对神经元将选择哪一种死亡方式有重要意义。损伤程度重，进程快，则神经兴奋毒性作用占优势，发生细胞坏死；损伤较轻微，进程相对缓慢，使受损后神经元有回旋的余地，从而激活内部死亡程序，发生细胞凋亡。Bonfoco等[10]证实快激发的神经兴奋毒性明确引起细胞坏死。在慢激发的神经兴奋毒性实验中，可一过性检测到核小体间断裂的DNA片段，提示较低水平的兴奋性损伤可能引发不完全凋亡。最近有报道在体内全身性给予或皮层内注射红藻氨酸后，远离注射区神经元有凋亡样变化，很可能就是红藻氨酸导致的癫痫的继发性作用，后期营养因子和/或神经递质的缺乏也会导致细胞凋亡。当体外培养的皮层细胞缺少氧气或葡萄糖后，神经元发生兴奋毒性所致的坏死。但是预先给予NMDA或AMPA/kainate受体拮抗剂后，神经元则发生凋亡，出现核小体间断裂的DNA片段，并且细胞对放线菌酮、神经营养因子、ZVAD-FMK等敏感[11]。选用体外只培养了3~5 d 未成年动物的皮层细胞，由于其谷氨酸受体的表达及敏感性均有限，暴露于神经兴奋毒剂后则发生细胞凋亡，甚至对蛋白合成抑制剂敏感[12]。这些研究提示多种因素对DND的发生起作用，如损伤的因素、程度、性质、机体或细胞本身的种类、状况等，最终以神经兴奋毒性作用占优势，则发生细胞坏死，否则将发生凋亡。
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3 脑缺血后的基因表达
脑缺血后神经元发生细胞凋亡的最有力的证据是关于其分子机制的研究，国际上有学者已证实多种基因产物的主动表达与脑缺血后DND之间存在密切关系，它们在DND的发生过程中各自发挥重要作用，或对DND起保护作用，或起促进作用。在这里我们着重介绍目前倍受关注的几种基因。
早期快速反应基因(immediate-early genes，IEGs)编码的转录因子在细胞外信号传递中扮演着重要角色，其中又以c-fos、c-jun最为重要。正常神经组织中IEGs表达产物水平很低，当各种类型的细胞外刺激通过受体通道传来后，IEGs则快速表达。大鼠局灶性脑缺血后，可观察到同侧海马区出现c-fos 、c-jun短暂且快速的表达，对缺血耐受好的齿状回和CA3区明显，而对缺血敏感的CA1区最少。Takemoto等[13]也证实全脑缺血可诱导沙土鼠CA3、CA4区锥体细胞c-fos和c-jun的表达，c-fos于再灌流后1~6 h表达增加，c-jun延迟到再灌流后4～48 h。这些实验均提示IEGs与脑缺血后海马DND有密切关系，可能是机体对缺血的一种内在保护反应。但沙土鼠IEGs表达较大鼠持久，可能与缺血程度及动物种属特异性的差异有关。
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bcl-2是原癌基因的一种，Garcia等发现其蛋白质的增加表达能防止神经营养因子缺乏导致的神经元死亡。大鼠全脑缺血后，Chen等[14]利用Northern blot、原位杂交、免疫组化及Western blot技术证实bcl-2和bcl-x-long的mRNA在CA1、CA3、齿状回的分子层都有表达，但是它们相应的蛋白质却只在损伤很轻的CA3和齿状回有表达，提示bcl-2和bcl-x-long蛋白对神经元的缺血损伤起保护作用。而与bcl-2同属一个基因家族的Bax作用却与bcl-2截然不同，Bax蛋白在神经元死亡最严重的CA1区有表达，在对缺血损伤的非敏感区CA3表达很少，说明Bax可能对脑缺血后DND起促进作用[15]。
ICE是与决定线虫发生凋亡的ced-3基因有同源性的人源基因，它表达的蛋白是一种蛋白裂解酶，即IL-1β转化酶(interleukin-1β-converting enzyme)。ICE基因的过度表达可诱导细胞凋亡。如果预先给予ICE拮抗剂，则可以防止神经生长因子缺乏导致的大鼠颈上神经节的交感神经元的凋亡。Michael Moskowitz实验室利用ICE功能缺陷小鼠或给予ICE抑制剂ZVAD-FMK，均能减少局部脑缺血后的脑梗塞面积。
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p53是一种抑癌基因，它有两种类型：野生型p53(wt-p53)与突变型p53(mt-p53)，wt-p53促进细胞凋亡，mt-p53促进细胞增殖。wt-p53在正常细胞生长过程中作为一种“分子警察”，监视细胞内DNA状态，若DNA受损，p53蛋白水平就增高，以终止增殖，使细胞获得修复DNA的时间；如果DNA受损无法修复，则p53蛋白持续升高，引起细胞凋亡。近几年发现p53与神经元受损后的死亡也紧密相关。含两个wt-p53基因的纯合子C57小鼠较无p53基因的转基因小鼠脑损伤明显严重，梗塞范围也大[16] 。Xiang等[17]采用体外培养的海马和皮层神经元，它们来源于p53基因含量不同的小鼠(p53-/-、p53+/-、p53+/+)，分别暴露于谷氨酸或红藻氨酸，虽然任何基因型的小鼠神经元胞浆Ca2+ 浓度都增高，但是p53-/-基因型小鼠的细胞却在形态学上几乎无损害，而含有p53基因的另两种类型细胞发生了严重死亡。应用腺病毒转导，使p53-/-型神经元恢复p53的表达，则这些神经元也出现大量死亡。表明p53基因直接影响到中枢神经系统神经元的生存力[17,18]，神经兴奋毒剂诱导胞浆Ca2+浓度升高，但如无附加的信号存在，如p53，仍不足以引起神经元死亡。
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4 脑缺血后细胞凋亡研究面临的问题
对脑缺血后神经元死亡机制的研究仍有许多问题尚待解决：(1)脑缺血也导致神经元膜上的谷氨酸受体活性增高，Ca2+大量内流，实验证明谷氨酸受体拮抗剂或抗凋亡都对脑缺血损伤具有保护作用，揭示坏死与凋亡机制共同存在，那么它们之间存在着如何联系，是如何调节的； (2)与神经细胞凋亡相关的基因有数十种，未被发现的可能更多，限于条件，只能同时对其中的几种加以研究，所以仍不明确它们之间的调控关系，以及到底是哪些基因对凋亡起主要调控作用；(3)实验条件不同，某些基因产物可能发挥不同作用，如Crumrine等[16]发现含一个wt-p53基因的杂合子转基因C57小鼠脑梗塞面积较无p53基因的纯合子转基因C57小鼠明显减少，这同Clarke等[19]提出的wt-p53基因含量与细胞凋亡成量效关系的理论不一致，说明对某一凋亡相关基因的作用需综合地加以研究。
5 脑缺血后发生细胞凋亡在治疗学上的意义
, 百拇医药
抗凋亡结合其它手段的联合治疗将成为脑缺血治疗的主要内容；另外细胞凋亡的发生需要一定的时间，为治疗创造了机会。在大鼠上，已证实联合给予放线菌酮和NMDA受体拮抗剂对局部脑缺血的保护作用，将比单用其中任何一种的效果都明显[11]。神经营养因子的及时补充对减轻神经元损伤也有不可忽视的作用。神经兴奋毒性损伤一般发生很早，因而谷氨酸受体拮抗剂需要早期使用，而脑缺血后神经元的凋亡发生呈延迟方式，则为疾病的治疗提供了更多的机会。但是抗凋亡治疗也会使一些已开始发生凋亡的不正常细胞保留下来，并阻断了吞噬细胞的清除作用，可能对机体有害。
作者简介：刘红梅，女，1971年出生,1998年7月毕业于第一军医大学,硕士,医师,助教,电话:85142100
作者单位：第一军医大学1南方医院超声诊断科，广州，510515；2生理学教研室，广州，510515
参考文献
, 百拇医药
1 Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basic biologi-cal phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer,1972,26(4):239
2 Chow SC, Peter I, Orrhenius S. Reevaluation of the role of de novo protein synthesis in rat thymocyte apoptosis. Exp Cell Res, 1995,216(1):149
3 Pellegrini-Giampietro DE, Zukin RS, Bennett MV et al. Switch in glutamate receptor subunit gene expression in CA1 subfield of hippocampus following global ischemia in rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89(21):10499
, 百拇医药
4 Ratan RR, Murphy TH, Baraban JM. Macromolecular synthesis inhibitors prevent oxidative stress-induced apoptosis in embryonic cortical neurons by shunting cysteine from protein synthesis to glutathione. J Neurosci, 1994,14(7):4385
5 Lobner D, Choi DW. Preincubation with protein synthesis inhibitors protects cortical neurons against oxygen-glucose deprivation-induced death. Neuroscience, 1996, 72(2):335
6 Choi DW. Excitotoxic cell death. J Neurobiol, 1992, 23(9): 1261
, 百拇医药
7 Dessi F, Charriaut-Marlangue C, Khrestchatisky M et al. Glutamate-induced neuronal death is not a programmed cell death in cerebellar culture. J Neurochem, 1993, 60(5): 1953
8 Didier M, Bursztain S, Adamec E et al. DNA strand breaks induced by sustained glutamate excitotoxicity in primary neuronal cultures. J Neurosci, 1996,16(7):2238
9 Du C, Hu R, Csernansky CA et al. Additive neuroprotective effects of dextrorphan and cycloheximide in rats subjected to transient focal cerebral ischemia. Brain Res, 1996, 718 (2):233
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10 Bonfoco E, Krainc D, Ankarcrona M et al. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/super-oxide in cortical cell cultures. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(16):7162
11 Gwag BJ, Lobner D, Koh JY et al. Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro. Neuroscience, 1995, 68 (3):615
, 百拇医药 12 Finiels F, Robert JJ, Samolyk ML et al. Induction of neuronal apoptosis by excitotoxins associated with acetate-responsive element-binding activity. J Neurochem, 1995,65 (3):1027
13 Takemoto O,Tomimoto H,Yanagihara T. Induction of c-fos and c-jun gene products and heat shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils. Stroke, 1995, 26 (9):1639
14 Chen J, Graham SH, Nakayama M et al. Apoptosis receptor genes bcl-2 and bcl-x-long are expressed in the rat brain following global ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1997, 17(1):2
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15 Chen J, Zhu RL, Nakayama M et al. Expression of the apoptosis-effector gene, bax, is up regulated in vulnerable hippocampal CA1 neurons following global ischemia. J Neurochem, 1996,67(1):64
16 Crumrine RC, Thomas AL, Morgan PF. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemia damage in transgenic mice.J Cereb Blood Flow Metab, 1994,14(6):887
17 Xiang H, Hochman DW, Saya H et al. Evidence for p53-mediated modulation of neuronal viability. J Neurosci, 1996,16(21):6753
18 Morrison RS, Wenzel HJ, Kinoshita Y et al. Loss of the p53 tumor suppressor gene protects neurons from kainate-induced cell death. J Neurosci, 1996,16(4):1337
19 Clarke AR, Purdie CA, Harrison DJ et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nature, 1993, 362 (6423):849, 百拇医药
摘 要：近年研究发现脑缺血后迟发性神经元死亡(DND)受IEGs、bcl-2、ICE、p53等多种基因调控，蛋白合成抑制剂与谷氨酸受体拮抗剂均对脑缺血损伤有保护作用，提示神经兴奋毒性作用与凋亡机制共同参与了脑缺血后神经元的死亡，从而为人类脑缺血的治疗提供了新的途径。
关键词：脑缺血 细胞调亡 坏死 基因
1 细胞凋亡与坏死的关系
细胞凋亡一词由Kerr等[1]于1972年提出，用于描述细胞遵循自身规律的主动死亡过程，以区别于细胞坏死。虽然凋亡与坏死是细胞的两种不同死亡方式，但在目前仍然缺乏区分这两者的严格标准(必要且充分)。因为凋亡与坏死不是毫无关联的，它们之间交错存在：(1)无论是哪一种死亡形式，最终都伴有能量不足，线粒体功能衰竭，大分子物质的降解以及自由基的生成；(2)两者在发生机制上有时也不能严格区分，某些导致膜严重破坏和坏死的诱因，在某种程度上对凋亡也具有潜在的激发作用，尤其当损伤不是很激烈的时候，容许细胞有足够的时间停留在某些阶段，进而才决定发生哪一种死亡方式。凋亡的发生不仅取决于损伤的严重程度，还依赖于其它因素，如胞内游离Ca2+的浓度、生长因子的缺乏、细胞分化程度等；(3)凋亡发生后，也可能因为再受到其它损伤因素而最终以坏死结局。
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证实凋亡的发生应从多方面来阐述，既要描述细胞的形态、生化和生理特征，又要借助人为干预手段来阻止细胞死亡。如果通过某些实验可以阻止细胞按其自身基因调控本应发生的死亡，将是证明凋亡的一个有力证据。目前蛋白合成抑制剂(如放线菌酮，cycloheximide)被广泛用于抗凋亡研究。但它也有一定局限性：(1)某些凋亡过程并不需要合成新的蛋白质[2]；(2)放线菌酮对神经元的保护作用不一定都与凋亡有关，可能是通过降低脑温或抑制谷氨酸受体的合成，尤其后者在脑缺血损害中可明显减少细胞Ca2+内流，对CA1区锥体神经元的选择性损伤具有保护作用[3]。(3)放线菌酮能减少半胱氨酸的消耗，增加细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的水平[4]；(4)Lobner D等[5]观察到预先给予培养的皮层神经元放线菌酮，可减少本来因氧气/葡萄糖缺乏导致的细胞坏死，虽然其机理不甚明确，可能与凋亡无关。
2 脑缺血后迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death，DND)
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过去一直认为脑缺血后神经元死亡主要是坏死机制参与。近些年由于对细胞凋亡机制的发现与研究，越来越多的实验证明神经系统的疾病，如癫痫、帕金森氏病、老年痴呆症、脑缺血等，与细胞凋亡之间存在着密切关系。神经细胞凋亡的形态、生理、生化方面的特征与其它细胞凋亡基本一致。由于传统观点的存在以及凋亡与坏死的联系，目前对脑缺血后DND的形式尚有争议。
脑缺血再灌流损伤导致DND，如海马CA1区锥体细胞能存活于急性脑缺血损伤阶段，但在其后的48~72 h死亡。过去，缺氧性脑缺血导致神经元死亡一直被认为是坏死，由于神经兴奋性作用，引起神经元谷氨酸受体活性改变，膜通透性增加，大量Na+、Ca2+通过谷氨酸受体内流，继发引起Cl-和水的内流，从而导致细胞及突起的快速膨胀[6]。近来这一理论在培养的神经元上又得到进一步证实。Dessi等[7]利用体外培养的小脑颗粒细胞，作用于兴奋性谷氨酸，发现其死亡过程缺乏凋亡所应具备的描述学和干预方面的证据。 Didier等[8]也发现神经兴奋毒性导致培养的小脑颗粒细胞DNA损伤，无论是轻度损伤致单链DNA断裂，还是重度损伤致双链DNA断裂，都缺乏只在对照组能观察到由其它因素所致的细胞凋亡产生的核小体间断裂的DNA片段。提示神经兴奋毒性作用能导致神经元坏死。
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将DND与细胞凋亡相结合研究却是近几年才开始，并发现两者紧密相关。大鼠全脑缺血后，海马区可检测到断裂的DNA片段， 而且蛋白合成抑制剂能明显减少CA1区神经元的死亡数量，提示全脑缺血后神经元发生细胞凋亡，并观察到神经元类似于凋亡样的形态学变化，胞浆皱缩，核固缩，染色质向核膜方向凝聚，膜结构完整，凋亡小体形成。利用琼脂糖凝胶电泳、TUNEL、电镜超微结构术都证实CA1区选择性DND属于细胞凋亡。而且发现放线菌酮能明显减少脑梗塞面积，与NMDA受体拮抗剂dextrorphan混合使用后，效果更加明显，也提示抑制蛋白质的合成有助于减轻神经元损伤[9]。
如何解释坏死与凋亡机制在DND中所扮演的角色。有学者认为缺氧性损伤的轻、重、缓、急对神经元将选择哪一种死亡方式有重要意义。损伤程度重，进程快，则神经兴奋毒性作用占优势，发生细胞坏死；损伤较轻微，进程相对缓慢，使受损后神经元有回旋的余地，从而激活内部死亡程序，发生细胞凋亡。Bonfoco等[10]证实快激发的神经兴奋毒性明确引起细胞坏死。在慢激发的神经兴奋毒性实验中，可一过性检测到核小体间断裂的DNA片段，提示较低水平的兴奋性损伤可能引发不完全凋亡。最近有报道在体内全身性给予或皮层内注射红藻氨酸后，远离注射区神经元有凋亡样变化，很可能就是红藻氨酸导致的癫痫的继发性作用，后期营养因子和/或神经递质的缺乏也会导致细胞凋亡。当体外培养的皮层细胞缺少氧气或葡萄糖后，神经元发生兴奋毒性所致的坏死。但是预先给予NMDA或AMPA/kainate受体拮抗剂后，神经元则发生凋亡，出现核小体间断裂的DNA片段，并且细胞对放线菌酮、神经营养因子、ZVAD-FMK等敏感[11]。选用体外只培养了3~5 d 未成年动物的皮层细胞，由于其谷氨酸受体的表达及敏感性均有限，暴露于神经兴奋毒剂后则发生细胞凋亡，甚至对蛋白合成抑制剂敏感[12]。这些研究提示多种因素对DND的发生起作用，如损伤的因素、程度、性质、机体或细胞本身的种类、状况等，最终以神经兴奋毒性作用占优势，则发生细胞坏死，否则将发生凋亡。
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3 脑缺血后的基因表达
脑缺血后神经元发生细胞凋亡的最有力的证据是关于其分子机制的研究，国际上有学者已证实多种基因产物的主动表达与脑缺血后DND之间存在密切关系，它们在DND的发生过程中各自发挥重要作用，或对DND起保护作用，或起促进作用。在这里我们着重介绍目前倍受关注的几种基因。
早期快速反应基因(immediate-early genes，IEGs)编码的转录因子在细胞外信号传递中扮演着重要角色，其中又以c-fos、c-jun最为重要。正常神经组织中IEGs表达产物水平很低，当各种类型的细胞外刺激通过受体通道传来后，IEGs则快速表达。大鼠局灶性脑缺血后，可观察到同侧海马区出现c-fos 、c-jun短暂且快速的表达，对缺血耐受好的齿状回和CA3区明显，而对缺血敏感的CA1区最少。Takemoto等[13]也证实全脑缺血可诱导沙土鼠CA3、CA4区锥体细胞c-fos和c-jun的表达，c-fos于再灌流后1~6 h表达增加，c-jun延迟到再灌流后4～48 h。这些实验均提示IEGs与脑缺血后海马DND有密切关系，可能是机体对缺血的一种内在保护反应。但沙土鼠IEGs表达较大鼠持久，可能与缺血程度及动物种属特异性的差异有关。
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bcl-2是原癌基因的一种，Garcia等发现其蛋白质的增加表达能防止神经营养因子缺乏导致的神经元死亡。大鼠全脑缺血后，Chen等[14]利用Northern blot、原位杂交、免疫组化及Western blot技术证实bcl-2和bcl-x-long的mRNA在CA1、CA3、齿状回的分子层都有表达，但是它们相应的蛋白质却只在损伤很轻的CA3和齿状回有表达，提示bcl-2和bcl-x-long蛋白对神经元的缺血损伤起保护作用。而与bcl-2同属一个基因家族的Bax作用却与bcl-2截然不同，Bax蛋白在神经元死亡最严重的CA1区有表达，在对缺血损伤的非敏感区CA3表达很少，说明Bax可能对脑缺血后DND起促进作用[15]。
ICE是与决定线虫发生凋亡的ced-3基因有同源性的人源基因，它表达的蛋白是一种蛋白裂解酶，即IL-1β转化酶(interleukin-1β-converting enzyme)。ICE基因的过度表达可诱导细胞凋亡。如果预先给予ICE拮抗剂，则可以防止神经生长因子缺乏导致的大鼠颈上神经节的交感神经元的凋亡。Michael Moskowitz实验室利用ICE功能缺陷小鼠或给予ICE抑制剂ZVAD-FMK，均能减少局部脑缺血后的脑梗塞面积。
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p53是一种抑癌基因，它有两种类型：野生型p53(wt-p53)与突变型p53(mt-p53)，wt-p53促进细胞凋亡，mt-p53促进细胞增殖。wt-p53在正常细胞生长过程中作为一种“分子警察”，监视细胞内DNA状态，若DNA受损，p53蛋白水平就增高，以终止增殖，使细胞获得修复DNA的时间；如果DNA受损无法修复，则p53蛋白持续升高，引起细胞凋亡。近几年发现p53与神经元受损后的死亡也紧密相关。含两个wt-p53基因的纯合子C57小鼠较无p53基因的转基因小鼠脑损伤明显严重，梗塞范围也大[16] 。Xiang等[17]采用体外培养的海马和皮层神经元，它们来源于p53基因含量不同的小鼠(p53-/-、p53+/-、p53+/+)，分别暴露于谷氨酸或红藻氨酸，虽然任何基因型的小鼠神经元胞浆Ca2+ 浓度都增高，但是p53-/-基因型小鼠的细胞却在形态学上几乎无损害，而含有p53基因的另两种类型细胞发生了严重死亡。应用腺病毒转导，使p53-/-型神经元恢复p53的表达，则这些神经元也出现大量死亡。表明p53基因直接影响到中枢神经系统神经元的生存力[17,18]，神经兴奋毒剂诱导胞浆Ca2+浓度升高，但如无附加的信号存在，如p53，仍不足以引起神经元死亡。
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4 脑缺血后细胞凋亡研究面临的问题
对脑缺血后神经元死亡机制的研究仍有许多问题尚待解决：(1)脑缺血也导致神经元膜上的谷氨酸受体活性增高，Ca2+大量内流，实验证明谷氨酸受体拮抗剂或抗凋亡都对脑缺血损伤具有保护作用，揭示坏死与凋亡机制共同存在，那么它们之间存在着如何联系，是如何调节的； (2)与神经细胞凋亡相关的基因有数十种，未被发现的可能更多，限于条件，只能同时对其中的几种加以研究，所以仍不明确它们之间的调控关系，以及到底是哪些基因对凋亡起主要调控作用；(3)实验条件不同，某些基因产物可能发挥不同作用，如Crumrine等[16]发现含一个wt-p53基因的杂合子转基因C57小鼠脑梗塞面积较无p53基因的纯合子转基因C57小鼠明显减少，这同Clarke等[19]提出的wt-p53基因含量与细胞凋亡成量效关系的理论不一致，说明对某一凋亡相关基因的作用需综合地加以研究。
5 脑缺血后发生细胞凋亡在治疗学上的意义
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抗凋亡结合其它手段的联合治疗将成为脑缺血治疗的主要内容；另外细胞凋亡的发生需要一定的时间，为治疗创造了机会。在大鼠上，已证实联合给予放线菌酮和NMDA受体拮抗剂对局部脑缺血的保护作用，将比单用其中任何一种的效果都明显[11]。神经营养因子的及时补充对减轻神经元损伤也有不可忽视的作用。神经兴奋毒性损伤一般发生很早，因而谷氨酸受体拮抗剂需要早期使用，而脑缺血后神经元的凋亡发生呈延迟方式，则为疾病的治疗提供了更多的机会。但是抗凋亡治疗也会使一些已开始发生凋亡的不正常细胞保留下来，并阻断了吞噬细胞的清除作用，可能对机体有害。
作者简介：刘红梅，女，1971年出生,1998年7月毕业于第一军医大学,硕士,医师,助教,电话:85142100
作者单位：第一军医大学1南方医院超声诊断科，广州，510515；2生理学教研室，广州，510515
参考文献
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1 Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basic biologi-cal phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer,1972,26(4):239
2 Chow SC, Peter I, Orrhenius S. Reevaluation of the role of de novo protein synthesis in rat thymocyte apoptosis. Exp Cell Res, 1995,216(1):149
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